一种从动物血液中提取超氧化物歧化酶的方法
【专利摘要】一种从动物血液中提取超氧化物歧化酶的方法，包括下列步骤：A.血液分离；B.溶血破碎细胞；C.热变性；D.压滤；E.超滤浓缩；F.沉淀除杂蛋白。本发明彻底摒弃了氯仿、乙醇和丙酮等有机溶剂，根据SOD分子的结构特点及理化性质，采用热变性和金属盐沉淀的方法，简便的分离出具有较高活力的粗品SOD，这是对SOD生产的是革命性的改进。由于不使用任何有机溶剂，所以该方法成本低廉，更适合于工业化生产。本发明由于采用热变性除血红蛋白，因此可以在常温下溶血，使操作更简便，降低能耗。
【专利说明】一种从动物血液中提取超氧化物歧化酶的方法
(—)【技术领域】
[0001]本发明涉及一种从动物血液中提取超氧化物歧化酶的方法。
(二)【背景技术】
[0002]超氧化物歧化酶(SOD)是普遍存在于生物体内的一种能清除超氧阴离子自由基的金属酶，具有抗炎症、抗辐射、抗肿瘤等多种功能，现已被广泛应用于医药、食品、保健食品和化妆品中。
[0003]目前从动物血液中提取超氧化物歧化酶的工艺流程主要是血液抗凝一用生理盐水洗涤一低温溶血一氯仿乙醇抽提血红蛋白一磷酸钾萃取一热变性一丙酮沉淀一离子交换层析一分子筛柱层析。该工艺缺点是流程复杂，成本高昂，且氯仿、丙酮等有机溶剂具有较强的毒性，对环境具有严重污染，对操作人员身体亦造成不可估量的损害。
(三)
【发明内容】
[0004]为了克服现有从动物血液中提取超氧化物歧化酶的方法的上述不足，本发明提供一种工艺简单，成本低廉，不使用任何有机溶剂，对环保和操作人员身体健康有利的从动物血液中提取超氧化物歧化酶的方法。
[0005]本发明解决其技术问题的技术方案是:一种从动物血液中提取超氧化物歧化酶的方法，包括下列步骤:
[0006]A.血液分离:取动物新鲜血液，加入质量浓度为5?13%的柠檬酸钠溶液，柠檬酸钠溶液的体积为血液体积的5?10%，`经抗凝处理后经连续流离心机离心收集红细胞，泵入水解反应罐；
[0007]B.溶血破碎细胞:向步骤A收集的红细胞中加入I?3倍体积的纯净水，使红细胞完全破碎，得红细胞溶血液；
[0008]C.热变性:将红细胞溶血液加热至60°C保温10?30分钟后，再向红细胞溶血液中加入用以提高溶液的离子强度的碱金属盐，至碱金属盐浓度为0.1?0.6mol/L，继续加热至65°C，保温20?60分钟后，再升温至70?75°C，保温15至20分钟，立即放料冷却；
[0009]D.压滤:用800目滤布对经步骤C处理的红细胞溶血液进行机械压滤，滤液为SOD粗提液；
[0010]E.超滤浓缩:S0D粗提液先经超滤膜预处理拦截分子量大于100万的大分子蛋白和细胞膜碎片，然后经截留分子量8000孔径的超滤膜反复超滤，去除水分、无机盐和小分子杂蛋白，直至浓缩到SOD粗提液体积的2%?12%，即为SOD浓缩液；
[0011]F.沉淀除杂蛋白:向步骤E所得的SOD浓缩液中加入金属盐，至该金属盐浓度为I?5mmol/L，搅拌均匀后静置沉淀，离心去沉淀，上清液经超滤脱盐后获得SOD粗品。
[0012]优选的，在步骤F中，获得的SOD粗品经离子交换层析后再经分子筛层析后获得SOD精品。[0013]优选的，在步骤C中，所述的碱金属盐为碱金属的氯化物中的一种或几种的混合物。
[0014]优选的，在步骤F中，所述的金属盐为铜盐或锌盐中的一种或几种的混合物。
[0015]优选的，在步骤B中采用高压匀浆使红细胞完全破碎或采用搅拌机搅拌使红细胞完全破碎。
[0016]优选的，离子交换层析是DEAE阴离子交换层析，所用的层析填充料为DEAE-Sepharose FF0
[0017]优选的,分子筛层析填充料是Sephadex G-100或Sephadex G_75,层析柱先用纯净水平衡，然后上样，以纯净水洗脱，收集SOD活力峰。
