专利名称：用于乙酰氨基苯测定的干法分析元件的制作方法
这是1992年7月15日公开的序号为914915的申请的部分延伸。
本发明涉及用于检测在水流体中的乙酰氨基苯的使用干法分析元件的分光光度测定。
乙酰氨基苯是一种广泛使用的止痛药。它无需处方就可以买到并且在阿斯匹林对病人可能有问题时经常使用。在治疗量，血清浓度通常低于50mg/L。如果摄食药物4小时后血清浓度大于300mg/L，通常观察到毒性。过量的一个作用是肝毒性。因此显然需要一种精确检测血清中乙酰氨基苯浓度的方法。
测定酰苯胺类诸如乙酰氨基苯的己知方法使用芳基酰胺酶(E.C.3.5.1.13)和一种氧化剂。芳基酰胺酶使酰基苯胺的酰胺键断开，生成乙酸盐和苯酚诸如对胺基苯酚。然后使苯胺与成色化合物象苯酚在氧化剂诸如高锰酸盐或铜或铁的金属盐存在下形成有色化合物象可在615nm处被检测的靛酚。其它方法使用象高碘酸或过硫酸盐类的氧化剂。美国专利4,999,288和4,430,433是典型的。
这三种方法的一个缺点是大多数金属盐氧化苯胺非常缓慢，除非它们在碱性PH这种使芳基酰胺酶失活的条件下。
美国专利4675290(1987年6月23日公布，Matsumoto)公开了一种测定肽酶酶活性的方法，它包括用含有肽酶的样品处理合成的二溴化酰胺(作为底物)从而放出二溴化苯胺；用氧化酶(例如抗坏血酸盐氧化酶)对该放出的二溴化苯胺氧化，消耗氧并通过所述苯胺在分子式确定的成色剂存在下形成色素。该反应在溶液中进行。
Matsumoto的方法使用酶并因此可以克服与先有技术无机氧化剂冲突的问题。然而，Matsumoto采用合成的二溴化的底物并因此不能直接测试乙酰氨基苯。就用于形成有色苯酚的氧化成色剂而言，当在成色反应中使用这种卤化苯酚类时，可以提高给色量是本技术中显而易见的。然而，当乙酰氨基苯出现在待测生物流体中时，它不是卤化的并因此是与在Matsumoto的方法中使用的二溴化合成的底物化学区分的。
另外，Matsumoto公开了一种溶液测定法。可采用的更方便的测定法涉及＂干＂化学——一个术语，指进行时使用含有不同＂指触干燥＂测试元件诸如＂浸渍和读取＂测试条、多层测试元件和类似无件的化学试剂的方法和技术。＂干＂法为了重建或分析除了测试样品之外无需液体。
在溶液测定中采用的试剂当适应干法模式时经常做不好。干法元件使用微量试剂和测试样品，因此在用于乙酰氨基苯测定的干法元件中，重要的是采用当苯胺被氧化连接到成色剂上而形成颜色时给出清晰和准确的彩色信号的试剂。
选为可能成色剂的化合物其范围是很宽的。Matsumoto对于那些会在干式化学现象和过程中表现出色的成色氧化成色剂既没有建议也没有提供引导。
希望有一种干法试验用于测定在含有酶和其它试剂——当在干法模式中被结合和被覆盖时保持活性并与适宜的成色剂氧化偶合上给出清晰和准确的彩色信号——的生物流体中的乙酰氨基苯。
本发明是为在干法模式使用一种提供可检测的颜色变化和精确测定乙酰氨基苯的成色剂而进行选择。它公开了需用水溶性成色剂以及水不溶性成色剂即使适宜地分散效果也不佳。
本发明的元件避开了先有技术指出的无机氧化剂而使用轻度氧化剂诸如酶或氰铁酸盐代替。在干法分析元件里，已知氧化剂象Cu2+和大多数Fe3+盐通过交联并因此硬化凝胶而破坏凝胶基质。使用酶作为氧化剂解决了这个问题。适合的氧化酶包括抗坏血酸氧化酶、乳糖酶和酪氨酸酶。
氰铁酸盐是不如大多数Fe3+盐或其它金属氧化剂(见表A)强的氧化剂。因此出乎意料的是，氰铁酸盐在中性PH不破坏干法元件结构下能够提供快速反应动力学。适合的氰铁酸盐包括碱金属和碱土金属氰铁酸盐像例如钾、钠和钙氰铁酸盐这样的。优选的氰铁酸盐是碱金属氰铁酸盐。
