本发明涉及生物工程技术领域，尤其是一种类海胆肽口服液的制备方法。
背景技术：
近年来，关于活性氧自由基（ROS）的研究日益增多。许多研究已经证实：活性氧自由基与癌症、肝病、老年痴呆症、关节炎、糖尿病等疾病的产生有关。凡是能干扰自由基链式反应中链引发和链增长过程，清除ROS的化合物统称为抗氧化剂。抗氧化剂有内源性和外源性两大类。前者包括生物体新陈代谢过程中产生的抗氧化酶、尿酸、泛醌、谷胱甘肽等，后者包括一些合成或者天然的抗氧化剂，如丁基羟基茴香醚、植物多酚等等。由于化学合成的酚类抗氧化剂的安全性受到质疑，天然抗氧化剂已成为国内外竞相研究的热点。
海胆之名始载于《本草原始》，是一种在世界各地食用广泛的海洋水产。海胆的生殖腺是海胆黄，含有大量的蛋白质，海胆黄中蛋白质可占干重的44.5%，其营养价值类似于酪蛋白，含有17中氨基酸，不但具有很高的食用价值，还有极好的药用功能，是制备抗氧化剂—活性肽的天然原料。同时，以海胆黄为原料制备海胆肽口服液的技术已有公开报道，例如，2015年9月2日公开的CN104872673A中国发明专利申请公开说明书中就公开这样一种“海胆肽口服液及其制备方法”，其是将新鲜海胆剥开后，取出海胆黄与水混合磨浆，加入脂肪酶进行酶解脱脂，超滤收集截留液，即为海胆黄粗蛋白溶液，将海胆黄粗蛋白溶液采用菠萝蛋白酶和生姜蛋白酶阶段性协同酶解，酶解液再经过滤、超滤，调配和浓缩后得到海胆肽口服液。但是，海胆产量有限，并且海胆黄容易自溶，海胆捕捞出水后，放置半日至一日，就可能发软变质，失去原有的营养价值。因此，以海胆黄为原料制备活性肽及产品易受到捕捞季节、地理条件等影响，且生产成本高。
技术实现要素：
为了克服现有以海胆黄为原料制备活性肽及产品易受到捕捞季节等影响及生产成本高的不足，本发明提供一种工艺合理、易于操作、原料来源不受限制、生产成本低的类海胆肽口服液的制备方法，该方法利用生物工程技术获得大量2～6个氨基酸组成的小肽为主要成分的类海胆肽，可被人体不经消化而直接吸收，制备的类海胆肽口服液营养价值、口感淳厚、酸甜适中。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：一种类海胆肽口服液及其制备方法，其特征在于：经过下列工艺步骤：
（1）、海胆黄细胞RNA的提取
（1.1）、匀浆处理
称取100～200mg海胆黄组织在液氮中磨碎，加入1～2ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理；
（1.2）、静置
将步骤（1.1）中得到的匀浆后的混合物在室温条件下静置3～5min，使核酸蛋白复合物完全分离；
（1.3）、离心去杂质
将步骤（1.2）中得到的静置后的混合物于2～8℃条件下，10000g离心8～10min，收取上清液；
（1.4）、抽提
将步骤（1.3）中得到的上清液中加入其体积10%～20%的氯仿，剧烈振荡15～20s，室温静置2～3min；
（1.5）、离心
将步骤（1.4）中得到的室温静置后的混合物于2～8℃条件下，10000g离心10～15min；样品分为三层：有机相、水相和中间层；
（1.6）、沉淀
将步骤（1.5）中的水相层转移到新试管中，按体积比1:1～2的比例加入异丙醇，室温静置8～10min，于2～8℃条件下，10000g离心8～10min，管侧和管底出现胶状沉淀，移去上清液，即得RNA沉淀；
（1.7）、洗涤
向步骤（1.6）中得到的RNA沉淀中加入1～1.5ml、浓度为75%的乙醇溶液进行洗涤，再于2～8℃条件下，6000～7500g离心3～5min，弃上清液，得洗涤后的RNA沉淀；
（1.8）、干燥
