用于纯化视网膜色素上皮细胞的方法

用于纯化视网膜色素上皮细胞的方法
【专利摘要】本发明提供了纯化视网膜色素上皮细胞的方法，使用该方法可以在短时间内通过简单和容易的操作，从通过诱导多能干细胞分化成视网膜色素上皮细胞获得的细胞群体中，获得高纯度的视网膜色素上皮细胞。该纯化方法，包括将含有视网膜色素上皮细胞的细胞群体引入在过滤器上并获得通过过滤器的细胞群体的步骤，所述细胞群体通过多能干细胞在层粘连蛋白或其片段上分化诱导得到。
【专利说明】
用于纯化视网膜色素上皮细胞的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及从细胞群体纯化视网膜色素上皮细胞的方法，使用上述方法的视网膜 色素上皮细胞的生产方法，等，所述细胞群体通过诱导多能干细胞分化为视网膜色素上皮 (RPE)细胞获得。
【背景技术】
[0002] 作为用于从多能干细胞生产视网膜色素上皮细胞的方法，已知下列方法:包括在 无血清培养基中培养作为悬浮聚集物的ES细胞(专利文献1等）的称为SFEB法的方法，包括 在包被有弱细胞粘附包被剂等的培养基质上在分化诱导因子的存在下诱导多能干细胞的 分化的方法(非专利文献1等）。然而，由于低分化诱导效率，这些方法需要组合粘附培养和 悬浮培养的多个步骤以获得高度浓缩的视网膜色素上皮细胞的细胞群体，并具有下列问 题，诸如需要存在具有高工作量和长时间的纯化步骤，其中包括在光学显微镜下选择性地 挑取色素细胞的集落。这些方法仅可以在培养容器中获得一部分诱导的RPE细胞，并且所获 得细胞的纯度在很大程度上受实验者的技术影响，这成问题地使得这些方法不适合大规模 生产。因此，已经要求能够即使当大规模生产RPE细胞时也能够通过简单和容易的方法稳定 地得到高纯度的视网膜色素上皮细胞的方法。
[0003] 对于人多能干细胞的维持培养，使用细胞外基质代替饲养细胞的方法已被广泛使 用。其中，优选使用层粘连蛋白，并且，例如，非专利文献2报告了人ES细胞在层粘连蛋白-511上的长期成功的维持培养。至于称为具有改进的细胞粘附活性的改变的层粘连蛋白的 E8片段，例如，专利文献2和非专利文献3公开了人多能干细胞的培养方法，其使用人层粘连 蛋白-a5m y 1的E8片段(层粘连蛋白-511E8,，下文以相同的方式指示）和人层粘连蛋白-322E8。非专利文献4中记载了层粘连蛋白-511E8保持对a6m整联蛋白的结合活性，其与全 长层粘连蛋白-511是同样水平，并且专利文献2描述了，通过使用所述层粘连蛋白-511E8， 多能干细胞可以稳定地固定化在培养皿上，其结果是细胞可以进行维持培养，同时保持分 化多能性。然而，除了用于多能干细胞培养例如，多能干细胞的分化诱导等之外，没有报告 记载利用这样的层粘连蛋白的E8片段。
[0004] 另一方面，作为不存在饲养细胞的情况下诱导人多能干细胞分化为视网膜色素上 皮细胞的方法，已知使用层粘连蛋白的方法。例如，非专利文献5描述了通过使多能干细胞 在层粘连蛋白-111和基质胶上粘附培养，分化成视网膜色素上皮细胞的分化诱导效率显著 增加。然而，没有报告记载利用层粘连蛋白的E8片段用于将多能干细胞诱导分化成视网膜 色素上皮细胞。
[0005] [文献列表] 专利文献 专利文献 1: W0 2005/123902 专利文献 2: W0 2011/043405 [非专利文献] 非专利文献 1: PLoS One. 2012; 7(5): e37342. 非专利文献 2: Nature Biotech. June 2010; 28(6): 611-5 非专利文献 3: Nat. Commun . 3:1236 doi: 10.1038/ncomms2231 非专利文献 4: J Biol Chem. 284:7820-7831，2009 非专利文献 5: J. Tissue Eng Regen Med 2013; 7: 642-653。
