一种基于杂交链式反应的dna、rna或蛋白质检测探针、检测方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及核酸分子检测领域，具体涉及一种基于杂交链式反应的DNA、RNA或蛋 白质检测探针、检测方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 高灵敏地检测生物分子（DNA、RNA与蛋白质)对于生物医学领域具有重要意义。生 物发光法是近年发展的一种生物分子检测新方法，具有高灵敏度和特异性，然而现已报道 的生物发光法检测技术一般需要固定、分离和冲洗等步骤，而且需要进行异相检测，并依赖 于荧光素酶标记，操作过程较为繁琐。
[0003] 因此，有必要提供一种简单易行，且能快速、高灵敏地检测生物分子的方法。
【发明内容】
[0004] 为解决上述问题，本发明第一方面提供了一种基于杂交链式反应的DNA或RNA检 测探针。本发明第二方面提供了一种基于杂交链式反应的蛋白质检测探针。本发明第三方 面提供了一种基于杂交链式反应的DNA或RNA检测方法。本发明第四方面提供了一种基于 杂交链式反应的蛋白质检测方法。本发明第五方面提供了一种基于杂交链式反应的DNA、 RNA或蛋白质检测试剂盒。该方案突破了传统的生物发光方法需要进行异相检测，并依赖于 荧光素酶标记的缺陷，在生物医学研究和疾病诊断方面具有广阔的应用价值。
[0005] 第一方面，本发明提供了一种基于杂交链式反应的DNA或RNA检测探针，所述检测 探针包括探针-1和探针-2,所述探针-1和探针_2依次包括5'端侧链、环区以及3'端侧 链，所述5'端侧链、环区以及3'端侧链均为单链核苷酸；
[0006] 所述探针-1中，所述5'端侧链的部分核苷酸序列与3'端侧链反向互补，所述环 区与3'端侧链的碱基数之和与所述5'端侧链括5'端侧链、环区以及3'端侧链，所述5' 端侧链、环区以及3'端侧链均为单链核苷酸；的碱基数相等，所述探针-1的5'端侧链具有 与待测DNA或RNA互补的核苷酸序列；
[0007] 所述探针-2中，所述3'端侧链的部分核苷酸序列与5'端侧链反向互补，所述环 区与5'端侧链的碱基数之和与所述3'端侧链的碱基数相等；
[0008] 所述探针-1与探针_2的核苷酸序列反向互补，其中，所述探针-1的5'端侧链与 探针-2的5'端侧链及环区反向互补，所述探针-1的环区以及3'端侧链与探针-2的3' 端侧链反向互补。
[0009] 优选地，当待测DNA或RNA不存在时，所述探针-1和探针-2以初始状态存在，所 述探针-1和探针-2的初始状态由茎部和环部构成，茎部由5'端侧链与3'端侧链互补而 成，环部为环区；当待测DNA或RNA存在时，所述待测DNA或RNA引发多条探针-1和探针-2 之间发生杂交链式反应，得到探针-1和探针-2相互杂交的双链核苷酸（1);所述双链核苷 酸（1)中，一条单链由1条以上的探针-1组成，另一条单链由1条以上的探针-2组成，所 述探针-1之间或探针-2之间的3' -羟基与5' -磷酸基团相互之间不形成磷酸二酯键。 [0010] 优选地，所述探针-1的5'端侧链的部分核苷酸序列3'端侧链与反向互补的双链 区为双链核苷酸（2);所述探针-2的3'端侧链的部分核苷酸序列与5'端侧链反向互补的 双链区为双链核苷酸（2)'，所述双链核苷酸（2)或（2)'的解链温度不小于45°C。
[0011] 优选地，所述探针-1为脱氧核糖核苷酸链。
[0012] 更优选地，所述探针-1的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0013] 优选地，所述探针_2为脱氧核糖核苷酸链。
[0014] 更优选地，所述探针_2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0015] 本发明所述核苷酸链之间互补形成双链核苷酸为两条具有互补核苷酸序列的单 链核苷酸通过其互补碱基之间的氢键作用形成双链。
[0016] 在反应体系中，所述探针-1和探针-2各自保持其初始状态，即以具有茎-环二级 结构的发卡结构存在，不会相互杂交产生双链。只有当目标DNA或RNA与探针-1的5'端侧 链互补配对后，探针-1的发卡结构被完全打开，即探针-1由初始状态转为成为解链状态， 并暴露出与探针-2互补的区域(探针-1的环区与3'端侧链)，此时，探针-2的3'端侧链 与环区结合到探针-1的环区与3'端侧链；并引发探针-1和探针-2之间一系列的杂交反 应，形成长链DNA，所得的长链DNA中，一条单链由1条以上的探针-1组成，另一条单链由1 条以上的探针-2组成，所述探针-1之间或探针_2之间的3' -羟基（3' -OH)与5' -磷酸 基团（5' -P04)相互之间不形成磷酸二酯键。