将步骤（1.7）中得到的洗涤后的RNA沉淀室温放置干燥5～10min，然后加入25～200μl无RNase的水，用枪头吸打混匀，于55～60℃条件下静置8～10min，使RNA溶解，-70℃保存，备用；
（2）、反转录
将步骤（1.8）中得到的保存的RNA采用RT-PCR的方法，利用反转录酶SuperScriptTMII和随机引物进行反转录，获得海胆黄细胞的cDNA；
（3）、构建表达载体
将步骤（2）中得到的海胆黄细胞的cDNA以反转录产物为模板，利用大量随机引物：引物L-随机和R-随机 PCR扩增25个循环后回收，酶切后，回收产物与pET32(a)载体连接，转化大肠杆菌DH5α，得到含有表达载体pET32(a)-随机的大肠杆菌，挑取菌落，接种入LB液体培养基，待菌液浓度为OD值接近1.0时，向其中加入菌液体积10%～15%的甘油，-70℃保存，得到转化入表达载体的菌株；
（4）、蛋白表达
挑取步骤（3）中保存的菌株，接种体积为10ml LB液体培养基，37℃振荡培养8～12h；将10ml菌液加入到500ml LB液体培养基中，37℃振荡培养8～12h；将500ml菌液接种至50～80L发酵罐中，跟踪菌体生长指标，待OD600≈0.4～0.6，向其中加入IPTG至终浓度为0.3～0.4mM，继续振荡培养6h；开罐取菌液，12000g离心30～60s，用发酵液体积10%～20%的、浓度为1%的SDS溶液进行重悬，混匀，冰上超声破碎；12000g离心30～60s，取上清液，即为海胆黄RNA随机原核表达粗产物；
（5）、酶切
将步骤（4）中的海胆黄RNA随机原核表达粗产物采用复合蛋白酶进行充分酶切，得到类海胆酶切溶液；其中，所述的复合蛋白酶为中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶中的两种或多种；复合蛋白酶使用量为海胆黄RNA随机原核表达粗产物质量的1%～2.5%；
（6）、超滤浓缩
将步骤（5）中得到的类海胆酶切溶液利用2000Kd的超滤管进行超滤，收集滤过液，即得2000Kd以下的2～6个氨基酸大小的类海胆肽溶液；
（7）、调配
称取步骤（6）中得到的类海胆肽溶液加入其质量6%～6.5%的枸杞提取液、1%～1.5%的薄荷提取液、0.00015～0.00018%的乳酸链球菌素混合均匀，得调配液；
（8）、灭菌
将步骤（7）中得到的调配液经精滤膜精滤后，进行高温瞬时灭菌；
（9）、灌装
将步骤（8）中得到的灭菌后的精滤液用灌装机按预设重量进行分瓶真空灌装，封口，获得类海胆肽口服液。
所述的枸杞提取液其是称取枸杞采用去离子水冲洗后，按照料液比1:30～40添加去离子水，浸泡2～3h，蒸煮20～30min，过滤，收集滤液后进行抽滤，澄清透过液即得枸杞提取液。
所述的薄荷提取液其称取薄荷采用去离子水冲洗后，按照料液比1:30～40添加去离子水，浸泡2～3h，打浆，蒸煮20～30min，过滤，收集滤液后进行抽滤，澄清透过液即得薄荷提取液。
所述的匀浆后的混合物静置时的室温控制为15～30℃。
所述的高温瞬时灭菌的灭菌温度为120～140℃，灭菌时间为4～6s。
所述的真空灌装的真空度为0.04～0.05Mpa，灌装温度控制在60～75℃。
