一种柞蚕血液DNA提取方法与流程

本发明涉及分子生物学技术领域，是一种柞蚕血液DNA提取方法。

背景技术：

DNA（Deoxyribonucleic acid）又称脱氧核糖核酸，是生物体的重要组成部分，是生命科学研究的物质基础。高质量的基因组DNA是进行分子标记、基因克隆及基因表达研究等下游技术的必要前提。因此DNA的分离纯化成为分子生物学研究中的一个重要环节。

柞蚕（Antheraea pernyi）属于鳞翅目大蚕蛾科的泌丝昆虫，是我国特有的一种具有重要经济价值的昆虫资源。近年来，分子生物学技术在柞蚕等昆虫研究中得到迅猛发展，其中基因组DNA提取是分子生物学实验的基础，而开展这些研究的基础工作之一就是基因组的提取。

现有的研究中大多从中肠、丝腺、蚕蛹组织中提取DNA。这些样本材料的DNA提取或是需要液氮进行研磨或是需要长时间的消化处理，整个DNA提取耗时耗力。且这些样品中含有大量的脂肪和蛋白质类物质等杂质，这些物质易与DNA结合形成粘稠的胶状物，影响基因组DNA的提取。又易抑制Tag酶活性，从而影响PCR等实验反应，进而影响实验结果。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种科学合理，实用性强，方便、省时、省力、效果好、简便易行、高效的柞蚕血液DNA提取方法。

解决其技术问题采用的技术方案是：一种柞蚕血液DNA提取方法，其特征在于，它包括以下步骤：

1）柞蚕血液处理：将1.3 ml柞蚕血液置入离心机中，在12000rpm条件下，离心8min，弃去上清液，得到白色沉淀物；

2）向所述白色沉淀物中加入提取缓冲液，白色沉淀物与提取缓冲液的体积比例为1:25~30，得到混合液I；

3）向所述混合液I中加入蛋白酶K和核糖核酸酶A，经50~60℃条件下恒温振荡1~2h，使所述混合液I中蛋白酶K终浓度为0.38mg/ml、核糖核酸酶A终浓度为0.038mg/ml，得到裂解混合液Ⅱ；

4）向所述裂解混合液Ⅱ中加入氯仿-异戊醇混合液，氯仿-异戊醇混合液与裂解混合液Ⅱ的体积比例为1:1，使用离心机，在12000rpm条件下离心8min，得到第一上清液；

5）向所述第一上清液中加入无水乙醇，第一上清液与无水乙醇的体积比例为1:2.5，-20~-25℃静止30min，使用离心机，在12000rpm条件下离心8min，得到无色透明、胶状柞蚕DNA；

6）无色透明、胶状柞蚕DNA经0.5ml，70%浓度的乙醇洗涤，弃去上清后，晾干；

7）将晾干的无色、透明胶状柞蚕DNA完全溶解于0.05ml 的TE缓冲液，得到无色透明柞蚕DNA溶液。

每1L所述提取缓冲液中，含有10 mmol的Tris-HCl、10 mmol的EDTA、100 mmol的NaCl、2% 的SDS、0.039 mol的DTT，余量为水，水采用DNase/RNase-Free去离子水，提取缓冲液的pH=8.0。

所述氯仿-异戊醇混合液中，氯仿与异戊醇的体积比为24:1。

每1L所述TE缓冲液中，含有10 mmol的Tris-HCl、1mmol的EDTA，余量为水，水采用DNase/RNase-Free去离子水，TE缓冲液的pH=8.0。

向所述无色透明、胶状柞蚕DNA溶液中加入70%乙醇洗涤，弃去上清后，在12000rpm条件下离心0.5~1min，吸除70%乙醇后，晾干，得到无透明、胶状柞蚕DNA。

本发明的一种柞蚕血液DNA提取方法，由于采用柞蚕血液提取DNA，且提取步骤科学合理，实用性强，方便、省时、省力、简便易行、高效、成本低，提取的DNA效果佳、质量好。尤其适合野外DNA提取、现场应急以及生产样本的检测的迫切需要和实验室进行小型规模的DNA提取或商业公司试剂盒生产。

附图说明

图1为本发明实验例中柞蚕基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的一种柞蚕血液DNA提取方法进行详细的描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明的一种柞蚕血液DNA提取方法，包括以下步骤：

