专利名称：促视网膜色素上皮细胞扩增的水凝胶细胞支架的制备方法
技术领域：
本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种促视网膜色素上皮细胞扩增的水凝胶细胞支架的制备方法。
背景技术：
年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration, AMD)已经成为危害全世界人类眼部健康的一种不容忽视的疾病。世界卫生组织的研究报告表明，AMD致盲者约占全球盲人的8. 7%，全球约有3000万AMD患者，每年约有50万人因为AMD而致盲。美国2004年报告约有175万AMD患者，AMD的患病率为1. 47%，而到2020年，推测将有高达 300万的AMD患者。我国邹海东等人的一项调查结果显示，50岁以上人群的AMD患病率为 15.5%。按照联合国的人口数据资料，我国在2005年50岁以上的人口数接近3亿，按照这个比例，我国50岁以上AMD患者总数应该接近400万，在新加坡这个以华人为主的国家， AMD也逐渐成为主要的致盲原因，60岁以上人群患病率为27%，由此可见，随着人口的老龄化，AMD的患病率将逐年增高，随之而带来的公共卫生问题亦不能忽视。研究结果表明AMD的发病与视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE) 细胞的萎缩和变性有着很大的关系。视网膜色素上皮细胞位于神经视网膜和脉络膜之间， 在正常的情况下，视网膜色素上皮细胞在很多重要的眼部功能中都起着关键性的作用，如吞噬感光细胞外节段，神经视网膜的生理吸附，血视网膜的维护以及众多离子、生长因子和细胞因子的运输和分泌。它的退化可以诱发出很多视网膜疾病，包括AMD。当RPE细胞受到损伤时，成熟的视网膜色素上皮细胞会停止增生，而产生形态的增大。在这种病理情况下， 功能缺失或者恶化了的视网膜色素上皮细胞最终会导致与之相关的光感受器的损伤而产生视力的退化。在AMD这种病变中，视网膜色素上皮细胞会丧失有效地降解感光废料的功能，导致废料在视网膜上堆积。功能不全的视网膜色素上皮细胞还会导致光感受器功能的退化，这会对视力造成极大的损伤。近20年来，组织工程学在眼科领域中的研究和应用，如角膜、结膜、泪腺及视网膜等方面，取得了令人瞩目的成就。针对视网膜色素上皮细胞移植的研究工作也得到了一定程度的发展。目前，RPE种子细胞已经商品化，在这种研究背景下， 在受损的黄斑上移植RPE细胞这一种新颖的治疗方法应运而生，开辟了治疗年龄相关性黄斑变性的新途径。由于RPE细胞重要的功能特性以及在AMD的发病中所起到的至关重要的作用，这一治疗方法已经成为国内外学者关注的重大课题。但是到目前为止，科学家还没有寻找到治疗该疾病的有效方法。以视网膜色素上皮移植为基础的眼组织工程研究的过程中，一些问题的出现阻碍了 AMD疾病治疗方法的发展。主要表现在(1)离体培养的视网膜色素上皮细胞的功能性缺陷或者变异，尤其表现为易于老化，且无法有效地附着在视网膜上；( 移植的视网膜色素上皮细胞无法附着在视网膜中央窝上形成细胞层。研究表明，移植的视网膜色素上皮细胞必须重新贴附在一层基质上，才有可能在移植之后存活。因此寻找适宜视网膜色素上皮细胞离体扩增的细胞支架以维持视网膜色素上皮细胞的正常生理功能，成为解决上述问题的关键。
发明内容