[0006] 发明概述 本发明要解决的技术问题 本发明的一个目的是提供在短时间内通过简单和容易的操作，从通过诱导多能干细胞 分化成视网膜色素上皮细胞获得的细胞群体中，纯化高纯度的视网膜色素上皮细胞的方 法。
[0007] 解决技术问题的方法 本发明人已进行了深入研究以尝试实现上述目的，并且发现，当人多能干细胞在包被 有层粘连蛋白-E8的培养基质上培养时，接种的多能干细胞迅速粘附到培养基质，从早期阶 段产生了大量的色素细胞，视网膜色素上皮细胞的产率可显著提高，而且不仅视网膜色素 上皮细胞，还有其它视觉细胞谱系细胞与基质组分一起产生。本发明人已进一步发现，单独 视网膜色素上皮细胞可以有效地从在层粘连蛋白上产生的视网膜色素上皮细胞纯化，即使 它们埋藏在其它细胞和基质组分中，通过在过滤器上引入所有这些的简单操作。他们已进 一步发现，低回收率，其是在诱导多能干细胞分化为视网膜色素上皮细胞中的问题，可以显 著提高，并且可以方便和稳定地纯化所需视网膜色素上皮细胞。本发明人此后已进行了深 入的研究，并完成了本发明。
[0008] 也就是说，本发明涉及以下内容。
[0009] [1]纯化视网膜色素上皮细胞的方法，包括将含有视网膜色素上皮细胞的细胞群 体引入在过滤器上并获得通过过滤器的细胞群体的步骤，所述细胞群体通过多能干细胞在 层粘连蛋白或其片段上分化诱导得到。
[0010] [2]上述[1]的方法，其中所述层粘连蛋白或其片段是层粘连蛋白-E8片段。
[0011] [3]上述[1]或[2]的方法，其中含有所述视网膜色素上皮细胞的细胞群体通过在 分化诱导后用细胞分离溶液处理进行回收。
[0012] [4]上述[3]的方法，其中所述细胞分离溶液包含胰蛋白酶。
[0013] [5]上述[1]-[4]任一项的方法，其中所述过滤器具有20-70 Ml的孔径。
[0014] [6]从多能干细胞生产视网膜色素上皮细胞的方法，其包括 (1) 通过诱导在层粘连蛋白或其片段上的多能干细胞的分化，获得含有视网膜色素上 皮细胞的细胞群体的步骤;和 (2) 在过滤器上引入（1)中获得的细胞群体，以获得经过所述过滤器的细胞群体的步 骤。
[0015] [7]上述[6]的方法，其中所述层粘连蛋白或其片段是层粘连蛋白-E8片段。
[0016] [8]上述[6]或[7]的方法，其中在步骤（1)中获得的细胞群体通过用细胞分离溶液 处理含有视网膜色素上皮细胞的细胞群体进行回收。
[0017] [ 9 ]上述[8 ]的方法，其中所述细胞分离溶液包含胰蛋白酶。
[0018] [10]上述[6]-[9]任一项的方法，其中所述过滤器具有20-70 Ml的孔径。
[0019] [11]通过上述[6]-[10]任一项的方法获得的视网膜色素上皮细胞。
[0020] [12]通过上述[6]_[10]任一项的方法获得的视网膜色素上皮细胞片。
[0021] 发明效果 根据本发明，从多能干细胞诱导的视网膜色素上皮细胞，可以方便地以高产率纯化。
[0022] 附图简述 图1是显示层粘连蛋白-E8的结构的示意图。
[0023] 图2显示从人iPS细胞(201B7和1120C7)诱导的RPE细胞的RPE相关基因的表达。 [0024]图3显示立即纯化前培养的细胞的状态。
[0025]图4显示用过滤器纯化之前和之后视网膜色素上皮细胞标志物基因，祖细胞和神 经细胞标志物基因的表达。该值显示相对值土标准偏差(n= 1，3重复测量），过滤前表达水 平为1。 具体实施方案
[0026] 1.纯化方法和视网膜色素上皮细胞的生产方法 本发明涉及纯化视网膜色素上皮细胞的方法(下文也称为本发明的纯化方法），包括将 含有视网膜色素上皮细胞的细胞群体引入在过滤器上，所述细胞群体通过多能干细胞在层 粘连蛋白或其片段上分化诱导得到。本发明还涉及从多能干细胞生产视网膜色素上皮细胞 的方法(下文也称为本发明的生产方法），其特征在于使用所述方法。本发明的生产方法包 含下列两个主要分开的步骤： (1) 通过诱导在层粘连蛋白或其片段上的多能干细胞的分化，获得"含有视网膜色素上 皮细胞的细胞群体"的步骤;和 (2) 将（1)中获得的"含有视网膜色素上皮细胞的细胞群体"引入到过滤器以纯化视网 膜色素上皮细胞的步骤。本发明的纯化方法针对所述步骤(2)。每个步骤在下文详细解释。