[0018]本发明的有益效果在于:本发明彻底摒弃了氯仿、乙醇和丙酮等有机溶剂，根据SOD分子的结构特点及理化性质，采用热变性和金属盐沉淀的方法，简便的分离出具有较高活力的粗品S0D，这是对 SOD生产的是革命性的改进。由于不使用任何有机溶剂，所以该方法成本低廉，更适合于工业化生产。本发明由于采用热变性除血红蛋白，因此可以在常温下溶血，使操作更简便，降低能耗。
[0019]本发明在热变性中60°C保温10?30分钟后，再向红细胞溶血液中加入NaCl、KCl等碱金属盐以增加溶液离子强度，使得热变性更彻底，杂蛋白去除更完全，同时最大限度的保持原有的SOD活力，得率比传统的氯仿乙醇法更高。碱金属盐在热变性对SOD有保护作用，碱金属盐的加入，增加了红细胞溶血液的离子强度，适当的离子强度可以抑制变性的血红蛋白沉淀吸附S0D，使SOD抽提更完全，同时高盐浓度对SOD有一定的保护作用，上述两大优势提高了 SOD的得率。
[0020]本发明改进了原有的丙酮一次沉淀或分级沉淀的方法，因丙酮沸点低，容易挥发，在操作过程中对操作人员身体健康有严重影响，同时回收过程中损失大，成本高，对生产环境污染严重。在生产工艺中，尽可能不使用有机溶剂。我们替代的是金属盐沉淀杂蛋白，这样，即降低了生产成本，有利环保和操作人员身体健康，又提高了 SOD的活性。
(四)【具体实施方式】
[0021 ] 下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
[0022]实施例一
[0023]新鲜猪血1000L加入50L浓度为8%的柠檬酸钠溶液抗凝，用连续流离心机分离得450L红细胞和600L血浆。血浆喷雾干燥成为血浆蛋白粉。红细胞泵入反应罐中，同时加入1200L的蒸馏水用搅拌机搅拌30分钟，使红细胞充分破碎溶血。加温至60°C保温15分钟后，搅拌下加入37Kg氯化钠，升温到65°C并保温30min，再升温至72°C，继续加温20分钟，迅速水冷至30°C以下。用800目滤布进行压滤得SOD粗提液共1300L，单位活力220U/ml。SOD粗提液泵入超滤储罐，先经超滤膜预处理拦截分子量大于100万的大分子蛋白和细胞膜碎片，然后经截留分子量8000孔径的超滤膜反复超滤，去除水分、无机盐和小分子杂蛋白，最后SOD浓缩液体积为40L，单位活力为6420U/ml。SOD浓缩液再加入60克CuCl2,充分搅拌后，静置2小时离心去沉淀，收集上清液。再经超滤脱盐。脱盐后冷冻干燥得到比活3150U/mg蛋白的SOD粗品52g，密封包装后_20°C冷冻保存。
[0024]实施例二[0025]新鲜鸭血2000L用100L浓度为10%的柠檬酸钠溶液抗凝，用连续流离心机分离得830L红细胞和1270L血浆。将红细胞置于反应罐中，加入1660L蒸馏水，高压匀浆20分钟，使红细胞完全破碎。继续搅拌下升温到60°C保温15分钟，加入氯化钠58Kg，升温到65°C继续保温30分钟，再提高温度至70°C，再保温20分钟，快速放料冷却。800目滤布机械压滤得SOD粗提液1900L，单位活力270U/ml。SOD粗提液泵入超滤储罐，先经超滤膜预处理拦截分子量大于100万的大分子蛋白和细胞膜碎片，然后经截留分子量8000孔径的超滤膜反复超滤，去除水分、无机盐和小分子杂蛋白，最后SOD浓缩液体积为200L，单位活力为6440U/ml。搅拌下加入氯化铜150克，继续搅拌均匀后静置沉淀，沉淀液经连续流离心机离心，取上清液超滤脱盐。
[0026]脱盐后的样品上DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析(φ300 X600mm)。层析柱装好以后用pH为7.6的2.5mM的磷酸缓冲液平衡至少三倍柱体积，上样后用该缓冲液淋洗至280nm无光吸收，换含0.04mol/L氯化钠的2.5mM的磷酸缓冲液洗脱，收集SOD活力峰，体积52L左右SOD液，单位活力6500U/ml，比活力5500U/mg蛋白。