为了克服上述现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种促进视网膜色素上皮细胞扩增的水凝胶细胞支架的制备方法，由此制备方法制备出来的水凝胶细胞支架， 克服了易于老化，且无法有效地附着在视网膜上以及移植的视网膜色素上皮细胞无法附着在视网膜中央窝上形成细胞层的缺点，实现并促进人体视网膜色素上皮细胞能够粘附、铺展和增殖，可以起到防止其老化的功能。为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是—种促视网膜色素上皮细胞扩增的水凝胶细胞支架的制备方法，步骤如下步骤1 首先制备电解质高分子单体溶液，即将电解质高分子单体和溶剂按质量比范围1 10 1 200混合而得电解质高分子单体溶液，溶剂为去离子水或PH值为 5. 7 8. 0的磷酸盐缓冲溶液，电解质高分子单体包括带负电荷的丙烯酸、甲基丙烯酸、苯乙烯磺酸钠、2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸、带正电荷的丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、甲基丙烯酰氧乙基二甲基苄基氯化铵或者丙烯酰氧乙基二甲基苄基氯化铵；步骤2 制备中性高分子单体溶液，即将中性高分子单体和溶剂按质量比范围 1 10 1 200混合而得中性高分子单体溶液，溶剂为去离子水或PH值为5. 7 8.0的磷酸盐缓冲溶液，中性高分子单体包括甲基丙烯酸羟乙脂、甲基丙烯酸甲酯、N-乙烯基吡喏烷酮、二甲基丙烯酸乙二醇酯、丙烯酰胺或者N，N' 二甲基丙烯酰胺；步骤3 制备高分子水凝胶，即将制备而得的电解质高分子单体溶液与中性高分子单体溶液按电解质高分子单体与中性高分子单体的摩尔比范围为1 0.05 1 1.0混合均勻后，加入质量浓度为1 10%的N，N'-亚甲基双丙酰胺交联剂和质量浓度为0. 1% 的2-氧代-1，5-戊二酸引发剂，其中电解质高分子单体和所述的N，N'-亚甲基双丙酰胺的摩尔比范围为1 0. 1 1 0.5，而中性高分子单体和所述的N，N'-亚甲基双丙酰胺的摩尔比范围为1 0.2 1 0.5，再次混合均勻后将该混合溶液在避光条件下利用氮气脱氧30分钟后加入板状合成模具中，再用365nm的紫外灯对板状合成模具内氮气脱氧后的混合溶液在室温下照射6小时后，再单体聚合为高分子水凝胶；步骤4 进行高分子水凝胶pH值和离子强度的调节，即将所得的高分子水凝胶在去离子水中浸泡，除去高分子水凝胶中微量的未反应单体、交联剂及引发剂，然后将高分子水 疑月交用 4- (-2-hydroxyethyl) -piperazine-l-ethansulfonic acid ^ HEPES t^WMM 泡，该 HEPES 缓冲溶液还包括 5 X IO^3M 的 HEPES、1. 55 X 1(Γ2Μ 的 NaHC03、0. 14M 的 NaCl 以及 2. 5 X 10_3g/l的苯酚红，另外该HEPES缓冲溶液的离子强度I为0. 15M以及pH值为7. 4，并且每经过12小时更新一次所述的HEPES缓冲溶液，直到高分子水凝胶达到溶胀平衡，此时高分子水凝胶的离子强度和PH值与细胞培养液一致；步骤5:将达到溶胀平衡的高分子水凝胶切成直径为15mm且厚度范围为 1. 