1）柞蚕血液处理：将1.3 ml柞蚕血液置入离心机中，在12000rpm条件下，离心8min，弃去上清液，得到白色沉淀物；

2）向所述白色沉淀物中加入提取缓冲液，白色沉淀物与提取缓冲液的体积比例为1:25~30，得到混合液I；

3）向所述混合液I中加入蛋白酶K和核糖核酸酶A，经50~60℃条件下恒温振荡1~2h，使所述混合液I中蛋白酶K终浓度为0.38mg/ml、核糖核酸酶A终浓度为0.038mg/ml，得到裂解混合液Ⅱ；

4）向所述裂解混合液Ⅱ中加入氯仿-异戊醇混合液，氯仿-异戊醇混合液与裂解混合液Ⅱ的体积比例为1:1，使用离心机，在12000rpm条件下离心8min，得到第一上清液；

5）向所述第一上清液中加入无水乙醇，第一上清液与无水乙醇的体积比例为1:2.5，-20~-25℃静止30min，使用离心机，在12000rpm条件下离心8min，得到无色透明、胶状柞蚕DNA；

6）无色透明、胶状柞蚕DNA经0.5ml，70%浓度的乙醇洗涤，弃去上清后，晾干；

7）将晾干的无色、透明胶状柞蚕DNA完全溶解于0.05ml 的TE缓冲液，得到无色透明柞蚕DNA溶液。

每1L所述提取缓冲液中，含有10 mmol的Tris-HCl、10 mmol的EDTA、100 mmol的NaCl、2% 的SDS、0.039 mol的DTT，余量为水，水采用DNase/RNase-Free去离子水，提取缓冲液的pH=8.0。

所述氯仿-异戊醇混合液中，氯仿与异戊醇的体积比为24:1。

每1L所述TE缓冲液中，含有10 mmol的Tris-HCl、1mmol的EDTA，余量为水，水采用DNase/RNase-Free去离子水，TE缓冲液的pH=8.0。

向所述无色透明、胶状柞蚕DNA溶液中加入70%乙醇洗涤，弃去上清后，在12000rpm条件下离心0.5min，吸除70%乙醇后，晾干，得到无透明、胶状柞蚕DNA。

实施例1：实施例1的一种柞蚕血液DNA提取方法，包括：

一、溶液配置

（1）提取缓冲液：每1L提取缓冲液中，含有10 mmol的Tris-HCl、10 mmol的EDTA、100 mmol的NaCl、2% 的SDS、0.039 mol的DTT，余量为水，水采用DNase/RNase-Free去离子水，提取缓冲液的pH=8.0；

（2）氯仿-异戊醇：体积比为24:1的氯仿异戊醇混合溶液；

（3）70%乙醇溶液：体积比7:3的乙醇、DNase/RNase-Free去离子水混合溶液；

（4）TE缓冲液：每1L所述TE缓冲液中，含有10 mmol的Tris-HCl、1mmol的EDTA，余量为水，水采用DNase/RNase-Free去离子水，TE缓冲液的pH=8.0；

二、柞蚕DNA的提取

1）柞蚕血液处理：取柞蚕4~5龄幼虫血液1.3ml置入离心机中，在12000rpm条件下，离心8min，弃去上清液，得到白色沉淀物；

2）向白色沉淀物中加入1.3ml提取缓冲液，充分振荡、混匀，将沉淀溶解于提取缓冲液，得到混合液I；

3）向混合液I中加入蛋白酶K 0.5mg、核糖核酸酶A 0.05mg，置于50℃条件下恒温振荡1h，使蛋白酶K终浓度为0.38mg/ml、核糖核酸酶A终浓度为0.038mg/ml，得到裂解混合液Ⅱ；

4）取0.6ml裂解混合液Ⅱ移入新的1.5ml离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，混匀，静置5min，于12000rpm条件下离心8min；

5）取0.3ml上清液移入新的1.5ml离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，置于-20℃条件下放置30min，于12000rpm条件下离心8min，弃去上清液，得到无色透明、胶状柞蚕DNA；

6）向上述装有无色透明、胶状柞蚕DNA的1.5ml离心管中加入0.5ml 的70%乙醇溶液，平置离心管轻微旋转后，弃去上清，于12000rpm条件下离心0.5min，吸取上清液并弃去，晾干柞蚕DNA；