[0027] (1)获得含有视网膜色素上皮细胞的细胞群体的步骤 在步骤（1)中，多能干细胞通过用包被有层粘连蛋白或其片段的培养基质的粘附培养 进行分化诱导，并得到含有视网膜色素上皮细胞的细胞群体。
[0028] 本发明中的"多能干细胞"是指具有自我复制能力和分化多能性的干细胞，并没有 特别的限制。例如，胚胎干细胞(ES细胞），诱导的多能干细胞(iPS细胞)等被广泛利用。优选 地，利用人ES细胞或人iPS细胞，并且更优选地，利用人iPS细胞。
[0029] 本发明中的"iPS细胞"是指通过使核重新编程因子与体细胞(例如，成纤维细胞， 皮肤细胞，淋巴细胞等)接触人工获得自我复制能力和分化多能性的细胞。本发明中的iPS 细胞的生产方法没有特别的限制。
[0030] 在本发明中，作为多能性干细胞，可以使用衍生自哺乳动物的多能干细胞。尽管哺 乳动物没有特别限定，但优选为来自临床应用方面的人。
[0031] 本发明中的"视网膜色素上皮细胞"，是指构成视网膜色素上皮的上皮细胞，以及 它们的祖细胞。是否是视网膜色素上皮细胞可以通过，例如，细胞标志物的表达（RPE65， CRALBP，MERTK，BEST1等）、细胞形态(胞内黑色素染料沉积，多边形和扁平细胞形态，形成多 边形的肌动蛋白束等)等来确认。视网膜色素上皮细胞的祖细胞是指定向诱导分化成视网 膜细胞的细胞，并且是否是祖细胞可以通过细胞标志物(Mitf (色素细胞，祖细胞），Pax6(祖 细胞），Rx(视网膜祖细胞），Crx(感光前体细胞），ChxlO(双极细胞)等)等的表达来确认。视 网膜色素上皮细胞的功能评价可以使用，例如，细胞因子(VEGF，PEDF等）的分泌能力、吞噬 能力等作为指标来确认。这些功能评价和确认操作可以由本领域技术人员通过设置适当的 条件进行。
[0032]在本发明中"层粘连蛋白"是由a、0、y链组成的异源三聚体分子，并且是含有具有 不同亚基链组成的亚型的胞外基质蛋白。具体地，层粘连蛋白具有约15种亚型，包括5种a 链、4种链和3种y链的组合的异源三聚体。结合a链（al-a5)、f3链(m_M)和y链（y 1-Y 3)各自的数目以确定层粘连蛋白的名称。例如，由al链、链，yl链的组合构成的层粘连蛋 白命名为层粘连蛋白111，由a5链、m链、yl链的组合构成的层粘连蛋白命名为层粘连蛋 白-511并且由a5链、02链，Y 1链的组合构成的层粘连蛋白命名为层粘连蛋白-521。作为层 粘连蛋白，例如，可以使用衍生自哺乳动物的层粘连蛋白。哺乳动物的实例包括小鼠、大鼠、 豚鼠、仓鼠、兔、猫、狗、羊、猪、牛、马、山羊、猴和人。当生产视网膜色素上皮细胞用于移植到 人的目的时，优选使用人层粘连蛋白等。在目前阶段，已知人层粘连蛋白包括15种亚型。 [0033]作为本发明中的层粘连蛋白，可以使用任何亚型。例如，优选使用，显示对人多能 干细胞/或人视网膜色素上皮细胞表面上表达的整联蛋白中的至少一种的结合特异性的层 粘连蛋白亚型，优选显示对人多能干细胞和人视网膜色素上皮细胞表面上表达的整联蛋白 以及在人视网膜色素上皮细胞表面上表达的整联蛋白的结合特异性的层粘连蛋白亚型。人 多能干细胞的表面上表达的整联蛋白的实例包括aem整联蛋白等，并且在人视网膜色素上 皮细胞的表面上表达的整联蛋白的实例包括 a601整联蛋白、a301整联蛋白、a701整联蛋白 等。根据上述，作为优选的层粘连蛋白，优选使用显示对aem整联蛋白的结合特异性，并且 能够稳定地粘附在分化诱导的初始阶段中的多能干细胞和在分化诱导的后期阶段中的视 网膜色素上皮细胞或其祖细胞的层粘连蛋白。根据这样的方面，在层粘连蛋白亚型中层粘 连蛋白511和层粘连蛋白-521是优选的。层粘连蛋白511具有对a6m整联蛋白以及a3m整联 蛋白和整联蛋白的结合特异性，并且层粘连蛋白-521具有对aem整联蛋白的结合特异 性以及对a3m整联蛋白更强的结合特异性。因此，通过提高对视网膜色素上皮细胞的粘附 活性，这些亚型有助于多能干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的诱导效率的提高，或视网 膜色素上皮细胞的维持培养的稳定化。