5mm-2mm的圆柱状，在温度为120°C条件下，经过20分钟高压灭菌之后转移至培养板的孔中，这样培养板和其上的高分子水凝胶就形成了促视网膜色素上皮细胞扩增的水凝胶细胞支架。所述的板状合成模具是由玻璃板围成的框架结构构成的容器，且该框架结构内设置有硅胶垫，其长宽高尺寸分别为10cm、IOcm以及0. Icm0本发明制备出来的水凝胶细胞支架克服了易于老化，且无法有效地附着在视网膜上以及移植的视网膜色素上皮细胞无法附着在视网膜中央窝上形成细胞层的缺点，实现并促进人体视网膜色素上皮细胞能够粘附、铺展和增殖，可以起到防止其老化功能的高分子水凝胶细胞支架。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作更详细的说明。实施例1 促视网膜色素上皮细胞扩增的水凝胶细胞支架的制备方法，步骤如下步骤1 首先制备电解质高分子单体溶液，即将电解质高分子单体和溶剂按质量比范围1 10混合而得电解质高分子单体溶液，溶剂为PH值为5. 7的磷酸盐缓冲溶液，电解质高分子单体包括带负电荷的丙烯酸；步骤2 制备中性高分子单体溶液，即将中性高分子单体和溶剂按质量比范围 1 10混合而得中性高分子单体溶液，溶剂为pH值为5. 7的磷酸盐缓冲溶液，中性高分子单体包括甲基丙烯酸羟乙脂；步骤3 制备高分子水凝胶，即将制备而得的电解质高分子单体溶液与中性高分子单体溶液按电解质高分子单体与中性高分子单体的摩尔比范围为1 0.05混合均勻后， 加入质量浓度为1的N，N'-亚甲基双丙酰胺交联剂和质量浓度为0. 1%的2-氧代-1， 5-戊二酸引发剂，其中电解质高分子单体和所述的N，N'-亚甲基双丙酰胺的摩尔比范围为1 0. 1，而中性高分子单体和所述的N，N'-亚甲基双丙酰胺的摩尔比范围为1 0.2， 再次混合均勻后将该混合溶液在避光条件下利用氮气脱氧30分钟后加入板状合成模具中，再用365nm的紫外灯对板状合成模具内氮气脱氧后的混合溶液在室温下照射6小时后， 再单体聚合为高分子水凝胶；步骤4 进行高分子水凝胶pH值和离子强度的调节，即将所得的高分子水凝胶在去离子水中浸泡，除去高分子水凝胶中微量的未反应单体、交联剂及引发剂，然后将高分子水 疑月交用 4- (-2-hydroxyethyl) -piperazine-l-ethansulfonic acid ^ HEPES t^WMM 泡，该 HEPES 缓冲溶液还包括 5 X IO^3M 的 HEPES、1. 55 X 1(Γ2Μ 的 NaHC03、0. 14M 的 NaCl 以及 2. 5 X IOVl的苯酚红，另外该HEPES缓冲溶液的离子强度I为0. 15M以及pH值为7. 4，并且每经过12小时更新一次所述的HEPES缓冲溶液，直到高分子水凝胶达到溶胀平衡，此时高分子水凝胶的离子强度和PH值与细胞培养液一致；步骤5 将达到溶胀平衡的高分子水凝胶切成直径为15mm且厚度范围为1. 5mm的圆柱状，在温度为120°C条件下，经过20分钟高压灭菌之后转移至培养板的孔中，这样培养板和其上的高分子水凝胶就形成了促视网膜色素上皮细胞扩增的水凝胶细胞支架。所述的板状合成模具是由玻璃板围成的框架结构构成的容器，且该框架结构内设置有硅胶垫，其长宽高尺寸分别为10cm、IOcm以及0. Icm0将1ml 2X IO4Cells细胞悬浮液滴加于促视网膜色素上皮细胞扩增的水凝胶细胞支架的圆柱状高分子水凝胶表面，逐滴将细胞悬浮液滴加于高分子水凝胶表面进行接种， 逐滴中的一滴小于等于0. 