相应地提供一种用于测定水流体中乙酰氨基苯的含有载体的分析元件，在载体上有至少一个试剂层而在所述的试测层上含有(a)一种芳基酰胺酶；(b)一种氧化酶或一种具有使对胺基苯酚氧化连接到成色剂上形成彩色化合物能力的氰铁酸盐。
(c)水溶性、形成颜色的成色剂，具有一般结构
其中R是水溶基团，选自-(CH2)nX，其中n为1-5，X是-SO3M，其中M是氢、碱金属、碱土金属或铵(NH4+)阳离子或X是-N(R7)3+Z-，每个R7是独立选自1-4个碳原子的烷基诸如甲基、乙基、丙基和丁基，而Z是酸性阴离子诸如氯、溴、碘、氟、对甲苯磺酸盐及类似物，或X是(-OCH2CH2)yOH，其中y为2-5；R1和R6共同表示亚乙基、三亚甲基或形成不完全饱和环的四亚甲基基团；R2、R3和R4分别选自氢、有1-4个碳原子的烷基和有1-4个碳原子的烷氧基。
本发明的另一具体表现提供了一种用于测定水流体中乙酰氨基苯的方法，包括步骤a.用上述分析元件接触水成液样品；和b.使形成的有色化合物的量与流体中的乙酰氨基苯浓度相关。
本发明的优点是水溶性成色剂和或者酶催化的氧化偶合或者氰铁酸盐偶合，允许快速反应。我们能在57秒内形成可检测的彩色信号。水不溶性成色剂涉及的反应慢得多。
我们惊奇地发现为了在希望的时间(5分钟)内获得可接受的量的有色产物，必需要联合水溶性成色剂和酶。甚至在溶液测定中，为了在5分钟内获得结果，氧化酶(例如抗坏血酸盐氧化酶)不得不在用缓冲剂稀释之前与水溶性成色剂预先混合。尚且不知道这样做的原因。但另一方面不希望被科学理论局限，申请人认为成色剂的水溶性允许它在分析元件中在贮藏期间(即在合成和使用之间)与酶充分地混合。它表现出成色剂和氧化酶在反应前先接触对于在5分钟内得到满意的彩色反应是必要的。
图1是表示使用1-(3-磺丙基)-1，2，3，4-四氢喹啉(化合物#2，THQSO3H)作为成色剂时本发明分元件性能的图。
图2是表示使用1-(正丁基)-1，2，3，4-四氢喹啉(化合物#1，BTHQ)作为成色剂的对比元件性能的图。
图3是表示使用1，2，3，5，6，7-六氢苯并[ij]喹啉(化合物#4，久洛尼定)作为成色剂的另一个对比元件性能的图。
图4是表示使用1-(3-磺丙基)-1，2，3，4-四氢喹啉(化合物#2，THQSO3H)作为成色剂并使用氰铁酸钾作为氧化剂的本发明分析元件性能的图。
本发明公开了用于测定乙酰氨基苯的比色测定，其基于乙酰氨基苯的酶催化水解并接着检测水解的代谢物。更特别地，测定使用第一种酶芳基酰胺酶(E.C.3.5.1.13)使乙酰氨基苯的酰胺键断开以生成乙酸和对胺基苯酚。第二种酶诸如抗坏血酸氧化酶(E.C.1.10.3.3)、酪氨酸酶(E.C.1.14.18.1)或乳糖酶(E.C.1.10.3.2)氧化对胺基苯酚从而与这里定义的水溶性成色剂偶合形成染料。氰铁酸盐也可以用于氧化对胺基苯酚。染料在670nm处被检测。反应进程如下
在本发明中有用的水溶性成色剂通过从许多不同的具有相似结构的成色剂中筛选和选择而被发现。不溶性的那些不能在测试条件下提供足够的偶合(干法模式)以对宽动态范围的分析物浓度的分析分辨产生足够的吸收率。在此之前描述的那些结构并且其中R1和R6共同表示三亚甲基，即达到不完全饱和六元含氮杂环具有特别希望的吸收最大值(约670nm)，并且在分析元件中特别有用，因为吸收不被干扰物诸如胆红素——在低波长吸收——屏蔽。优选的水溶性品种是1-(3-磺丙基)-1，2，3，4-四氢喹啉。筛选的步骤和其结果在下文中描述。反应结束形成的有色化合物的量表示测试样品中乙酰氨基苯的浓度。
把上述试剂涂在载体上来提供本发明的干分析元件。元件可以形成各种形状，包括任意所需宽度的细长条、薄片、载片或小片。