本发明先是选取海胆黄组织通过氯仿抽提方法，获得海胆黄细胞RNA；再采用RT-PCR的方法，得到海胆黄细胞的cDNA，然后利用随机引物进行PCR，得到各种随机的基因片段，然后将得到的基因片段克隆入原核表达载体，进行诱导表达，得到随机基因编码的随机蛋白，这些蛋白有一个共同的特点，都是来源于海胆黄细胞的RNA，即均为海胆黄细胞中所含有蛋白或蛋白片段，氨基酸组成与海胆黄细胞的氨基酸组成基本类似，克服了生产原料受限的问题，所得到的蛋白用于后期的口服液加工使用，使得到的口服液产品具有海胆黄的氨基酸组成，不影响营养价值和功效，以达到提供与海胆黄多肽类似的抗氧化作用。本发明采用的是原核表达的方法，因原核表达技术成熟，价格低廉，易于操作，降低了生产成本。本发明将枸杞提取液和薄荷提取液与类海胆肽溶液进行调配，不添加任何化学物质，使类海胆肽口服液口感淳厚，酸甜适中，鲜味十足。枸杞提取液和薄荷提取液中含有丰富的枸杞多糖、有机酸、苷类和黄酮类物质，其抗氧化活性大大提高了海胆肽口服液的营养价值和保健功能。本发明的类海胆肽口服液的制备方法，其工艺合理，操作可行，易实现规模化生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种类海胆肽口服液及其制备方法，经过下列工艺步骤：
（1）、海胆黄细胞RNA的提取
（1.1）、匀浆处理
称取150mg海胆黄组织在液氮中磨碎，加入1.5ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理；
（1.2）、静置
将步骤（1.1）中得到的匀浆后的混合物在室温控制为20℃条件下静置4min，使核酸蛋白复合物完全分离；
（1.3）、离心去杂质
将步骤（1.2）中得到的静置后的混合物于5℃条件下，10000g离心9min，收取上清液；
（1.4）、抽提
将步骤（1.3）中得到的上清液中加入其体积16%的氯仿，剧烈振荡18s，室温静置3min；
（1.5）、离心
将步骤（1.4）中得到的室温静置后的混合物于5℃条件下，10000g离心12min；样品分为三层：有机相、水相和中间层；
（1.6）、沉淀
将步骤（1.5）中的水相层转移到新试管中，按体积比1:1.6的比例加入异丙醇，室温静置9min，于5℃条件下，10000g离心9min，管侧和管底出现胶状沉淀，移去上清液，即得RNA沉淀；
（1.7）、洗涤
向步骤（1.6）中得到的RNA沉淀中加入1.2ml、浓度为75%的乙醇溶液进行洗涤，再于5℃条件下，7000g离心4min，弃上清液，得洗涤后的RNA沉淀；
（1.8）、干燥
将步骤（1.7）中得到的洗涤后的RNA沉淀室温放置干燥8min，然后加入100μl无RNase的水，用枪头吸打混匀，于58℃条件下静置9min，使RNA溶解，-70℃保存，备用；
（2）、反转录
将步骤（1.8）中得到的保存的RNA采用RT-PCR的方法，利用反转录酶SuperScriptTMII和随机引物进行反转录，获得海胆黄细胞的cDNA；
（3）、构建表达载体
将步骤（2）中得到的海胆黄细胞的cDNA以反转录产物为模板，利用大量随机引物：引物L-随机和R-随机 PCR扩增25个循环后回收，酶切后，回收产物与pET32(a)载体连接，转化大肠杆菌DH5α，得到含有表达载体pET32(a)-随机的大肠杆菌，挑取菌落，接种入LB液体培养基，待菌液浓度为OD值接近1.0时，向其中加入菌液体积12%的甘油，-70℃保存，得到转化入表达载体的菌株；
（4）、蛋白表达
挑取步骤（3）中保存的菌株，接种体积为10ml LB液体培养基，37℃振荡培养10h；将10ml菌液加入到500ml LB液体培养基中，37℃振荡培养10h；将500ml菌液接种至65L发酵罐中，跟踪菌体生长指标，待OD600≈0.5，向其中加入IPTG至终浓度为0.35mM，继续振荡培养6h；开罐取菌液，12000g离心45s，用发酵液体积15%的、浓度为1%的SDS溶液进行重悬，混匀，冰上超声破碎；12000g离心45s，取上清液，即为海胆黄RNA随机原核表达粗产物；
（5）、酶切
将步骤（4）中的海胆黄RNA随机原核表达粗产物采用复合蛋白酶进行充分酶切，得到类海胆酶切溶液；其中，所述的复合蛋白酶为中性蛋白酶和胰蛋白酶，中性蛋白酶使用量为海胆黄RNA随机原核表达粗产物质量的1%，胰蛋白酶使用量为海胆黄RNA随机原核表达粗产物质量的1.2%；