7）向上述装有干燥的柞蚕DNA的1.5ml离心管中加入0.05ml 的TE缓冲液，轻微震荡， 使柞蚕DNA完全溶解于TE溶液，置于-20℃条件下保存。

实施例2：实施例2的一种柞蚕血液DNA提取方法，包括：

一、溶液配置与实施例1相同；

二、柞蚕DNA的提取

1）柞蚕血液处理：取柞蚕4~5龄幼虫血液1.3ml置入离心机中，在12000rpm条件下，离心8min，弃去上清液，得到白色沉淀物；

2）向白色沉淀物中加入1.3ml提取缓冲液，充分振荡、混匀，将沉淀溶解于提取缓冲液，得到混合液I；

3）向混合液I中加入蛋白酶K 0.5mg、核糖核酸酶A 0.05mg，置于55℃条件下恒温振荡1.5h，使蛋白酶K终浓度为0.38mg/ml、核糖核酸酶A终浓度为0.038mg/ml，得到裂解混合液Ⅱ；

4）取0.6ml裂解混合液Ⅱ移入新的1.5ml离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，混匀，静置5min，于12000rpm条件下离心8min；

5）取0.3ml上清液移入新的1.5ml离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，置于-22.5℃条件下放置30min，于12000rpm条件下离心8min，弃去上清液，得到无色透明、胶状柞蚕DNA；

6）向上述装有无色透明、胶状柞蚕DNA的1.5ml离心管中加入0.5ml 的70%乙醇溶液，平置离心管轻微旋转后，弃去上清，于12000rpm条件下离心0.5min，吸取上清液并弃去，晾干柞蚕DNA；

7）向上述装有干燥的柞蚕DNA的1.5ml离心管中加入0.05ml 的TE缓冲液，轻微震荡， 使柞蚕DNA完全溶解于TE溶液，置于-20℃条件下保存。

实施例3：实施例3的一种柞蚕血液DNA提取方法，包括：

一、溶液配置与实施例1相同；

二、柞蚕DNA的提取

1）柞蚕血液处理：取柞蚕4~5龄幼虫血液1.3ml置入离心机中，在12000rpm条件下，离心8min，弃去上清液，得到白色沉淀物；

2）向白色沉淀物中加入1.3ml提取缓冲液，充分振荡、混匀，将沉淀溶解于提取缓冲液，得到混合液I；

3）向混合液I中加入蛋白酶K 0.5mg、核糖核酸酶A 0.05mg，置于60℃条件下恒温振荡2h，使蛋白酶K终浓度为0.38mg/ml、核糖核酸酶A终浓度为0.038mg/ml，得到裂解混合液Ⅱ；

4）取0.6ml裂解混合液Ⅱ移入新的1.5ml离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，混匀，静置5min，于12000rpm条件下离心8min；

5）取0.3ml上清液移入新的1.5ml离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，置于-25℃条件下放置30min，于12000rpm条件下离心8min，弃去上清液，得到无色透明、胶状柞蚕DNA；

6）向上述装有无色透明、胶状柞蚕DNA的1.5ml离心管中加入0.5ml 的70%乙醇溶液，平置离心管轻微旋转后，弃去上清，于12000rpm条件下离心0.5min，吸取上清液并弃去，晾干柞蚕DNA；

7）向上述装有干燥的柞蚕DNA的1.5ml离心管中加入0.05ml 的TE缓冲液，轻微震荡， 使柞蚕DNA完全溶解于TE溶液，置于-20℃条件下保存。

实施例4：实施例4的一种柞蚕血液DNA提取方法，包括：

一、溶液配置与实施例1相同；

二、柞蚕DNA的提取

1）柞蚕血液处理：取柞蚕4~5龄幼虫血液1.3ml置入离心机中，在12000rpm条件下，离心8min，弃去上清液，得到白色沉淀物；

2）向白色沉淀物中加入1.3ml提取缓冲液，充分振荡、混匀，将沉淀溶解于提取缓冲液，得到混合液I；

3）向混合液I中加入蛋白酶K 0.5mg、核糖核酸酶A 0.05mg，置于50℃条件下恒温振荡1h，使蛋白酶K终浓度为0.38mg/ml、核糖核酸酶A终浓度为0.038mg/ml，得到裂解混合液Ⅱ；

4）取0.6ml裂解混合液Ⅱ移入新的1.5ml离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，混匀，静置5min，于12000rpm条件下离心8min；

5）取0.3ml上清液移入新的1.5ml离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，置于-20℃条件下放置30min，于12000rpm条件下离心8min，弃去上清液，得到无色透明、胶状柞蚕DNA；

