专利名称：从红薯块根中提取过氧化物酶的方法
技术领域：
本发明涉及酶制备技术领域，特别涉及红薯中过氧化物酶的制备，适合于从红薯中制备RZ值大于2的过氧化物酶。
背景技术：
过氧化物酶通过还原H2O2和过氧化物来氧化细胞内的有机和无机的毒性物质。在实际中，过氧化物酶是一个很有用的工具酶，能作为分析酶定量检测，应用于临床化学、环境化学和食品工业领域，如草酸含量检测、乙醇酸含量检测；过氧化物酶还能作为定位检测的工具酶，如用于ELISA检测。由于过氧化物酶是一个很有用的工具酶，在实际应用中，需要高纯度的过氧化物酶，不少研究者试图分离纯化过氧化物酶。过氧化物酶为含血红素的糖蛋白，其制备的纯度采用RZ值衡量，RZ值大于1的过氧化物酶制剂能用于分析测定，RZ值大于2的过氧化物酶制剂能用于实验室分析中的定位检测。有人从大豆、大蒜、辣根、苦瓜、茶叶中纯化了过氧化物酶。其中，只有从辣根中纯化的过氧化物酶得到了商业化应用，而已报道的从其他植物中提纯过氧化物酶的方法均需要采用多步层析，回收率均小于10%，其分离纯化的步骤复杂， 产量低，制备过氧化物酶的成本高。从辣根中制备过氧化物酶的纯度高，5公斤辣根能制备RZ值大于2的过氧化物酶 20mg，但辣根的栽培条件苛刻，只在我国的东部沿海少数地区有少量栽培。因此，用辣根制备过氧化物酶，原料成本偏高。我们对多种常见作物的过氧化物的纯化方法进行了研究，发现红薯有较高的过氧化物酶活性，研究表明此酶的稳定性和耐受金属离子和有机溶剂的能力较强，有利于工业化制备。而且红薯是一种常见的农作物，在我国大部分地区能够正常生长，产量高，价格低，以红薯为原料有利于低成本制备过氧化物酶制剂。
发明内容
本发明的目的在于克服已有的制备过氧化物酶方案的不足，提供一种低成本、高回收率的快速制备过氧化物酶方法。本发明是利用红薯为原料，根据红薯中过氧化物酶对金属离子和有机溶剂的耐受能力强的特点，设计通过硫酸铵分级分离、丙酮分级分离和硫酸锌沉淀的纯化方案，实现制备RZ大于2. 0的过氧化物酶。本发明的技术方案是通过以下步骤实现的(1)粗提液的硫酸铵分级分离将红薯块根按固液比1 1加入蒸馏水，在0 4°C 下勻浆，然后置于0 4°C下浸提24小时。浸提液于4°C IOOOOg离心10分钟，收集上清液，然后向上清液中加入固体硫酸铵达到40 %饱和度，0 4°C静置24小时后于4°C IOOOOg 离心10分钟，收集上清液，再加入固体硫酸铵于收集的上清液中，达到70%饱和度，于0 4°C静置24小时；然后于4°C IOOOOg离心10分钟，收集沉淀，在沉淀中按固液比1 1加入蒸馏水，置于透析袋中透析5小时，透析后的溶液于4°C IOOOOg离心10分钟收集上清液。
(2)丙酮分级分离纯化过氧化物酶测量步骤(1)收集的上清液的体积Vtl，向其中加入1. 5倍Vtl体积的-40°c预冷的丙酮，于4°C IOOOOg离心10分钟收集上清液，上清液中加入0. 3倍Vtl体积的-40°C预冷的丙酮，于4°C IOOOOg离心10分钟收集沉淀。向沉淀中按固液比1 1加入蒸馏水，溶解沉淀，置于培养皿中在4°C下风干，得到丙酮分级分离后纯化的固体过氧化物酶制剂。(3)硫酸锌分离纯化过氧化物酶取步骤(2)制备的过氧化物酶，按固液比 1 1000加入蒸馏水溶解过氧化物酶，然后加入1. Omol/L硫酸锌，使硫酸锌终浓度达到 0.0015mol/L，于4°C IOOOOg离心10分钟收集沉淀，按固液比1 1000在沉淀中加入蒸馏水溶解沉淀，置于透析袋中透析除盐。透析后的溶液置于培养皿中在4°C下风干，得到硫酸锌分离纯化的固体过氧化物酶制剂。本发明从红薯块根中提取过氧化物酶的方法的效果是(1)回收率高，2公斤红薯块根能最终制备RZ大于2过氧化物酶量超过40mg ；(2)制备方法简单，只需使用冷冻离心机、冰箱、可控温培养箱、硫酸铵、丙酮、硫酸锌等设备和药品，制备过程快捷、操作简单、成本低，便于推广；(3)制备的过氧化物酶纯度高，经过丙酮分级分离得到的过氧化物酶的RZ值大于 1，经过硫酸锌分级分离后得到的过氧化物酶的RZ值大于2。