1ml，接种完后小心地移置于内部温度为37°C且其内(X)2体积比为5%的细胞培养箱中培养，在移动过程中避免摇动，培养96小时后细胞扩增为播种细胞量的2. 5倍。实施例2 促视网膜色素上皮细胞扩增的水凝胶细胞支架的制备方法，步骤如下步骤1 首先制备电解质高分子单体溶液，即将电解质高分子单体和溶剂按质量比范围1 100混合而得电解质高分子单体溶液，溶剂为pH值为6. 5的磷酸盐缓冲溶液， 电解质高分子单体包括甲基丙烯酸；步骤2 制备中性高分子单体溶液，即将中性高分子单体和溶剂按质量比范围 1 100混合而得中性高分子单体溶液，溶剂为去离子水的磷酸盐缓冲溶液，中性高分子单体包括甲基丙烯酸甲酯；步骤3 制备高分子水凝胶，即将制备而得的电解质高分子单体溶液与中性高分子单体溶液按电解质高分子单体与中性高分子单体的摩尔比范围为1 0.5混合均勻后， 加入质量浓度为5%的N，N'-亚甲基双丙酰胺交联剂和质量浓度为0. 的2-氧代-1， 5-戊二酸引发剂，其中电解质高分子单体和所述的N，N'-亚甲基双丙酰胺的摩尔比范围为1 0.3，而中性高分子单体和所述的N，N'-亚甲基双丙酰胺的摩尔比范围为1 0.3， 再次混合均勻后将该混合溶液在避光条件下利用氮气脱氧30分钟后加入板状合成模具中，再用365nm的紫外灯对板状合成模具内氮气脱氧后的混合溶液在室温下照射6小时后， 再单体聚合为高分子水凝胶；步骤4 进行高分子水凝胶pH值和离子强度的调节，即将所得的高分子水凝胶在去离子水中浸泡，除去高分子水凝胶中微量的未反应单体、交联剂及引发剂，然后将高分子水 疑月交用 4- (-2-hydroxyethyl) -piperazine-l-ethansulfonic acid ^ HEPES t^WMM 泡，该 HEPES 缓冲溶液还包括 5 X IO^3M 的 HEPES、1. 55 X 1(Γ2Μ 的 NaHC03、0. 14M 的 NaCl 以及 2. 5 X IOVl的苯酚红，另外该HEPES缓冲溶液的离子强度I为0. 15M以及pH值为7. 4，并且每经过12小时更新一次所述的HEPES缓冲溶液，直到高分子水凝胶达到溶胀平衡，此时高分子水凝胶的离子强度和PH值与细胞培养液一致；步骤5 将达到溶胀平衡的高分子水凝胶切成直径为15mm且厚度范围为1. 7mm的圆柱状，在温度为120°C条件下，经过20分钟高压灭菌之后转移至培养板的孔中，这样培养板和其上的高分子水凝胶就形成了促视网膜色素上皮细胞扩增的水凝胶细胞支架。所述的板状合成模具是由玻璃板围成的框架结构构成的容器，且该框架结构内设置有硅胶垫，其长宽高尺寸分别为10cm、IOcm以及0. Icm0将1ml 2X IO4Cells细胞悬浮液滴加于促视网膜色素上皮细胞扩增的水凝胶细胞支架的圆柱状高分子水凝胶表面，逐滴将细胞悬浮液滴加于高分子水凝胶表面进行接种， 逐滴中的一滴小于等于0. 1ml，接种完后小心地移置于内部温度为37°C且其内CO2体积比为5%的细胞培养箱中培养，在移动过程中避免摇动，培养120小时后细胞扩增为播种细胞量的3倍。实施例3 促视网膜色素上皮细胞扩增的水凝胶细胞支架的制备方法，步骤如下步骤1 首先制备电解质高分子单体溶液，即将电解质高分子单体和溶剂按质量比范围1 200混合而得电解质高分子单体溶液，溶剂为pH值为8. 0的磷酸盐缓冲溶液，