[0027]阴离子交换洗脱的SOD样品液上分子筛S印hadex GlOO ((p60X800mm)，用蒸馏水平衡，用蒸馏水洗脱。收集活性峰部分，得SOD精品，单位活力24000U/ml，比活力7900U/mg蛋白。冻干得浅蓝色SOD冻干粉36.5g，密封包装后_20°C冷冻保存。
[0028]实施例三
[0029]一种从动物血液中提取超氧化物歧化酶的方法，包括下列步骤:
[0030]A.血液分离 :取新鲜鸡血，加入质量浓度为10%的柠檬酸钠溶液，柠檬酸钠溶液的体积为血液体积的6.5%，经抗凝处理后经连续流离心机离心收集红细胞，泵入水解反应te ；
[0031]B.溶血破碎细胞:向步骤A收集的红细胞中加入1.5倍体积的纯净水，高压匀浆使红细胞完全破碎，得红细胞溶血液；
[0032]C.热变性:将红细胞溶血液加热至60°C保温10分钟后，再向红细胞溶血液中加入用以提高溶液的离子强度的NaCl，至NaCl浓度为0.55mol/L,继续加热至65°C，保温50分钟后，再升温至75°C，保温16分钟，立即放料水冷；
[0033]D.压滤:用800目滤布对经步骤C处理的红细胞溶血液进行机械压滤，滤液为SOD粗提液，单位活力250U/ml ；
[0034]E.超滤浓缩:S0D粗提液先经超滤膜预处理拦截分子量大于100万的大分子蛋白和细胞膜碎片，然后经截留分子量8000孔径的超滤膜反复超滤，去除水分、无机盐和小分子杂蛋白，直至浓缩到SOD粗提液体积的4%，即为SOD浓缩液，单位活力6425U/ml ；
[0035]F.沉淀除杂蛋白:向步骤E所得的SOD浓缩液中加入CuCl2，至CuCl2浓度为5mmol/L,搅拌均匀后静置沉淀，离心去沉淀，上清液经超滤脱盐后获得SOD粗品，比活2160U/mg 蛋白。
[0036]实施例四
[0037]一种从动物血液中提取超氧化物歧化酶的方法，包括下列步骤:
[0038]A.血液分离:取新鲜鸭血，加入质量浓度为13%的柠檬酸钠溶液，柠檬酸钠溶液的体积为血液体积的8%，经抗凝处理后经连续流离心机离心收集红细胞，泵入水解反应te ；[0039]B.溶血破碎细胞:向步骤A收集的红细胞中加入3倍体积的纯净水，高压匀浆使红细胞完全破碎，得红细胞溶血液；
[0040]C.热变性:将红细胞溶血液加热至60°C保温15分钟后，再向红细胞溶血液中加入用以提高溶液的离子强度的KC1，至KCl浓度为0.lmol/L，继续加热至65°C，保温30分钟后，再升温至70°C，保温18分钟，立即放料水冷；
[0041 ] D.压滤:用800目滤布对经步骤C处理的红细胞溶血液进行机械压滤，滤液为SOD粗提液，单位活力230U/ml ；
[0042]E.超滤浓缩:S0D粗提液先经超滤膜预处理拦截分子量大于100万的大分子蛋白和细胞膜碎片，然后经截留分子量8000孔径的超滤膜反复超滤，去除水分、无机盐和小分子杂蛋白，直至浓缩到SOD粗提液体积的6%，即为SOD浓缩液，单位活力6410U/ml ；
[0043]F.沉淀除杂蛋白:向步骤E所得的SOD浓缩液中加入ZnCl2，至ZnCl2浓度为
3.5mmol/L，搅拌均匀后静置沉淀，离心去沉淀，上清液经超滤脱盐后获得SOD粗品，比活2820U/mg 蛋白。
[0044]脱盐后的SOD粗品上DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析(φ300Χ600mm)。层析柱装好以后用pH为7.6的2.5mM的磷酸缓冲液平衡至少三倍柱体积，上样后用该缓冲液淋洗至280nm无光吸收,换含0.04mol/L氯化钠的2.5mM的磷酸缓冲液洗脱,收集SOD活力峰，得SOD液样品液，单位活力6450U/ml，比活力5430U/mg蛋白。
[0045]阴离子交换洗脱的SOD样品液上分子筛S印hadex GlOO (φ60Χ 800mm)，用蒸馏水平衡，用蒸馏水洗脱。收集活性峰部分，得SOD精品，单位活力23200U/ml，比活力7200U/mg蛋白。冻干得浅蓝色SOD冻干粉，密封包装后_20°C冷冻保存。