（6）、超滤浓缩
将步骤（5）中得到的类海胆酶切溶液利用2000Kd的超滤管进行超滤，收集滤过液，即得2000Kd以下的2～6个氨基酸大小的类海胆肽溶液；
（7）、调配
称取步骤（6）中得到的类海胆肽溶液加入其质量6.,2 %的枸杞提取液、1.2%的薄荷提取液、0.00016%的乳酸链球菌素混合均匀，得调配液；其中，枸杞提取液其是称取枸杞采用去离子水冲洗后，按照料液比1:35添加去离子水，浸泡2.5h，蒸煮25min，过滤，收集滤液后进行抽滤，澄清透过液即得枸杞提取液；薄荷提取液其称取薄荷采用去离子水冲洗后，按照料液比1:32添加去离子水，浸泡3h，打浆，蒸煮25min，过滤，收集滤液后进行抽滤，澄清透过液即为薄荷提取液；
（8）、灭菌
将步骤（7）中得到的调配液经孔径为0.5微米的精滤膜精滤后，进行高温瞬时灭菌，其灭菌温度为130℃，灭菌时间为5s；
（9）、灌装
将步骤（8）中得到的灭菌后的精滤液用灌装机按每瓶100g进行分瓶真空灌装，其真空度为0.045Mpa，灌装温度控制在70℃，封口，获得类海胆肽口服液。
本实施例得到随机基因编码的随机蛋白的氨基酸组成与海胆黄细胞的氨基酸组成基本类似，克服了生产原料受限的问题，所得到的类海胆蛋白营养价值高和抗氧化功效好。其采用的原核表达方法技术成熟，价格低廉，易于操作，降低了生产成本。其将类海胆肽与枸杞提取液和薄荷提取液进行调配，得到的口服液口感淳厚，酸甜适中。枸杞提取液和薄荷提取液中含有丰富的枸杞多糖、有机酸、苷类和黄酮类物质，其抗氧化活性大大提高了海胆肽口服液的营养价值和保健功能。其制备方法工艺合理，操作可行，易实现规模化生产。
实施例2
一种类海胆肽口服液及其制备方法，经过下列工艺步骤：
（1）、海胆黄细胞RNA的提取
（1.1）、匀浆处理
称取200mg海胆黄组织在液氮中磨碎，加入2ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理；
（1.2）、静置
将步骤（1.1）中得到的匀浆后的混合物在室温控制为30℃条件下静置3min，使核酸蛋白复合物完全分离；
（1.3）、离心去杂质
将步骤（1.2）中得到的静置后的混合物于8℃条件下，10000g离心8min，收取上清液；
（1.4）、抽提
将步骤（1.3）中得到的上清液中加入其体积20%的氯仿，剧烈振荡20s，室温静置3min；
（1.5）、离心
将步骤（1.4）中得到的室温静置后的混合物于8℃条件下，10000g离心15min；样品分为三层：有机相、水相和中间层；
（1.6）、沉淀
将步骤（1.5）中的水相层转移到新试管中，按体积比1: 2的比例加入异丙醇，室温静置10min，于8℃条件下，10000g离心10min，管侧和管底出现胶状沉淀，移去上清液，即得RNA沉淀；
（1.7）、洗涤
向步骤（1.6）中得到的RNA沉淀中加入1.5ml、浓度为75%的乙醇溶液进行洗涤，再于8℃条件下， 7500g离心3min，弃上清液，得洗涤后的RNA沉淀；
（1.8）、干燥
将步骤（1.7）中得到的洗涤后的RNA沉淀室温放置干燥10min，然后加入200μl无RNase的水，用枪头吸打混匀，于60℃条件下静置8min，使RNA溶解，-70℃保存，备用；
（2）、反转录
将步骤（1.8）中得到的保存的RNA采用RT-PCR的方法，利用反转录酶SuperScriptTMII和随机引物进行反转录，获得海胆黄细胞的cDNA；
（3）、构建表达载体