元件可以在手控的或自动化测定技术中使用。通常，在使用元件中，乙酰氨基苯测定是这样进行的，将元件从供料辊、片料包或其它来源取出，然后，使它与待测试的液体样品(例如最多到200mL)物理接触，这样样品与试剂接着在元件中相互作用变成混合的。这种接触可以用任何适宜的方法完成，例如通过浸渍或浸没元件到样品中，或优选通过用任何适宜的施行方法用手或机器将样品液点滴在元件上。
制样后，元件孵化最多达5分钟以促进颜色的形成。通过孵化它的意思是在进行颜色测定之前使试剂在37℃下保持互相接触最多5分钟时间。在该测定中可以被测试的水液体包括—但不局限于——全血、血浆、血清、淋巴、胆汁、尿、脊髓液、唾液、汗和类似物以及粪便分泌物。还可以测定人或动物组织诸如体壁肌、心脏、肾、肺、脑、骨髓、皮肤和类似物产生的液体。
对于液体测定有用的干法分析元件可以根据US3,992,158和US4,357,363的技术制备，其内容在此全部包括。
简而言之，本发明的分析元件包含涂敷在适宜载体上的一层或多层。所有的试剂可以在涂敷在载体上的单层里。优选如下文表I中所示试剂被覆盖在两个不同的试剂层里。无论包含在相同还是不同的元件层里，所有试剂必须以液体形式相互接触，造成试剂和反应产物可以通过层内部并在邻近层的叠加区域之间。换言之，当元件与水流体接触时，本发明的分析成分的所有试剂接着如本文中在前所述被混合。
载体可以是任意适宜的尺寸稳定的，优选无孔和可穿透的(即射线能透射的)材料，其透过波长在约200和约900nm之间的电磁辐射。透辐射载体特别优选通过使用多种辐射探测法提高并简化出现在这些元件里的可检测变化的测定。为特别元件选择的载体应与指定的检测方法(反射、透射或荧光光谱法)相适应。有用的载体材料包括聚苯乙烯、聚酯(倒如聚对苯二甲酸乙酯)]、聚碳酸酯、纤维素酯(例如乙酸纤维素)等。
在载体上至少涂一层试剂。试剂层包括含有一种或多种分散在一种或多种合成或天然粘合剂材料，诸如明胶或其它天然存在的胶体中的试剂的指示剂组分，以及不同的合成的亲水聚合物诸如聚丙烯酰胺、聚(N-乙烯-2-吡咯烷酮)、聚(丙烯酰胺-共-N-乙烯-2-吡咯烷酮)、上述的共聚物、聚合物或对已加入了可交联单体的共聚物。
试剂层可以含有缓冲剂。有用的缓冲剂包括磷酸盐、焦磷酸盐、三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、2{[三(羟甲基)甲基]氨基}-1-乙磺酸(TES)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(EPPES)、2-羟基-3-{N-[三(羟甲基)甲基]氨基}-丙磺酸(TAPSO)和其它PH在6.5至8.5范围内最好是7.5的缓冲剂。缓冲剂可以在元件的任意层或所有层中，或它可以在无其它试剂的一个分离的层里。
一些表面活性剂诸如Olin-10GTM、TXTM-102、TX-405TM、Zonyl FSNTM，但优选TX-100TM和TX-165TM(TX表面活性剂是Union Carbide出售的辛苯氧基聚乙氧基乙醇非离子表面活性剂类)可以任意地被包含在试剂层里。一些不同的交联剂也是任意的，诸如二乙烯磺酰甲烷、戊二醛等。
元件可以具有多孔的、反射涂布层以均匀地在元件上分布液体试样。涂布层可以含有试剂，但优选它是如下文表I中所示的性质不同的层。用于涂布层中的材料是本技术领域熟知的象，例如在US 4258001和上述引用的专利中公开的制备干化学元件的那样。
有用的涂布层可以如在US 4,292,272(1981年9月29日公布，Kitajima等)描述的用纤维材料或者与适宜的粘合剂混合或者织成织物来制备，如在US 4258001(1981年3月24日公开，Pierce等)、US 4430436(1984年2月7日公开，Koyama等)和日本专利公报57(1982)-101760中描述的用聚合组合物或粒状材料—例如红色聚合物诸如在US 3992158中公开的——用或不用粘合剂作成细粒状来制备。特别有用的涂布层含有硫酸钡或二氧化钛。由于样品通常被直接提供到涂布层上，所以希望涂布层是无向多孔的，意思是由微粒、纤维或聚合的成分之间互相连接区或孔造成的在层里的孔率在每个方向是相同的。典型的涂布层列在表I中。