[0046]实施例五
[0047]一种从动物血液中提取超氧化物歧化酶的方法，包括下列步骤:
[0048]A.血液分离:取新鲜牛血，加入质量浓度为5%的柠檬酸钠溶液，柠檬酸钠溶液的体积为血液体积的5%，经抗凝处理后经连续流离心机离心收集红细胞，泵入水解反应罐；
[0049]B.溶血破碎细胞:向步骤A收集的红细胞中加入2.2倍体积的纯净水，高压匀浆使红细胞完全破碎，得红细胞溶血液；
[0050]C.热变性:将红细胞溶血液加热至60°C保温20分钟后，再向红细胞溶血液中加入用以提高溶液的离子强度的NaBr，至NaBr浓度为0.5mol/L,继续加热至65°C，保温20分钟后，再升温至72.5°C，保温20分钟，立即放料自然冷却；
[0051 ] D.压滤:用800目滤布对经步骤C处理的红细胞溶血液进行机械压滤，滤液为SOD粗提液，单位活力260U/ml ；
[0052]E.超滤浓缩:S0D粗提液先经超滤膜预处理拦截分子量大于100万的大分子蛋白和细胞膜碎片，然后经截留分子量8000孔径的超滤膜反复超滤，去除水分、无机盐和小分子杂蛋白，直至浓缩到SOD粗提液体积的2%，即为SOD浓缩液，单位活力6500U/ml ；
[0053]F.沉淀除杂蛋白:向步骤E所得的SOD浓缩液中加入CuSO4，至CuSO4浓度为lmmol/L,搅拌均匀后静置沉淀，离心去沉淀，上清液经超滤脱盐后获得SOD粗品，比活2600U/mg 蛋白。
[0054]实施例六
[0055]一种从动物血液中提取超氧化物歧化酶的方法，包括下列步骤:[0056]A.血液分离:取新鲜羊血，加入质量浓度为6%的柠檬酸钠溶液，柠檬酸钠溶液的体积为血液体积的8%，经抗凝处理后经连续流离心机离心收集红细胞，泵入水解反应罐；
[0057]B.溶血破碎细胞:向步骤A收集的红细胞中加入2倍体积的纯净水，采用搅拌机搅拌使红细胞完全破碎，得红细胞溶血液；
[0058]C.热变性:将红细胞溶血液加热至60°C保温30分钟后，再向红细胞溶血液中加入用以提高溶液的离子强度的KBr，至KBr浓度为0.4mol/L,继续加热至65°C，保温60分钟后，再升温至72°C，保温15分钟，立即放料自然冷却；
[0059]D.压滤:用800目滤布对经步骤C处理的红细胞溶血液进行机械压滤，滤液为SOD粗提液，单位活力240U/ml ；
[0060]E.超滤浓缩:S0D粗提液先经超滤膜预处理拦截分子量大于100万的大分子蛋白和细胞膜碎片，然后经截留分子量8000孔径的超滤膜反复超滤，去除水分、无机盐和小分子杂蛋白，直至浓缩到SOD粗提液体积的10%，即为SOD浓缩液，单位活力6450U/ml ；
[0061]F.沉淀除杂蛋白:向步骤E所得的SOD浓缩液中加入ZnSO4，至ZnSO4浓度为
3.5mmol/L，搅拌均匀后静置沉淀，离心去沉淀，上清液经超滤脱盐后获得SOD粗品，比活3190U/mg 蛋白。
[0062]脱盐后的SOD粗品上DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析(φ300Χ600mm)。层析柱装好以后用pH为7.6的2.5mM的磷酸缓冲液平衡至少三倍柱体积,上样后用该缓冲液淋洗至280nm无光吸收,换含0.04mol/L氯化钠的2.5mM的磷酸缓冲液洗脱,收集SOD活力峰，得SOD液样品液，单位活力6460U/ml，比活力5450U/mg蛋白。
[0063]阴离子交换洗脱的.SOD样品液上分子筛S印hadex GlOO (φ60X 800mm)，用蒸馏水平衡，用蒸馏水洗脱。收集活性峰部分，得SOD精品，单位活力23300U/ml，比活力8560U/mg蛋白。冻干得浅蓝色SOD冻干粉，密封包装后_20°C冷冻保存。
[0064]实施例七
[0065]一种从动物血液中提取超氧化物歧化酶的方法，包括下列步骤:
[0066]A.血液分离:取新鲜猪血，加入质量浓度为12%的柠檬酸钠溶液，柠檬酸钠溶液的体积为血液体积的10%，经抗凝处理后经连续流离心机离心收集红细胞，泵入水解反应te ；
[0067]B.溶血破碎细胞:向步骤A收集的红细胞中加入I倍体积的纯净水，采用搅拌机搅拌使红细胞完全破碎，得红细胞溶血液；
[0068]C.热变性:将红细胞溶血液加热至60°C保温28分钟后，再向红细胞溶血液中加入用以提高溶液的离子强度的碱金属盐，本实施例中该碱金属盐为NaCl、KCl的混合物，其中NaCl与KCl的质量比为2:1 (碱金属盐起到提高溶液的离子强度的作用，因此若碱金属盐是混合物，组分之间的比例关系并不影响其做起的作用)，至碱金属盐浓度为0.2mol/L,继续加热至65°C，保温40分钟后，再升温至71°C，保温19分钟，立即放料水冷；
[0069]D.压滤:用800目滤布对经步骤C处理的红细胞溶血液进行机械压滤，滤液为SOD粗提液，单位活力220U/ml ；
[0070]E.超滤浓缩:S0D粗提液先经超滤膜预处理拦截分子量大于100万的大分子蛋白和细胞膜碎片，然后经截留分子量8000孔径的超滤膜反复超滤，去除水分、无机盐和小分子杂蛋白，直至浓缩到SOD粗提液体积的4%，即为SOD浓缩液，单位活力6400U/ml ；[0071]F.沉淀除杂蛋白:向步骤E所得的SOD浓缩液中加入Cu(NO3)2，至Cu(NO3)2浓度为5mmol/L，搅拌均匀后静置沉淀，离心去沉淀，上清液经超滤脱盐后获得SOD粗品，比活3100U/mg 蛋白。
[0072]实施例八
[0073]一种从动物血液中提取超氧化物歧化酶的方法，包括下列步骤:
[0074]A.血液分离:取新鲜鹅血，加入质量浓度为9%的柠檬酸钠溶液，柠檬酸钠溶液的体积为血液体积的6%，经抗凝处理后经连续流离心机离心收集红细胞，泵入水解反应罐；
[0075]B.溶血破碎细胞:向步骤A收集的红细胞中加入1.2倍体积的纯净水，采用高压匀浆使红细胞完全破碎，得红细胞溶血液；
[0076]C.热变性:将红 细胞溶血液加热至60°C保温25分钟后，再向红细胞溶血液中加入用以提高溶液的离子强度的碱金属盐，本实施例中该碱金属盐为NaCl、KBr的混合物，其中NaCl与KBrl的质量比为1: 2 (碱金属盐起到提高溶液的离子强度的作用，因此若碱金属盐是混合物，组分之间的比例关系并不影响其做起的作用)，至碱金属盐浓度为0.6mol/L,继续加热至65°C，保温35分钟后，再升温至74.5°C，保温17分钟，立即放料水冷；
[0077]D.压滤:用800目滤布对经步骤C处理的红细胞溶血液进行机械压滤，滤液为SOD粗提液，单位活力260U/ml ；
[0078]E.超滤浓缩:S0D粗提液先经超滤膜预处理拦截分子量大于100万的大分子蛋白和细胞膜碎片，然后经截留分子量8000孔径的超滤膜反复超滤，去除水分、无机盐和小分子杂蛋白，直至浓缩到SOD粗提液体积的12%，即为SOD浓缩液，单位活力6510U/ml ；
[0079]F.沉淀除杂蛋白:向步骤E所得的SOD浓缩液中加入Zn(NO3)2,至Zn(NO3)2浓度为3mmol/L，搅拌均匀后静置沉淀，离心去沉淀，上清液经超滤脱盐后获得SOD粗品，比活3160U/mg 蛋白。
[0080]脱盐后的SOD粗品上DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析(φ300Χ600mm)。层析柱装好以后用pH为7.6的2.5mM的磷酸缓冲液平衡至少三倍柱体积，上样后用该缓冲液淋洗至280nm无光吸收,换含0.04mol/L氯化钠的2.5mM的磷酸缓冲液洗脱,收集SOD活力峰，得SOD液样品液，单位活力6530U/ml，比活力5510U/mg蛋白。
