一种检测食品中金黄色葡萄球菌活细胞的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种快速选择性检测食品中金黄色葡萄球菌活细胞的试剂盒及检测 方法。 技术背景
[0002] 金黄色葡萄球菌是一种需氧或兼性厌氧的革兰氏阳性菌，在空气、土壤、水、灰尘 和食品中分布广泛。奶类、肉类、鱼及其制品等更是金黄色葡萄球菌污染的主要对象，当误 食该菌数量达到1〇 5~1〇6 CFU/g时可引起食物中毒，造成急性肠胃炎，主要症状表现为呕吐。 据美国疾病控制中心报告，金黄色葡萄球菌引起的食物中毒严重程度仅次于大肠杆菌，占 细菌性食物中毒的33%，而在加拿大高达45%。美国每年由金黄色葡萄球菌引起的住院病例 平均为292000例，日本的调查结果也表明平均32. 5%的食品存在金黄色葡萄球菌的污染。 我国金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件也比较严重，全国各地均有报道，排在细菌性食 物中毒的第四位。
[0003] 目前金黄色葡萄球菌的检测方法仍然是传统培养法。传统方法具有劳动强度高、 耗时、费用高等缺点，且特异性差，报告检测结果大约需要4-7天，已不能满足微生物快速 准确检测的现实需要。因此，迫切需要建立新的快速、准确检测技术和方法。
[0004] 近年来，免疫学、分子生物学等方法的应用使金黄色葡萄球菌的检测有了长足的 发展。但是，如ELISA和免疫荧光法等免疫学方法在操作程序及特异性方面还不理想；基于 PCR技术的分子生物学方法以其特异、快速等优势而被广泛应用，然而普通PCR方法容易造 成假阳性检测结果，并且难以对实际污染浓度进行定量。因此，开发准确且能定量检测金黄 色葡萄球菌的方法至关重要。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种食品中金黄色葡萄球菌活细胞 检测试剂盒及检测方法，可实现对金黄色葡萄球菌活细胞快速、准确、特异检测。
[0006] 本发明通过以下技术方案实现上述目的。
[0007] 一种运用PMA-qPCR选择性检测食品中金黄色葡萄球菌活细胞的试剂盒，主要包 括金黄色葡萄球菌阳性对照品、阴性对照品、DNA荧光染料、DNA聚合酶、PCR反应液和PMA 溶液的六个离心管；所述PCR反应液含有PCR缓冲液、dNTP，还含有金黄色葡萄球菌特异性 上游引物、下游引物，所述引物序列如下： 上游引物：5' -CGATTGATGGTGATACGGTT-3' 下游引物：5' -GCACTTGCTTCAGGACCAT-3' ； 所述金黄色葡萄球菌阳性对照品为金黄色葡萄球菌重组质粒DNA标准品，序列如下： cgattgatggtgatacggttaaattaatgtacaaaggtca aacaatgacattcagactattattggttgatacacc tgaaacaaagcatcctaaaaaaggtgtagagaaatatggtcctgaagcaagtgc〇
[0008] 1、根据编码金黄色葡萄球菌编码耐热核酸酶的nuc基因 （GenBank :DQ507382. 1) 设计并合成特异性引物，其序列如下： 上游引物：5' -CGATTGATGGTGATACGGTT-3' ； 下游引物：5' -GCACTTGCTTCAGGACCAT-3'。
[0009] 2、PMA处理待测样品：用终质量浓度为5 μ g/mL的PM和待测样混匀后室温避光 5 min，每隔30 s摇勾一次，卤素灯曝光5 min，光照交联时样品置于冰上，交联后的悬浮液 离心，所得沉淀用热裂解煮沸法提取待测样品DNA。
[0010] 3、阳性标准品即阳性对照的制备：上述引物的PCR阳性产物经2%琼脂糖凝胶电 泳，切下目的条带并回收纯化，将产物连接到T载体上构建成质粒。提取阳性克隆质粒，稀 释到适当的浓度即作为阳性标准品。
[0011] 4、标准曲线的制备：为了达到定量检测的效果，将上述阳性质粒5 μ L，按10倍梯 度稀释，依次稀释5-7个梯度。以梯度阳性标准品及PMA处理后的待测样DNA在相同条件 下进行qPCR反应，以标准品浓度的对数值为横坐标，循环数（Ct值）为纵坐标绘制标准曲 线。根据待测样测得的Ct值，对照标准曲线，获得待测样中金黄色葡萄球菌活细胞的准确 浓度。
[0012] 本发明的另一个目的在于提供一种检测食品中金黄色葡萄球菌活细胞的方法，其 步骤如下： (1)取食品样品，加无菌IXPBS缓冲液研磨成混合物，离心除去大的食物残渣，取上清 得到菌悬液，整个过程均为无菌操作。
[0013] (2)取制备好的菌悬液加叠氮溴化丙锭溶液，使叠氮溴化丙锭PM的终质量浓度 为5 μ g/mL，混勾后室温避光5 min，每隔30 s摇勾一次，卤素灯曝光5 min，光照交联时样 品置于冰上，交联后的悬浮液离心，所得沉淀用热裂解煮沸法提取待测样品DNA ; (3) 取DNA荧光染料、DNA聚合酶和PCR反应液混合，分别加入PMA处理过的待测样品 DNA或者阴性对照品配成PCR反应体系，于同等条件下进行PCR扩增反应，反应管置于ABI 7900HT荧光定量PCR仪进行荧光检测； 所述PCR反应液含有特异性上游引物、下游引物，所述引物序列如下： 上游引物：5' -CGATTGATGGTGATACGGTT-3' 下游引物：5' -GCACTTGCTTCAGGACCAT-3' (4) 设定阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点；若待测样品荧光增长曲线超过阈值 线，并呈良好的对数增长，而且Ct值少于35,则判断为金黄色葡萄球菌阳性，即样本中存在 金黄色葡萄球菌活细胞。
[0014] 所述步骤（3)中qPCR反应体系为：2 UL的DNA荧光染料、2. 5 yL PCR缓冲液、 上、下游引物各0.8 yL、0. 2 yL的DNA聚合酶、2.0 yL的dNTPs、2 yL的模板，双蒸水补 齐 20 yL。
[0015] 所述步骤（3)中qPCR反应体系为：95°C预变性30 s、95°C变性5 s、58°C退火1 min，40个循环。
[0016] 发明建立了利用qPCR技术融合核酸交联剂特性的方法，检测了食品中金黄色葡 萄球菌活细胞，并经检测实际样本，表明该方法切实可行。由于本方法使用了能选择性透过 死细胞细胞膜并与DNA交联的PMA，使得检测的准确性大大提高，消除了由于死细胞导致的 假阳性结果；由于使用了 ABI 7900HT实时荧光定量PCR，使得目的菌的检测灵敏性更高，而 且可以对食品中金黄色葡萄球菌活细胞做到精确定量。
[0017] 综上所述，本发明可以快速、准确、高特异地检测食品中的金黄色葡萄球菌活细 胞，不需要复杂的仪器，为金黄色葡萄球菌活细胞的检测提供了新的技术平台，可用于基层 医疗卫生单位、食品企业和各疾病预防控制中心筛查和检测，具有较大的经济、社会效益， 适于大范围推广应用。
[0018] 与现有技术相比，本发明有如下有益效果： 1、 能特异性检测金黄色葡