在一个具体例子中，涂布层含有N-乙基马来酰亚胺——一种发现用于阻挡可存在于测试流体中的干扰物的化合物。通常T.C.Arter等所有的标题为Sulfhydryl Complexing Agents inClinical Test Elements的美国申请公开了这一发明并数据随同编入。
如果希望可以包括其它任意的层例如底层、阻挡辐射层等。元件的层可以含有多种其它需要的但任意的成分，包括表面活性剂、增稠剂、缓冲剂、硬化剂、抑菌剂、抗氧剂、偶合溶剂和其它本领域已知的材料。这些成分的量也属于本领域工人的技能。
在元件中的变化可以用适宜的分光光度仪——通常为反射仪——采用已知方法例如在US 3,992,158第14-15栏、US 4,357,363第27栏公开的进行测定。在酶反应中，产物是通过测量与测试样品接触的本发明元件里限定区域中反射或透射的变化率来测定的。测量的区域通常从约3至约5mm。
本发明典型的元件列在下文表1a和1b中。
表1a使用氧化酶的乙酰氨基苯元件履盖度g/m2*试剂/涂层 有效范围 实际样品硫酸钡 75-120 100纤维素 1-208表面活性剂TX-405TM0.2-4 1.6Estane聚氨基甲酸乙酯弹性纤维 1-1512.3马来酰亚胺 0.1-3.0 1.0底层聚乙烯吡咯烷酮0.5-2.5 1.0试剂层1未硬化的凝胶 4-24 6表面活性剂TX-165TM0.005-0.10.01HEPES缓冲剂 2-10 2.4抗坏血酸氧化酶50,000-300,000 1U/m2175,000 1U/m2芳基酰胺酶1,000-50,000 1U/m25,000 1U/m2试剂层2未硬化的凝胶 4-24 6成色剂THQSO3H0.2-21.0HEPES缓冲剂 2-10 4.8表面活性剂TX-165TM0.005-0.10.01注*g/m2只有抗坏血酸氧化酶和芳基酰胺酶是1U/m2。TX-405TMTX-100TM辛苯氧基聚乙氧烷族TX-165TMUnion Carbide出售的乙醇Triton X-100TMTHQSO3H表1的化合物2，即1-(3-磺基丙基)-1，2，3，4-四氢喹啉EstaneB.F.Goodrich出售的聚酯/聚氨基甲酸乙酯聚合物HEPES4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙基磺酸表1b使用氰铁酸盐的乙酰氨基苯元件履盖度g/m2*试剂/涂层有效范围实际样品硫酸钡75-120100纤维素1-20 8表面活性剂TX-405TM0.2-4 1.6Estane聚氨基甲酸乙酯弹性纤维 1-15 12.3马来酰亚胺0.1-3.0 1.0底层聚乙烯吡咯烷酮0.5-2.5 1.0试剂层1未硬化的凝胶4-246表面活性剂TX-165TM0.005-0.1 0.01HEPES缓冲剂 2-102.4氰铁酸钾0.1-5.0 1.8芳基酰胺酶 1,000-50,000 1U/m25,000 1U/m2试剂层2未硬化的凝胶4-246成色剂THQSO3H 0.2-2 1.0HEPES缓冲剂 2-104.8表面活性剂TX-165TM0.005-0.1 0.01注*g/m2只有芳基酰胺酶是1U/m2。TX-405TMTX-100TM辛苯氧基聚乙氧烷族TX-165TMUnion Carbide出售的乙醇Triton X-100TMTHQSO3H表1的化合物2，即1-(3-磺基丙基)-1，2，3，4-四氢喹啉EstaneB.F.Goodrich出售的聚酯/聚氨基甲酸乙酯聚合物HEPES4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙基磺酸使用下列方法发现在抗坏血酸氧化酶存在下与邻一胺基苯酚偶合在溶液里给出强烈颜色化合物的成色剂。在用于定量测定乙酰氨基苯的干法分析元件里这些成色剂的性能被进一步测试。