[0034] 本发明中的层粘连蛋白片段可以是任意的，只要其保留各自相应的层粘连蛋白的 功能。也就是说，在本发明中"层粘连蛋白片段"在各自链的长度方面并不限制，只要其是具 有构成异源三聚体的层粘连蛋白a链、龄连和Y链的分子，保留对整联蛋白的结合活性，并维 持细胞粘附活性。层粘连蛋白片段显示整联蛋白结合特异性，其对于原来的层粘连蛋白亚 型是变化的，并且可以发挥对表达相应整联蛋白的细胞的粘附活性。作为这样的层粘连蛋 白片段，优选的是层粘连蛋白-E8片段。
[0035] 层粘连蛋白-E8片段最初是通过用弹性蛋白酶消化小鼠层粘连蛋白-111得到的片 段之一，并鉴定为具有强的细胞粘附活性的片段(EMBO J.，3:1463-1468，1984.，J. Cell Biol.，105:589-598，1987)。当用弹性蛋白酶消化时，假定除了小鼠层粘连蛋白-111之外，层粘连蛋白中还存在对应小鼠层粘连蛋白-111的E8片段的片段。然而，除了小鼠 层粘连蛋白-111之外，迄今尚未报道通过用弹性蛋白酶的层粘连蛋白消化的E8片段的分离 和鉴定。因此，在本发明中使用的层粘连蛋白E8片段不需要是每种层粘连蛋白的弹性蛋白 酶消化的产物，但可以是重组的，只要其是具有类似于每种相应层粘连蛋白的细胞粘附活 性并具有对应于用弹性蛋白酶消化E8片段的结构的层粘连蛋白片段。也就是说，"层粘连蛋 白-E8片段(下文有时表示为"层粘连蛋白_E8")"在本发明中是指在a链、M连和Y链的每个 C-末端区域构成异源三聚体的分子，其保持对整联蛋白的结合活性，以及保持细胞粘附活 性。层粘连蛋白-E8显示整联蛋白结合特异性，其对于每种层粘连蛋白亚型是变化的，并且 可以发挥对表达相应整联蛋白的细胞的强粘附活性。
[0036]当具体说明时，层粘连蛋白-E8在本发明中是具有下列的层粘连蛋白片段， (1) 在功能上，至少相当于全长层粘连蛋白的细胞粘附活性和至少相当的整联蛋白结 合活性，和 (2) 在结构上，对应于小鼠层粘连蛋白-E8的结构，具体而言，对应于从层粘连蛋白三聚 体的卷曲螺旋C-末端区域到第1至第3 G结构域的结构。层粘连蛋白片段，特别是层粘连蛋 白-E8，从(1)的功能方面和(2 )的结构方面在以下进行更详细的说明。
[0037] (1)层粘连蛋白片段的功能 本发明的层粘连蛋白片段的实例包括显示对人多能干细胞/或人视网膜色素上皮细胞 表面上表达的整联蛋白中的至少一种的结合特异性的分子，优选显示对人多能干细胞和人 视网膜色素上皮细胞表面上表达的整联蛋白以及在人视网膜色素上皮细胞表面上表达的 整联蛋白的结合特异性的分子。这些整联蛋白如上文所述。
[0038]在本发明中的层粘连蛋白片段显示对整联蛋白的结合特异性，优选显示至少相当 于对每种相应的层粘连蛋白的结合特异性。优选使用显示对整联蛋白的特别强的亲和力的 层粘连蛋白片段。"显示对整联蛋白的特别强的亲和力的层粘连蛋白片段"是显示显著低的 解离常数的层粘连蛋白片段，如通过已知方法测量的，并且例如通过，例如在The Journal of Biological Chemistry (2009) 284，pp.7820-7831 的表 1 中所示方法测量的解离常 数。
[0039] 作为本发明的层粘连蛋白片段，使用具有细胞粘附活性，优选强细胞粘附活性的 层粘连蛋白片段。"具有强的细胞粘附活性的层粘连蛋白片段"是在细胞粘附测试中显示显 著强的粘附活性的层粘连蛋白片段，所述测试使用通过已知方法的测量，并且不超过lOnM 的所述片段的包被浓度显示不小于400个细胞/mm2的粘附细胞数，当例如进行The Journal of Biological Chemistry (2007) 282，pp. 11144-11154中所述的细胞粘附测定时。