[0017] 本发明第二方面一种基于杂交链式反应的蛋白质检测探针，包括适配体探针、探 针-3和探针-4,所述适配体探针、探针-3和探针-4针依次包括5'端侧链、环区以及3'端 侧链，所述5'端侧链、环区以及3'端侧链均为单链核苷酸；
[0018] 所述适配体探针中，所述5'端侧链与3'端侧链的部分核苷酸序列反向互补； [0019] 所述探针_3中，所述环区与3'端侧链的碱基数之和与所述5'端侧链的碱基数相 等，所述5'端侧链的部分核苷酸序列与3'端侧链反向互补；
[0020] 所述探针-4中，所述环区与3'端侧链的碱基数之和与所述5'端侧链的碱基数相 等，所述3'端侧链的部分核苷酸序列与5'端侧链反向互补；
[0021] 所述适配体探针的5'端侧链具有与探针-3的5'端侧链反向互补的核苷酸序列， 所述适配体探针的3'端侧链具有与结合待测蛋白质的核苷酸序列；所述探针-3与探针-4 具有反向互补的核苷酸序列，其中，所述探针-3的5'端侧链与探针-4的5'端侧链及环区 反向互补，所述探针-3的环区以及3'端侧链与探针-4的环区以及3'端侧链反向互补。
[0022] 优选地，当待测蛋白质不存在时，所述适配体探针、探针-1和探针-2以初始状态 存在，所述适配体探针、探针-3和探针-4的初始状态具有茎-环二级结构，由茎部和环部 构成，茎部由5'端侧链与3'端侧链互补而成，环部为环区；
[0023] 当待测蛋白质存在时，所述待测蛋白质特异性识别适配体探针的3'端侧链，并引 发多条探针-3和探针_4之间发生杂交链式反应，得到探针-3和探针-4相互杂交的双链 核苷酸（3);
[0024] 所述双链核苷酸（3)中，一条单链由1条以上的探针-3组成，另一条单链由1条 以上的探针-4组成，所述探针-3之间或探针-4之间的3' -羟基与5' -磷酸基团相互之 间不形成磷酸二酯键。
[0025] 优选地，所述适配体探针的5'端侧链与3'端侧链的部分核苷酸序列反向互补的 双链区为双链核苷酸（4);所述探针-3的5'端侧链的部分核苷酸序列与3'端侧链反向互 补的双链区为双链核苷酸（5);所述探针-4的3'端侧链的部分核苷酸序列与5'端侧链反 向互补的双链区为双链核苷酸（5)' ；所述双链核苷酸（4)、（5)或（5)'的解链温度不小于 45。。。
[0026] 优选地，所述探针-3为脱氧核糖核苷酸链。
[0027] 更优选地，所述探针-3的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0028] 优选地，所述探针_4为脱氧核糖核苷酸链。
[0029] 更优选地，所述探针-4的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0030] 优选地，所述适配体探针为脱氧核糖核苷酸链。
[0031] 更优选地，所述适配体探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
[0032] 在反应体系中，所述适配体探针、探针_3或探针-4各自保持其初始状态，即以具 有茎-环二级结构的发卡结构存在，不会相互杂交产生双链。只有当目标蛋白质与特异性 识别适配体探针的3'端侧链，适配体探针的发卡结构被完全打开，即适配体探针由初始状 态转为成为解链状态，并暴露出与探针-3互补的区域(至少包括适配体探针的5'端侧链 的部分序列)，此时，适配体探针的5'端侧链结合到探针-3的5'端侧链，并使得探针-3解 链，暴露出与探针-4互补的区域(探针-3的环区以及3'端侧链)，此时，探针-3的环区以 及3'端侧链结合探针-4的3'端侧链，并使得探针-4解链，由此引发探针-3和探针-4之 间一系列的杂交反应，形成长链DNA，所得的长链DNA中，一条单链由1条以上的探针-3组 成，另一条单链由1条以上的探针-4组成，所述探针-3之间或探针-4之间的3' -羟基与 5' -磷酸基团相互之间不形成磷酸二酯键。
[0033] 本发明第三方面提供了一种基于杂交链式反应的DNA或RNA检测方法，包括如下 步骤：
[0034] 提供反应体系，包括待测DNA或RNA、探针-1、探针-2、使用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 为底物的连接酶、单磷酸腺苷磷酸化试剂、检测三磷酸腺苷的生物发光试剂和缓冲液，及
[0035] 所述反应体系在室温下反应0. 5~2小时，及
[0036] 检测生物发光信号；
[0037] 其中，所述探针-1和探针-2依次包括5'端侧链、环区以及3'端侧链，所述5'端 侧链、环区以及3'端侧链均为单链核苷酸；
[0038] 所述探针-1中，所述5'端侧链的部分核