3mL的0.1M TRIS缓冲剂在PH 7.5与300μL的含有0.04M成色剂的溶液混合后被测试。在该溶液中加入150μL的抗坏血酸氧化酶(4000U/mL)、150μL的芳基酰胺酶溶液(70U/mL)和150μL的乙酰氨基苯溶液(300mg/L)。5分钟后在37℃下在能观察到λmax波长处测量每种染料的吸收度。设定每种染料溶液的波谱在λ＝300-800nm之间以便测定每种染料的λmax。在5分钟后具有大于0.3的吸收度的成色剂被认为对于在于法分析元件中使用是清意的(0.3值是通过减去成色剂在染料的λmax的波长处的值求得的)。每个代号的成色剂在300mg/L乙酰氨基苯的吸光值列于表II中。下面9种化合物是那些作为可能成色剂所测之中的
表II为乙酰氨基苯测定选择的成色剂成色λmax吸光度
670nm 0.36(乳状液)
670nm 0.65
600nm 0.104.
670nm 0.2
表II-续为乙酰氨基苯测定选择的成色剂成色剂λmax吸光度
500 nm0.23
650 nm0.12
600 nm0.14
550 nm0.06
表II-续为乙酰氨基苯测定选择的成色剂成色剂λmax 吸光度
650 nm 0.04化合物是水不溶性的。所用化合物的DMF溶液加入到分析液中。
表II的数据表明，表中的成色剂只有化合物1、2和4符合吸光度标准，并因此值得为用于干法分析元件测试(即入＝670，吸光度大于0.3)，而化合物2结果灵敏性最差。化合物1和4不加二甲基甲酰胺(DMF)就不溶。当这些化合物溶于成色剂(2，4-二-正-戊基苯酚)溶剂中并然后涂敷在本发明的干法元件上时(下文实施例1、2和3)，它们就比化合物#2产生了非常低的信号。结果在图1、2和3中表示。
制备1-(3-磺丙基)-1，2，3，4-四氢喹啉(化合物#2，THQSO3H)1，2，3，4-四氢喹啉(4.76g，40摩尔)和1，3-丙烷磺内酯(4.88g，40摩尔)在50mL试剂级乙腈中的混合物在氮气气氛中加热并回流过夜。冷却至室温后，再冷却至冰浴温度， 滤生成的白色固体并用冷乙腈洗涤。产率为8.1g(84％)，产物熔点高于200℃。核磁共振(NMR)和元素分析表明产物与设计的结构一致。NMR(D2O)7.45(s，4H)，2.8-4.0(m，8H)，2.2(T，2H)。实施例1成色剂THQSO3H(No.2)在分析元件里制备后，把偶合化合物#2涂敷到表1a所示的本发明的元件里并在改变已知水中已酰氨基苯浓度的试验(1.0、5.4、10.0、19.0、30.0、39.0、52.0、98.0、202.0和294.0mg/L)中测试其性能。可以根据美国专利3,992,158、4,357,363和4,258,001的技术进行元件的涂敷。
图1所示的动态响应指出采用这种成色剂在整个设计的动态区域内(1-30mg/dL)见到的灵敏度好。对比实施例2成色剂1-(正丁基)1，2，3，4-四氢喹啉(化合物#1，BTHO)用在分析元件里如实施例1那样制备分析元件并用改变乙酰氨基苯浓度的样品点滴上，除了用偶合化合物#1(BTHQ)代替化合物#2(THQSO3H)以外。还因为化合物No.1不是水溶性的，它不得不分散在2-4-二-正-戊基苯酚里。