6）向上述装有无色透明、胶状柞蚕DNA的1.5ml离心管中加入0.5ml 的70%乙醇溶液，平置离心管轻微旋转后，弃去上清，于12000rpm条件下离心0.5min，吸取上清液并弃去，晾干柞蚕DNA；

7）向上述装有干燥的柞蚕DNA的1.5ml离心管中加入0.05ml 的TE缓冲液，轻微震荡， 使柞蚕DNA完全溶解于TE溶液，置于-20℃条件下保存。

实施例5：实施例5的一种柞蚕血液DNA提取方法，包括：

一、溶液配置与实施例1相同；

二、柞蚕DNA的提取

1）柞蚕血液处理：取柞蚕4~5龄幼虫血液1.3ml置入离心机中，在12000rpm条件下，离心8min，弃去上清液，得到白色沉淀物；

2）向白色沉淀物中加入1.3ml提取缓冲液，充分振荡、混匀，将沉淀溶解于提取缓冲液，得到混合液I；

3）向混合液I中加入蛋白酶K 0.5mg、核糖核酸酶A 0.05mg，置于55℃条件下恒温振荡1.5h，使蛋白酶K终浓度为0.38mg/ml、核糖核酸酶A终浓度为0.038mg/ml，得到裂解混合液Ⅱ；

4）取0.6ml裂解混合液Ⅱ移入新的1.5ml离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，混匀，静置5min，于12000rpm条件下离心8min；

5）取0.3ml上清液移入新的1.5ml离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，置于-22.5℃条件下放置30min，于12000rpm条件下离心8min，弃去上清液，得到无色透明、胶状柞蚕DNA；

6）向上述装有无色透明、胶状柞蚕DNA的1.5ml离心管中加入0.5ml 的70%乙醇溶液，平置离心管轻微旋转后，弃去上清，于12000rpm条件下离心0.5min，吸取上清液并弃去，晾干柞蚕DNA；

7）向上述装有干燥的柞蚕DNA的1.5ml离心管中加入0.05ml 的TE缓冲液，轻微震荡， 使柞蚕DNA完全溶解于TE溶液，置于-20℃条件下保存。

实施例6：实施例6的一种柞蚕血液DNA提取方法，包括：

一、溶液配置与实施例1相同；

二、柞蚕DNA的提取

1）柞蚕血液处理：取柞蚕4~5龄幼虫血液1.3ml置入离心机中，在12000rpm条件下，离心8min，弃去上清液，得到白色沉淀物；

2）向白色沉淀物中加入1.3ml提取缓冲液，充分振荡、混匀，将沉淀溶解于提取缓冲液，得到混合液I；

3）向混合液I中加入蛋白酶K 0.5mg、核糖核酸酶A 0.05mg，置于60℃条件下恒温振荡2h，使蛋白酶K终浓度为0.38mg/ml、核糖核酸酶A终浓度为0.038mg/ml，得到裂解混合液Ⅱ；

4）取0.6ml裂解混合液Ⅱ移入新的1.5ml离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，混匀，静置5min，于12000rpm条件下离心8min；

5）取0.3ml上清液移入新的1.5ml离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，置于-25℃条件下放置30min，于12000rpm条件下离心8min，弃去上清液，得到无色透明、胶状柞蚕DNA；

6）向上述装有无色透明、胶状柞蚕DNA的1.5ml离心管中加入0.5ml 的70%乙醇溶液，平置离心管轻微旋转后，弃去上清，于12000rpm条件下离心0.5min，吸取上清液并弃去，晾干柞蚕DNA；

7）向上述装有干燥的柞蚕DNA的1.5ml离心管中加入0.05ml 的TE缓冲液，轻微震荡， 使柞蚕DNA完全溶解于TE溶液，置于-20℃条件下保存。

图1为本发明实验例中柞蚕基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图，其中1号泳道是15000标准分子量（天根生化科技有限公司），2号泳道是本发明实施例1中提取的柞蚕4~5龄幼虫血液，3号泳道是本发明实施例4中提取的柞蚕蛹期血液，4号泳道是未实施本发明例1-3中提取的柞蚕4~5龄幼虫血液，5号泳道是未实施本发明例4-6中提取的柞蚕蛹期血液。

本发明的具体实施方式仅为有限的实施例，并非穷举，本领域技术人员不经过创造性劳动的简单复制和改进仍属于本发明权利要求所保护的范围。