将步骤（2）中得到的海胆黄细胞的cDNA以反转录产物为模板，利用大量随机引物：引物L-随机和R-随机 PCR扩增25个循环后回收，酶切后，回收产物与pET32(a)载体连接，转化大肠杆菌DH5α，得到含有表达载体pET32(a)-随机的大肠杆菌，挑取菌落，接种入LB液体培养基，待菌液浓度为OD值接近1.0时，向其中加入菌液体积15%的甘油，-70℃保存，得到转化入表达载体的菌株；
（4）、蛋白表达
挑取步骤（3）中保存的菌株，接种体积为10ml LB液体培养基，37℃振荡培养12h；将10ml菌液加入到500ml LB液体培养基中，37℃振荡培养12h；将500ml菌液接种至80L发酵罐中，跟踪菌体生长指标，待OD600≈0.6，向其中加入IPTG至终浓度为0.4mM，继续振荡培养6h；开罐取菌液，12000g离心60s，用发酵液体积120%的、浓度为1%的SDS溶液进行重悬，混匀，冰上超声破碎；12000g离心60s，取上清液，即为海胆黄RNA随机原核表达粗产物；
（5）、酶切
将步骤（4）中的海胆黄RNA随机原核表达粗产物采用复合蛋白酶进行充分酶切，得到类海胆酶切溶液；其中，复合蛋白酶为木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和胰蛋白酶；木瓜蛋白酶使用量为海胆黄RNA随机原核表达粗产物质量的0.5%，菠萝蛋白酶使用量为海胆黄RNA随机原核表达粗产物质量的1%，胰蛋白酶使用量为海胆黄RNA随机原核表达粗产物质量的1%；
（6）、超滤浓缩
将步骤（5）中得到的类海胆酶切溶液利用2000Kd的超滤管进行超滤，收集滤过液，即得2000Kd以下的2～6个氨基酸大小的类海胆肽溶液；
（7）、调配
称取步骤（6）中得到的类海胆肽溶液加入其质量6.5%的枸杞提取液、1%的薄荷提取液、0.00018%的乳酸链球菌素混合均匀，得调配液；其中，枸杞提取液其是称取枸杞采用去离子水冲洗后，按照料液比1:30添加去离子水，浸泡2h，蒸煮20min，过滤，收集滤液后进行抽滤，澄清透过液即得枸杞提取液；薄荷提取液其称取薄荷采用去离子水冲洗后，按照料液比1:30添加去离子水，浸泡2h，打浆，蒸煮20min，过滤，收集滤液后进行抽滤，澄清透过液即为薄荷提取液；
（8）、灭菌
将步骤（7）中得到的调配液经孔径为0.5微米的精滤膜精滤后，进行高温瞬时灭菌，其灭菌温度为120℃，灭菌时间为6s；
（9）、灌装
将步骤（8）中得到的灭菌后的精滤液用灌装机按每瓶80g进行分瓶真空灌装，其真空度为0.05Mpa，灌装温度控制在60℃，封口，获得类海胆肽口服液。
本实施例得到随机基因编码的随机蛋白的氨基酸组成与海胆黄细胞的氨基酸组成基本类似，克服了生产原料受限的问题。其采用的原核表达方法技术成熟，易于操作，生产成本低。本实施例将类海胆肽与枸杞提取液和薄荷提取液进行调配，得到类海胆肽口服液口感淳厚，酸甜适中。其制备方法工艺合理，操作可行，易实现规模化生产。
实施例3
一种类海胆肽口服液及其制备方法，经过下列工艺步骤：
（1）、海胆黄细胞RNA的提取
（1.1）、匀浆处理
称取100mg海胆黄组织在液氮中磨碎，加入1ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理；
（1.2）、静置
将步骤（1.1）中得到的匀浆后的混合物在室温控制为15℃条件下静置5min，使核酸蛋白复合物完全分离；
（1.3）、离心去杂质
将步骤（1.2）中得到的静置后的混合物于2℃条件下，10000g离心10min，收取上清液；
（1.4）、抽提
将步骤（1.3）中得到的上清液中加入其体积10%的氯仿，剧烈振荡15s，室温静置2min；
（1.5）、离心
将步骤（1.4）中得到的室温静置后的混合物于2℃条件下，10000g离心10min；样品分为三层：有机相、水相和中间层；