8电解质高分子单体包括苯乙烯磺酸钠；步骤2 制备中性高分子单体溶液，即将中性高分子单体和溶剂按质量比范围 1 10 1 200混合而得中性高分子单体溶液，溶剂为去离子水或pH值为5. 7 8.0的磷酸盐缓冲溶液，中性高分子单体包括甲基丙烯酸甲酯；步骤3 制备高分子水凝胶，即将制备而得的电解质高分子单体溶液与中性高分子单体溶液按电解质高分子单体与中性高分子单体的摩尔比范围为1 1.0混合均勻后， 加入质量浓度为1 10%的N，N'-亚甲基双丙酰胺交联剂和质量浓度为0. 的2-氧代-1，5-戊二酸引发剂，其中电解质高分子单体和所述的N，N'-亚甲基双丙酰胺的摩尔比范围为1 0.5，而中性高分子单体和所述的N，N'-亚甲基双丙酰胺的摩尔比范围为 1 0.5，再次混合均勻后将该混合溶液在避光条件下利用氮气脱氧30分钟后加入板状合成模具中，再用365nm的紫外灯对板状合成模具内氮气脱氧后的混合溶液在室温下照射6 小时后，再单体聚合为高分子水凝胶；步骤4 进行高分子水凝胶pH值和离子强度的调节，即将所得的高分子水凝胶在去离子水中浸泡，除去高分子水凝胶中微量的未反应单体、交联剂及引发剂，然后将高分子水 疑月交用 4- (-2-hydroxyethyl) -piperazine-l-ethansulfonic acid ^ HEPES t^WMM 泡，该 HEPES 缓冲溶液还包括 5 X IO^3M 的 HEPES、1. 55 X 1(Γ2Μ 的 NaHC03、0. 14M 的 NaCl 以及 2. 5 X IOVl的苯酚红，另外该HEPES缓冲溶液的离子强度I为0. 15M以及pH值为7. 4，并且每经过12小时更新一次所述的HEPES缓冲溶液，直到高分子水凝胶达到溶胀平衡，此时高分子水凝胶的离子强度和PH值与细胞培养液一致；步骤5 将达到溶胀平衡的高分子水凝胶切成直径为15mm且厚度范围为2mm的圆柱状，在温度为120°C条件下，经过20分钟高压灭菌之后转移至培养板的孔中，这样培养板和其上的高分子水凝胶就形成了促视网膜色素上皮细胞扩增的水凝胶细胞支架。所述的板状合成模具是由玻璃板围成的框架结构构成的容器，且该框架结构内设置有硅胶垫，其长宽高尺寸分别为10cm、IOcm以及0. Icm0将1ml 2X IO4Cells细胞悬浮液滴加于促视网膜色素上皮细胞扩增的水凝胶细胞支架的圆柱状高分子水凝胶表面，逐滴将细胞悬浮液滴加于高分子水凝胶表面进行接种， 逐滴中的一滴小于等于0. 1ml，接种完后小心地移置于内部温度为37°C且其内(X)2体积比为5%的细胞培养箱中培养，在移动过程中避免摇动，培养120小时后细胞扩增为播种细胞量的2. 7倍。
权利要求
1.一种促视网膜色素上皮细胞扩增的水凝胶细胞支架的制备方法，其特征在于，步骤如下步骤1 首先制备电解质高分子单体溶液，即将电解质高分子单体和溶剂按质量比范围1 10 1 200混合而得电解质高分子单体溶液，溶剂为去离子水或PH值为5. 7 8. 0的磷酸盐缓冲溶液，电解质高分子单体包括带负电荷的丙烯酸、甲基丙烯酸、苯乙烯磺酸钠、2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸、带正电荷的丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、甲基丙烯酰氧乙基二甲基苄基氯化铵或者丙烯酰氧乙基二甲基苄基氯化铵；步骤2:制备中性高分子单体溶液，即将中性高分子单体和溶剂按质量比范围 1 10 1 200混合而得中性高分子单体溶液，溶剂为去离子水或pH值为5. 