[0081]阴离子交换洗脱的SOD样品液上分子筛S印hadex GlOO (φ60Χ 800mm)，用蒸馏水平衡，用蒸馏水洗脱。收集活性峰部分，得SOD精品，单位活力24100U/ml，比活力7320U/mg蛋白。冻干得浅蓝色SOD冻干粉，密封包装后_20°C冷冻保存。
[0082]实施例九
[0083]一种从动物血液中提取超氧化物歧化酶的方法，包括下列步骤:
[0084]A.血液分离:取新鲜狗血，加入质量浓度为7%的柠檬酸钠溶液，柠檬酸钠溶液的体积为血液体积的7%，经抗凝处理后经连续流离心机离心收集红细胞，泵入水解反应罐；
[0085]B.溶血破碎细胞:向步骤A收集的红细胞中加入2.6倍体积的纯净水，高压匀浆使红细胞完全破碎，得红细胞溶血液；
[0086]C.热变性:将红细胞溶血液加热至60°C保温11分钟后，再向红细胞溶血液中加入用以提高溶液的离子强度的NaF，至NaF浓度为0.35mol/L,继续加热至65°C，保温25分钟后，再升温至73°C，保温18.5分钟，立即放料自然冷却；
[0087]D.压滤:用800目滤布对经步骤C处理的红细胞溶血液进行机械压滤，滤液为SOD粗提液，单位活力210U/ml ；
[0088]E.超滤浓缩:S0D粗提液先经超滤膜预处理拦截分子量大于100万的大分子蛋白和细胞膜碎片，然后经截留分子量8000孔径的超滤膜反复超滤，去除水分、无机盐和小分子杂蛋白，直至浓缩到SOD粗提液体积的11%，即为SOD浓缩液，单位活力6380U/ml ；
[0089]F.沉淀除杂蛋白:向步骤E所得的SOD浓缩液中加入金属盐，本实施例中该金属盐为CuCl2和ZnCl2的混合物，其中CuCl2和ZnCl2的质量比为3:1 (金属盐起到使SOD与杂蛋白分离的作用，因此金属盐是混合物，组分之间的比例关系并不影响其做起的作用)，至金属盐浓度为2.5mmol/L，搅拌均匀后静置沉淀，离心去沉淀，上清液经超滤脱盐后获得SOD粗品，比活3100U/mg蛋白。
[0090]实施例十
[0091]一种从动物血液中提取超氧化物歧化酶的方法，包括下列步骤:
[0092]A.血液分离:取新鲜兔血，加入质量浓度为8%的柠檬酸钠溶液，柠檬酸钠溶液的体积为血液体积 的9%，经抗凝处理后经连续流离心机离心收集红细胞，泵入水解反应罐；
[0093]B.溶血破碎细胞:向步骤A收集的红细胞中加入2.5倍体积的纯净水，采用搅拌机搅拌使红细胞完全破碎，得红细胞溶血液；
[0094]C.热变性:将红细胞溶血液加热至60°C保温13分钟后，再向红细胞溶血液中加入用以提高溶液的离子强度的KF，至KF为0.3mol/L,继续加热至65°C，保温45分钟后，再升温至74°C，保温16.5分钟，立即放料水冷；
[0095]D.压滤:用800目滤布对经步骤C处理的红细胞溶血液进行机械压滤，滤液为SOD粗提液，单位活力240U/ml ；
[0096]E.超滤浓缩:S0D粗提液先经超滤膜预处理拦截分子量大于100万的大分子蛋白和细胞膜碎片，然后经截留分子量8000孔径的超滤膜反复超滤，去除水分、无机盐和小分子杂蛋白，直至浓缩到SOD粗提液体积的8%，即为SOD浓缩液，单位活力6460U/ml ；
[0097]F.沉淀除杂蛋白:向步骤E所得的SOD浓缩液中加入金属盐，本实施例中该金属盐为CuSO4和Zn (NO3) 2的混合物，其中CuSO4和Zn (NO3) 2的质量比为1:1 (金属盐起到使SOD与杂蛋白分离的作用，因此金属盐是混合物，组分之间的比例关系并不影响其做起的作用)，至金属盐浓度为4.5mmol/L，搅拌均匀后静置沉淀，离心去沉淀，上清液经超滤脱盐后获得SOD粗品，比活3200U/mg蛋白。
[0098]脱盐后的SOD粗品上DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析(φ300Χ600mm)。层析柱装好以后用pH为7.6的2.5mM的磷酸缓冲液平衡至少三倍柱体积，上样后用该缓冲液淋洗至280nm无光吸收,换含0.04mol/L氯化钠的2.5mM的磷酸缓冲液洗脱,收集SOD活力峰，得SOD液样品液，单位活力6500U/ml，比活力5500U/mg蛋白。