具体实施例方式实施例丙酮分级分离纯化的过氧化物酶的制备称取2公斤红薯块根，用蒸馏水洗净，加入2000ml蒸馏水于0 4°C下勻浆，然后置于0 4°C下浸提24小时。浸提液于 40C IOOOOg离心10分钟，得到2400ml上清液。向上清液中缓缓加入583g固体硫酸铵，搅拌溶解后置于0 4°C静置24小时，然后4°C IOOOOg离心10分钟，弃沉淀，再向上清液中缓缓加入655g固体硫酸铵，搅拌溶解后置于0 4°C静置24小时，然后4°C IOOOOg离心10 分钟，弃上清液，收集沉淀。然后将沉淀溶于400ml蒸馏水，装入透析袋，在蒸馏水中透析 5小时，期间换水两次，然后将透析袋中的溶液于4°C IOOOOg离心10分钟，收集上清液，共 460ml。向上清液中加入690ml-40°C预冷的丙酮，4°C IOOOOg离心10分钟，收集上清液，然后再往上清液中加入138ml-40°C预冷的丙酮，4°C IOOOOg离心10分钟，收集沉淀，向沉淀中按固液比1 1加入蒸馏水，溶解沉淀，置于培养皿中在4°C下风干，得到丙酮分级分离后纯化的固体过氧化物酶制剂130mg。硫酸锌分离纯化的过氧化物酶制备取以上制备的过氧化物酶120mg，溶于120ml 蒸馏水中，然后加入1. Omol/L硫酸锌，使硫酸锌终浓度达到0. 0015mol/L，于4°C IOOOOg离心10分钟收集沉淀，用60ml蒸馏水溶解沉淀，置于透析袋中透析除盐。透析1小时后，将溶液置于培养皿中在4°C下风干，得到硫酸锌分离纯化的固体过氧化物酶制剂50mg。纯度检测将提纯的过氧化物酶溶于蒸馏水中，浓度为0. 5 lmg/ml，测量RZ，RZ 的定义为A4tl3A275。
权利要求
1. 一种从红薯块根中提取过氧化物酶的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)粗提液的硫酸铵分级分离将红薯块根按固液比1 1加入蒸馏水，在0 4°C下勻浆，然后置于0 4°C下浸提24小时，浸提液于4°C IOOOOg离心10分钟，收集上清液，然后向上清液中加入固体硫酸铵达到40%饱和度，0 4°C静置24小时后于4°C IOOOOg离心 10分钟，收集上清液，再加入固体硫酸铵于收集的上清液中，达到70%饱和度，于0 4°C静置24小时，然后于4°C IOOOOg离心10分钟，收集沉淀，在沉淀中按固液比1 1加入蒸馏水，置于透析袋中透析5小时，透析后的溶液于4°C IOOOOg离心10分钟收集上清液；(2)丙酮分级分离纯化过氧化物酶测量步骤(1)收集的上清液的体积Vtl，向其中加入 1.5倍Vtl体积的-40°C预冷的丙酮，于4°C IOOOOg离心10分钟收集上清液，上清液中加入 0. 3倍Vtl体积的-40°c预冷的丙酮，于4°C IOOOOg离心10分钟收集沉淀，向沉淀中按固液比1 1加入蒸馏水，溶解沉淀，置于培养皿中在4°c下风干，得到丙酮分级分离后纯化的固体过氧化物酶制剂；(3)硫酸锌分离纯化过氧化物酶取步骤(2)制备的过氧化物酶，按固液比1 1000加入蒸馏水溶解过氧化物酶，然后加入1. Omol/L硫酸锌，使硫酸锌终浓度达到0. 0015mol/L, 于4°C IOOOOg离心10分钟收集沉淀，按固液比1 1000在沉淀中加入蒸馏水溶解沉淀，置于透析袋中透析除盐，透析后的溶液置于培养皿中在4°C下风干，得到硫酸锌分离纯化的固体过氧化物酶制剂。
全文摘要
本发明涉及酶制备技术领域，特别涉及红薯块根中过氧化物酶的制备，适合于从红薯块根中制备RZ值大于2的过氧化物酶，它包括以下步骤粗提液的硫酸铵分级分离匀浆红薯块根，蒸馏水浸提24小时，40％～70％饱和度的硫酸铵分级分离，离心收集沉淀，沉淀溶于蒸馏水后透析除盐，然后向透析液加入1.5倍体积预冷的丙酮，离心弃沉淀，上清液加入0.3倍透析液体积的预冷丙酮，离心收集沉淀，风干得到丙酮分级分离纯化的过氧化物酶制剂，其RZ值大于1；然后将丙酮分级分离纯化的过氧化物酶制剂溶于蒸馏水中，加入硫酸锌，离心收集沉淀，沉淀溶于蒸馏水后透析除盐，风干得到硫酸锌分离纯化的过氧化物酶，其RZ值大于2。采用本发明制备红薯过氧化物酶，具有制备方法简单、回收率高、制备的过氧化物酶纯度高的优点。
文档编号C12N9/08GK102250850SQ20111019148
公开日2011年11月23日 申请日期2011年7月11日 优先权日2011年7月11日
发明者吴娟, 张梦成, 胡一鸿 申请人:湖南人文科技学院