7 8.0的磷酸盐缓冲溶液，中性高分子单体包括甲基丙烯酸羟乙脂、甲基丙烯酸甲酯、N-乙烯基吡喏烷酮、二甲基丙烯酸乙二醇酯、丙烯酰胺或者N，N' 二甲基丙烯酰胺；步骤3 制备高分子水凝胶，即将制备而得的电解质高分子单体溶液与中性高分子单体溶液按电解质高分子单体与中性高分子单体的摩尔比范围为1 0.05 1 1.0混合均勻后，加入质量浓度为1 10%的N，N'-亚甲基双丙酰胺交联剂和质量浓度为0. 1% 的2-氧代-1，5-戊二酸引发剂，其中电解质高分子单体和所述的N，N'-亚甲基双丙酰胺的摩尔比范围为1 0. 1 1 0.5，而中性高分子单体和所述的N，N'-亚甲基双丙酰胺的摩尔比范围为1 0.2 1 0.5，再次混合均勻后将该混合溶液在避光条件下利用氮气脱氧30分钟后加入板状合成模具中，再用365nm的紫外灯对板状合成模具内氮气脱氧后的混合溶液在室温下照射6小时后，再单体聚合为高分子水凝胶；步骤4 进行高分子水凝胶pH值和离子强度的调节，即将所得的高分子水凝胶在去离子水中浸泡，除去高分子水凝胶中微量的未反应单体、交联剂及引发剂，然后将高分子水凝月交用 4-(-2-hydroxyethyl) -piperazine-l-ethansulfonic acid 的 HEPES 缓冲溶液浸泡， 该 HEPES 缓冲溶液还包括 5X IO^3M 的 HEPESU. 55X IO^2M 的 NaHC03、0. 14M 的 NaCl 以及 2. 5 X IOVl的苯酚红，另外该HEPES缓冲溶液的离子强度I为0. 15M以及pH值为7. 4，并且每经过12小时更新一次所述的HEPES缓冲溶液，直到高分子水凝胶达到溶胀平衡，此时高分子水凝胶的离子强度和PH值与细胞培养液一致；步骤5 将达到溶胀平衡的高分子水凝胶切成直径为15mm且厚度范围为1. 5mm-2mm的圆柱状，在温度为120°C条件下，经过20分钟高压灭菌之后转移至培养板的孔中，这样培养板和其上的高分子水凝胶就形成了促视网膜色素上皮细胞扩增的水凝胶细胞支架。
2.根据权利要求1所述的促视网膜色素上皮细胞扩增的水凝胶细胞支架的制备方法， 其特征在于所述的板状合成模具是由玻璃板围成的框架结构构成的容器，且该框架结构内设置有硅胶垫，其长宽高尺寸分别为10cm、IOcm以及0. Icm0
3.根据权利要求2所述的促视网膜色素上皮细胞扩增的水凝胶细胞支架的制备方法， 其特征在于，步骤如下步骤1 首先制备电解质高分子单体溶液，即将电解质高分子单体和溶剂按质量比范围1 10混合而得电解质高分子单体溶液，溶剂为PH值为5. 7的磷酸盐缓冲溶液，电解质高分子单体包括带负电荷的丙烯酸；步骤2:制备中性高分子单体溶液，即将中性高分子单体和溶剂按质量比范围1 10混合而得中性高分子单体溶液，溶剂为PH值为5. 7的磷酸盐缓冲溶液，中性高分子单体包括甲基丙烯酸羟乙脂；步骤3 制备高分子水凝胶，即将制备而得的电解质高分子单体溶液与中性高分子单体溶液按电解质高分子单体与中性高分子单体的摩尔比范围为1 0.05混合均勻后，加入质量浓度为1的N，N'-亚甲基双丙酰胺交联剂和质量浓度为0. 1%的2-氧代-1，5-戊二酸引发剂，其中电解质高分子单体和所述的N，N'-亚甲基双丙酰胺的摩尔比范围为 1 0. 