[0099]阴离子交换洗脱的SOD样品液上分子筛S印hadex GlOO (φ60X 800mm)，用蒸馏水平衡，用蒸馏水洗脱。收集活性峰部分，得SOD精品，单位活力24200U/ml，比活力7380U/mg蛋白。冻干得浅蓝色SOD冻干粉，密封包装后_20°C冷冻保存。
【权利要求】
1.一种从动物血液中提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于包括下列步骤:A.血液分离:取动物新鲜血液，加入质量浓度为5?13%的柠檬酸钠溶液，柠檬酸钠溶液的体积为血液体积的5?10%，经抗凝处理后经连续流离心机离心收集红细胞，泵入水解反应罐；B.溶血破碎细胞:向步骤A收集的红细胞中加入I?3倍体积的纯净水，使红细胞完全破碎，得红细胞溶血液；C.热变性:将红细胞溶血液加热至60°C保温10?30分钟后，再向红细胞溶血液中加入用以提高溶液的离子强度的碱金属盐，至碱金属盐浓度为0.1?0.6mol/L,继续加热至650C，保温20?60分钟后，再升温至70?75°C，保温15至20分钟，立即放料冷却；D.压滤:用800目滤布对经步骤C处理的红细胞溶血液进行机械压滤，滤液为SOD粗提液；E.超滤浓缩:S0D粗提液先经超滤膜预处理拦截分子量大于100万的大分子蛋白和细胞膜碎片，然后经截留分子量8000孔径的超滤膜反复超滤，去除水分、无机盐和小分子杂蛋白，直至浓缩到SOD粗提液体积的2%?12%，即为SOD浓缩液；F.沉淀除杂蛋白:向步骤E所得的SOD浓缩液中加入金属盐，至该金属盐浓度为I?5mmol/L，搅拌均匀后静置沉淀，离心去沉淀，上清液经超滤脱盐后获得SOD粗品。
2.如权利要求1所述的从动物血液中提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于:在步骤F中，获得的SOD粗品经离子交换层析后再经分子筛层析后获得SOD精品。
3.根据权利要求1 或2所述的从动物血液中提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于:在步骤C中，所述的碱金属盐为碱金属的氯化物中的一种或几种的混合物。
4.如权利要求1或2所述的从动物血液中提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于:在步骤F中，所述的金属盐为铜盐或锌盐中的一种或几种的混合物。
5.如权利要求1或2所述的从动物血液中提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于:在步骤B中采用高压匀浆使红细胞完全破碎或采用搅拌机搅拌使红细胞完全破碎。
6.如权利要求2所述的从动物血液中提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于:离子交换层析是DEAE阴离子交换层析，所用的层析填充料为DEAE-Sepharose FF。
7.如权利要求2所述的从动物血液中提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于:分子筛层析填充料是Sephadex G-100或Sephadex G_75,层析柱先用纯净水平衡,然后上样，以纯净水洗脱，收集SOD活力峰。
【文档编号】C12N9/02GK103436500SQ201310369613
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年8月22日 优先权日:2013年8月22日
【发明者】龚兴国, 秦勇, 聂颢, 韩斌, 应育权 申请人:慈溪市迈康生物科技有限公司