图2所示的结果表明在分析元件里这种成色剂无用并且提供的动态区域非常窄。对比实施例成色剂1，2，3，5，6，7-六氢苯并[i，j]喹啉(化合物#4，久洛尼定)在分析元件里如实施例1那样制备分析元件并用乙酰氨基苯变化浓度的样品点滴上，除了用偶合化合物#4(久洛尼定)代替化合物#2(THQSO3H)以外。因为化合物No.4不是水溶性的，它不得不分散在2，4-二-正-戊基苯酚里。
图3所示的结果表明这种成色剂提供非常窄的动态区域并因此对我们的目的无用。实施例2在元件里酪氨酸酶作为氧化剂如实施例1那样进行本实施例，除了用另一种氧化剂酪氨酸酶6400U/m2代替175000U/m2抗坏血酸氧化酶以外。在670nm处用反射型显象密度测定法测量密度响应。通过为产生的密度推导密度/前置量活动曲线和从样品的密度预测样品的乙酰氨基苯含量来制定前置量。
基于元件的密度响应得到的前置量(表III)与在测试元件上的试验流体里的已知乙酰氨基苯沈度完全发生联系。在元件里使用酪氨酸酶作氧化剂的实施例表III乙酰氨基苯含量 密度响应值(mg/dL)at670nm前置量(mg/dL)0.1 .165 0.10.5 .178 0.51.0 .190 0.91.9 .220 1.93.0 .251 3.03.9 .280 4.15.2 .307 5.29.8 .495 10.020.9 .650 20.829.4 .723 29.4实施例3在元件里使用氰铁酸钾作为氧化剂制备后，偶合化合物#2被涂敷在如表1b中所示的使用氰铁酸钾作为氧化剂的本发明元件里。在改变已知人血清中已酰氨基苯浓度的化验(0.0、10、24、50、100、146、193、247、295、350和391mg/L)中测试其性能。
图4所示的动态响应指出氰铁酸盐在整个设计的动态区域(1-30mg/dL)内提供了好的灵敏性。在表1b的元件结构里使用其它金属盐(表A)太缓慢了。当与其它试验的氧化剂相比时，出乎意料的是氰铁酸盐基于其较低的氧化还原电势产生了较快的动力学。
表A材料氧化还原电势 反应速率硫酸钢+0.34V慢氯化钢+0.34V慢硝酸铁+0.77V很慢硝酸银+0.59V很慢硝酸银+0.81V很慢氰铁酸钾 +0.46V很快本发明通过特别涉及其优选具体实例而作了详细描述，但应当理解在本发明的精神和范围内可以进行有效的变化和改进。
权利要求
1.一种含有载体的分析元件，用于在水流体中测定乙酰氨基苯，在载体上有至少一个试剂层并在所述的试测层里含有(a)一种芳基酰胺酶；(b)一种氧化剂，选自由一种酶和一种氰铁酸盐组成的组中，具有氧化偶合对胺基苯酚到成色剂上以形成颜色化合物的能力；和(c)水溶性的、形成颜色的成色剂，具有一般结构
其中R是水溶基团，选自-(CH2)nX，其中n为1-5，X是-SO3M，其中M是氢、碱金属、碱土金属或铵(NH4+)阳离子，或X是-N(R7)3+Z-，每个R7是独立选自1-4个碳原子的烷基；Z是酸性阴离子；或X是(-OCH2CH2)yOH，其中y为2-5。R1和R6共同表示亚乙基、三亚甲基或形成不完全饱和环的四亚甲基基团；R2、R3和R4分别选自氢、有1-4个碳原子的烷基和有1-4个碳原子的烷氧基。
2.根据权利要求1的含有载体的分析元件，用于在水流体中测定乙酰氨基苯，在载体上有至少一个试剂层并在所述试剂层里含有(a)一种芳基酰胺酶；(b)一种氧化酶，是有使对胺基苯酚氧化偶合到成色剂上形成彩色化合物的能力；和(c)水溶性的、形成颜色的成色剂，具有一般结构
其中R是水溶基团，选自-(CH2)nX，其中n为1-5，X是-SO3M，M是氢、碱金属、碱土金属或铵(NH4+)阳离子，或X是-N(R7)3+Z-，每个R7是独立选自1-4个碳原子的烷基；Z是酸性阴离子；或X是(-OCH2CH2)yOH，其中y为2-5。R1和R6共同表示亚乙基、三亚甲基或形成不完全饱和环的四亚甲基基团；R2、R3和R4分别选自氢、有1-4个碳原子的烷基和有1-4个碳原子的烷氧基。