（1.6）、沉淀
将步骤（1.5）中的水相层转移到新试管中，按体积比1:1的比例加入异丙醇，室温静置8min，于2℃条件下，10000g离心8min，管侧和管底出现胶状沉淀，移去上清液，即得RNA沉淀；
（1.7）、洗涤
向步骤（1.6）中得到的RNA沉淀中加入1ml、浓度为75%的乙醇溶液进行洗涤，再于2℃条件下，6000g离心5min，弃上清液，得洗涤后的RNA沉淀；
（1.8）、干燥
将步骤（1.7）中得到的洗涤后的RNA沉淀室温放置干燥5min，然后加入25μl无RNase的水，用枪头吸打混匀，于55℃条件下静置10min，使RNA溶解，-70℃保存，备用；
（2）、反转录
将步骤（1.8）中得到的保存的RNA采用RT-PCR的方法，利用反转录酶SuperScriptTMII和随机引物进行反转录，获得海胆黄细胞的cDNA；
（3）、构建表达载体
将步骤（2）中得到的海胆黄细胞的cDNA以反转录产物为模板，利用大量随机引物：引物L-随机和R-随机 PCR扩增25个循环后回收，酶切后，回收产物与pET32(a)载体连接，转化大肠杆菌DH5α，得到含有表达载体pET32(a)-随机的大肠杆菌，挑取菌落，接种入LB液体培养基，待菌液浓度为OD值接近1.0时，向其中加入菌液体积10%的甘油，-70℃保存，得到转化入表达载体的菌株；
（4）、蛋白表达
挑取步骤（3）中保存的菌株，接种体积为10ml LB液体培养基，37℃振荡培养8h；将10ml菌液加入到500ml LB液体培养基中，37℃振荡培养8h；将500ml菌液接种至50L发酵罐中，跟踪菌体生长指标，待OD600≈0.4，向其中加入IPTG至终浓度为0.3mM，继续振荡培养6h；开罐取菌液，12000g离心30s，用发酵液体积10%的、浓度为1%的SDS溶液进行重悬，混匀，冰上超声破碎；12000g离心30s，取上清液，即为海胆黄RNA随机原核表达粗产物；
（5）、酶切
将步骤（4）中的海胆黄RNA随机原核表达粗产物采用复合蛋白酶进行充分酶切，得到类海胆酶切溶液；其中，所述的复合蛋白酶为木瓜蛋白酶与菠萝蛋白酶；木瓜蛋白酶使用量为海胆黄RNA随机原核表达粗产物质量的0.6%，菠萝蛋白酶使用量为海胆黄RNA随机原核表达粗产物质量的0.4%；
（6）、超滤浓缩
将步骤（5）中得到的类海胆酶切溶液利用2000Kd的超滤管进行超滤，收集滤过液，即得2000Kd以下的2～6个氨基酸大小的类海胆肽溶液；
（7）、调配
称取步骤（6）中得到的类海胆肽溶液加入其质量6%的枸杞提取液、1.5%的薄荷提取液、0.00015%的乳酸链球菌素混合均匀，得调配液；其中，枸杞提取液其是称取枸杞采用去离子水冲洗后，按照料液比1: 40添加去离子水，浸泡3h，蒸煮30min，过滤，收集滤液后进行抽滤，澄清透过液即得枸杞提取液；薄荷提取液其称取薄荷采用去离子水冲洗后，按照料液比1: 40添加去离子水，浸泡3h，打浆，蒸煮30min，过滤，收集滤液后进行抽滤，澄清透过液即为薄荷提取液；
（8）、灭菌
将步骤（7）中得到的调配液经孔径为0.5微米的精滤膜精滤后，进行高温瞬时灭菌，其灭菌温度为140℃，灭菌时间为4s；
（9）、灌装
将步骤（8）中得到的灭菌后的精滤液用灌装机按每瓶120g进行分瓶真空灌装，其真空度为0.04Mpa，灌装温度控制在75℃，封口，获得类海胆肽口服液。
本实施例得到随机基因编码的随机蛋白的氨基酸组成与海胆黄细胞的氨基酸组成基本类似，营养价值高和抗氧化功效好。将类海胆肽与枸杞提取液和薄荷提取液进行调配，得到类海胆肽口服液含有丰富的枸杞多糖、有机酸、苷类和黄酮类物质，其抗氧化活性高，口感淳厚，酸甜适中。该制备方法工艺合理，操作可行。