1，而中性高分子单体和所述的N，N'-亚甲基双丙酰胺的摩尔比范围为1 0.2，再次混合均勻后将该混合溶液在避光条件下利用氮气脱氧30分钟后加入板状合成模具中， 再用365nm的紫外灯对板状合成模具内氮气脱氧后的混合溶液在室温下照射6小时后，再单体聚合为高分子水凝胶；步骤4 进行高分子水凝胶pH值和离子强度的调节，即将所得的高分子水凝胶在去离子水中浸泡，除去高分子水凝胶中微量的未反应单体、交联剂及引发剂，然后将高分子水凝月交用 4-(-2-hydroxyethyl) -piperazine-l-ethansulfonic acid 的 HEPES 缓7中溶液浸泡， 该 HEPES 缓冲溶液还包括 5X KT3M 的 HEPESU. 55X KT2M 的 NaHC03、0. 14M 的 NaCl 以及 2. 5 X IOVl的苯酚红，另外该HEPES缓冲溶液的离子强度I为0. 15M以及pH值为7. 4，并且每经过12小时更新一次所述的HEPES缓冲溶液，直到高分子水凝胶达到溶胀平衡，此时高分子水凝胶的离子强度和PH值与细胞培养液一致；步骤5 将达到溶胀平衡的高分子水凝胶切成直径为15mm且厚度范围为1. 5mm的圆柱状，在温度为120°C条件下，经过20分钟高压灭菌之后转移至培养板的孔中，这样培养板和其上的高分子水凝胶就形成了促视网膜色素上皮细胞扩增的水凝胶细胞支架。
4.根据权利要求2所述的促视网膜色素上皮细胞扩增的水凝胶细胞支架的制备方法， 其特征在于，步骤如下步骤1 首先制备电解质高分子单体溶液，即将电解质高分子单体和溶剂按质量比范围1 100混合而得电解质高分子单体溶液，溶剂为pH值为6. 5的磷酸盐缓冲溶液，电解质高分子单体包括甲基丙烯酸；步骤2:制备中性高分子单体溶液，即将中性高分子单体和溶剂按质量比范围1 100 混合而得中性高分子单体溶液，溶剂为去离子水的磷酸盐缓冲溶液，中性高分子单体包括甲基丙烯酸甲酯；步骤3 制备高分子水凝胶，即将制备而得的电解质高分子单体溶液与中性高分子单体溶液按电解质高分子单体与中性高分子单体的摩尔比范围为1 0.5混合均勻后，加入质量浓度为5%的N，N'-亚甲基双丙酰胺交联剂和质量浓度为0. 的2-氧代-1，5-戊二酸引发剂，其中电解质高分子单体和所述的N，N'-亚甲基双丙酰胺的摩尔比范围为 1 0.3，而中性高分子单体和所述的N，N'-亚甲基双丙酰胺的摩尔比范围为1 0.3，再次混合均勻后将该混合溶液在避光条件下利用氮气脱氧30分钟后加入板状合成模具中， 再用365nm的紫外灯对板状合成模具内氮气脱氧后的混合溶液在室温下照射6小时后，再单体聚合为高分子水凝胶；步骤4 进行高分子水凝胶pH值和离子强度的调节，即将所得的高分子水凝胶在去离子水中浸泡，除去高分子水凝胶中微量的未反应单体、交联剂及引发剂，然后将高分子水凝月交用 4-(-2-hydroxyethyl) -piperazine-l-ethansulfonic acid 的 HEPES 缓7中溶液浸泡，该 HEPES 缓冲溶液还包括 5 X IO^3M 的 HEPES、1. 55 X 1(Γ2Μ 的 NaHC03、0. 14M 的 NaCl 以及 2. 5 X IOVl的苯酚红，另外该HEPES缓冲溶液的离子强度I为0. 15M以及pH值为7. 4，并且每经过12小时更新一次所述的HEPES缓冲溶液，直到高分子水凝胶达到溶胀平衡，此时高分子水凝胶的离子强度和PH值与细胞培养液一致；步骤5 将达到溶胀平衡的高分子水凝胶切成直径为15mm且厚度范围为1. 7mm的圆柱状，在温度为120°C条件下，经过20分钟高压灭菌之后转移至培养板的孔中，这样培养板和其上的高分子水凝胶就形成了促视网膜色素上皮细胞扩增的水凝胶细胞支架。