3.根据权利要求1的含有载体的分析元件，用于在水流体中测定乙酰氨基苯，在载体上有至少一个试剂层并在所述试剂层里含有(a)一种芳基酰胺酶；(b)一种氰铁酸盐，具有使对胺基苯酚氧化偶合到成色剂上形成彩色化合物的能力；和(c)水溶性的、形成颜色的成色剂，具有一般结构
其中R是水溶基团，选自-(CH2)nX，其中n为1-5，X是-SO3M，M是氢、碱金属、碱土金属或铵(NH4+)阳离子，或X是-N(R7)3+Z-，其中每个R7是独立选自1-4个碳原子的烷基；Z是酸性阴离子；或X是(-OCH2CH2)yOH，y为2-5。R1和R6共同表示亚乙基、三亚甲基或形成不完全饱和环的四亚甲基基团；R2、R3和R4分别选自氢、有1-4个碳原子的烷基和有1-4个碳原子的烷氧基。
4.根据权利要求1的含有载体的多层分析元件，用于在水流体中测定乙酰氨基苯，从所述载体依次在其上具有并在流体中接触(a)一个或多个其中含有芳基酰胺酶的层；具有氧化偶合对胺基苯酚到偶合剂上形成有色化合物能力的氧化酶；如权利要求1中定义的水溶性的、形成颜色的成色剂；和(b)一个多孔的涂布层。
5.根据权利要求2的元件，其中氧化酶选自由抗坏血酸酶、乳糖酶和酪氨酸酶组成的组中。
6.根据权利要求2的元件，其中成色剂是1-(3-磺丙基)-1，2，3，4-四氢喹啉。
7.根据权利要求2的元件，进一步含有用于保持元件的PH在约6.5至约8.5范围内的缓冲剂。
8.根据权利要求2的元件，进一步含有马来酰亚胺。
9.根据权利要求1的含有载体的多层分析元件，用于在水流体中测定乙酰氨基苯，从所述载体依次在其上具有并且在流体中接触(a)一个或多个其中含有芳基酰胺酶的层；具有氧化偶合对胺基苯酚到成色剂上形成有色化合物能力的氰铁酸盐；如在权利要求1中定义的水溶性的、形成颜色的成色剂；和(b)一个多孔的涂布层。
10.根据权利要求3的元件，其中氰铁酸盐是碱金属的氰铁酸盐。
11.根据权利要求3的元件，其中成色剂是1-(3-磺丙基)-1，2，3，4-四氢喹啉。
12.根据权利要求3的元件，进一步含有保持元件PH在约6.5至8.5范围内的缓冲剂。
13.根据权利要求3的元件，进一步含有马来酰亚胺。
14.根据权利要求1的含有载体的多层分析元件，用于在水流体中测定乙酰氨基苯，从所述载体依次在其上具有第一和第二试剂层，其中第一试剂层中含有1-(3-磺丙基)-1，2，3，4-四氢喹啉；第二试剂层中含有抗坏血酸酶或氰铁酸盐和芳基酰胺酶；和一个多孔涂布层。
15.根据权利要求14的元件，进一步含有马来酰亚胺。
16.根据权利要求15的元件，其中马来酰亚胺在涂布层。
17.在水流体中测定乙酰氨基苯的方法，包括步骤a.用权利要求1、2、3或14的分析元件与水流体样品接触；和b.将生成的彩色化合物的量与流体中乙酰氨基苯的浓度关联。
全文摘要
用于检测在水流体中的乙酰氨基苯进行的分光光度测定使用了干法分析元件，元件含有一个载体，其上具有一个或多个试剂层，试剂层含有重要的酶-芳基酰胺酶—使乙酰氨基苯的酰胺键断开生成对胺基苯酚；和一种轻度氧化剂来氧化对胺基苯酚以使它连到一种水溶性成色剂上形成一种在670nm处可读取的染料。本方法对于血清和血浆样品是精密准确的，相对不受明显干扰。元件也允许在动态范围广的区域进行测定。
文档编号G01N33/52GK1155658SQ96110799
公开日1997年7月30日 申请日期1996年6月22日 优先权日1995年6月22日
发明者T·C·阿特, J·C·毛克, J·R·舍弗, R·F·温特科恩 申请人:庄臣临床诊断有限公司