5.根据权利要求1所述的促视网膜色素上皮细胞扩增的水凝胶细胞支架的制备方法， 其特征在于，步骤如下步骤1 首先制备电解质高分子单体溶液，即将电解质高分子单体和溶剂按质量比范围1 200混合而得电解质高分子单体溶液，溶剂为PH值为8.0的磷酸盐缓冲溶液，电解质高分子单体包括苯乙烯磺酸钠；步骤2 制备中性高分子单体溶液，即将中性高分子单体和溶剂按质量比范围 1 10 1 200混合而得中性高分子单体溶液，溶剂为去离子水或pH值为5. 7 8.0的磷酸盐缓冲溶液，中性高分子单体包括甲基丙烯酸甲酯；步骤3 制备高分子水凝胶，即将制备而得的电解质高分子单体溶液与中性高分子单体溶液按电解质高分子单体与中性高分子单体的摩尔比范围为1 1.0混合均勻后，加入质量浓度为1 10%的N，N'-亚甲基双丙酰胺交联剂和质量浓度为0. 1%的2-氧代-1， 5-戊二酸引发剂，其中电解质高分子单体和所述的N，N'-亚甲基双丙酰胺的摩尔比范围为1 0.5，而中性高分子单体和所述的N，N'-亚甲基双丙酰胺的摩尔比范围为1 0.5， 再次混合均勻后将该混合溶液在避光条件下利用氮气脱氧30分钟后加入板状合成模具中，再用365nm的紫外灯对板状合成模具内氮气脱氧后的混合溶液在室温下照射6小时后， 再单体聚合为高分子水凝胶；步骤4 进行高分子水凝胶pH值和离子强度的调节，即将所得的高分子水凝胶在去离子水中浸泡，除去高分子水凝胶中微量的未反应单体、交联剂及引发剂，然后将高分子水凝月交用 4-(-2-hydroxyethyl) -piperazine-l-ethansulfonic acid 的 HEPES 缓冲溶液浸泡， 该 HEPES 缓冲溶液还包括 5X IO^3M 的 HEPESU. 55X IO^2M 的 NaHC03、0. 14M 的 NaCl 以及 2. 5 X IOVl的苯酚红，另外该HEPES缓冲溶液的离子强度I为0. 15M以及pH值为7. 4，并且每经过12小时更新一次所述的HEPES缓冲溶液，直到高分子水凝胶达到溶胀平衡，此时高分子水凝胶的离子强度和PH值与细胞培养液一致；步骤5 将达到溶胀平衡的高分子水凝胶切成直径为15mm且厚度范围为2mm的圆柱状，在温度为120°C条件下，经过20分钟高压灭菌之后转移至培养板的孔中，这样培养板和其上的高分子水凝胶就形成了促视网膜色素上皮细胞扩增的水凝胶细胞支架。
全文摘要
一种促视网膜色素上皮细胞扩增的水凝胶细胞支架的制备方法，将电解质高分子单体溶液与中性高分子单体溶液混合均匀后，加入引发剂，再次混合均匀后在避光条件下利用氮气脱氧后加入板状合成模具中，制备出来的水凝胶细胞支架克服了易于老化，且无法有效地附着在视网膜上以及移植的视网膜色素上皮细胞无法附着在视网膜中央窝上形成细胞层的缺点，实现并促进人体视网膜色素上皮细胞能够粘附、铺展和增殖，可以起到防止其老化功能的高分子水凝胶细胞支架。
文档编号C12N5/071GK102258808SQ20111019155
公开日2011年11月30日 申请日期2011年7月8日 优先权日2011年7月8日
发明者冯智辉, 刘健康, 刘振齐, 陈咏梅 申请人:西安交通大学