[0040] 在本发明中，作为层粘连蛋白片段，优选使用显示对aem整联蛋白的结合特异性， 能够稳定地粘附在分化诱导的初始阶段中的多能干细胞并且能够稳定地粘附在分化诱导 的后期阶段中的视网膜色素上皮细胞或其祖细胞的层粘连蛋白片段。从这样的方面，层粘 连蛋白-511或层粘连蛋白-521等的片段在层粘连蛋白片段中是优选的，并且特别优选的是 层粘连蛋白511 E8和层粘连蛋白-521 E8。除了a6m整联蛋白之外，层粘连蛋白-511 E8还 具有对a3m整联蛋白和a7m整联蛋白的结合特异性，并且层粘连蛋白-521 E8具有对a6m 整联蛋白的结合特异性以及除了 aem整联蛋白之外对a3m整联蛋白更强的结合特异性。因 此，这种层粘连蛋白-E8可以促进多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的分化诱导效率的提 高，通过提高对视网膜色素上皮细胞的粘附活性。可替代地，这样的层粘连蛋白-E8可以促 进视网膜色素上皮细胞的维持培养的稳定化。
[0041] (2)层粘连蛋白片段的结构 在本发明中"层粘连蛋白片段"在各自链的长度方面并不限制，只要其是具有构成异源 三聚体的层粘连蛋白a链、M连和Y链的分子，保留对整联蛋白的结合活性，并维持细胞粘附 活性。这样的层粘连蛋白片段可以适当地由理解层粘连蛋白等的每个结构域的结构的本领 域技术人员设计。关于这样的层粘连蛋白片段，如上所述，优选地，如上所述或如图1所示， 结构对应于小鼠层粘连蛋白-111的弹性蛋白酶消化产物中具有细胞粘附活性的片段(E8片 段)的层粘连蛋白片段。即，其保持全长层粘连蛋白的结构域11(三链卷曲螺旋结构域)的一 部分(在图1中描绘的E8片段没有显示这样的方式，但实际上保持卷曲螺旋结构），并在E8的 N末端侧上与龄连的对应片段和y链的对应片段形成短的卷曲螺旋结构。在E8的C-末端侧 上，保持a链的G1-G3结构域结构。M连和y链通过形成经由在每个C末端侧的半胱氨酸残基 的二硫键彼此结合。
[0042] 如上述关于层粘连蛋白-E8,本发明中的层粘连蛋白片段可以是通过用弹性蛋白 酶处理天然层粘连蛋白而获得的酶处理的产物，或通过基因重组产生的重组体。
[0043] 当本发明的层粘连蛋白或其片段是重组体时，为了纯化目的等可以将标签键合到 N末端，只要保持相应的全长(天然)层粘连蛋白对整联蛋白的结合活性，并且细胞粘附性不 受损。这样的标签没有特别限制，并且可以提及例如，His标签、Flag标签、HA标签等。另外， 标签和层粘连蛋白或其片段之间的接头区域的序列没有特别的限制，只要保持相应的全长 (天然)层粘连蛋白的结合活性，并且细胞粘附性不受损。
[0044] 在本发明的层粘连蛋白或在其片段中，氨基酸序列的一部分可以缺失、添加或取 代，只要保持相应的层粘连蛋白对整联蛋白的结合活性，并且其细胞粘附性不受损。
[0045] 尽管E8片段通常在a链C末端侧缺少两个G结构域(G4和G5)，G5、G5结构域可以被部 分或全部包含在本发明的层粘连蛋白-E8中，只要保持相应的全长(天然)层粘连蛋白对整 联蛋白的结合活性，并且其细胞粘附性不受损。例如，G4、G5结构域可以部分或全部包含在 层粘连蛋白-511 E8中，只要保持等效水平的层粘连蛋白-511对整联蛋白a6m的结合活性， 并且细胞粘附活性不受损。
[0046]类似于全长层粘连蛋白，层粘连-E8的M连和y链经由卷曲螺旋部分的C末端侧上 的半胱氨酸键合。由于半胱氨酸影响整联蛋白结合活性，所以期望其未被取代或者缺失。此 外，由于Y链中所述半胱氨酸之后的C末端侧氨基酸也影响整联蛋白结合活性，所以也期望 其至少不缺失(J Biol Chem. 2007 Apr 13; 282(15): 11144-54. )〇 [0047]这种层粘连蛋白-E8的具体实例包括W02011/043405的实施例（3)中生产的 rhLM511E8。在本发明中，所述层粘连蛋白-511E8可以优选作为层粘连蛋白-E8利用。
[0048] 本发明中所使用的"培养基质"可以通过用本发明中的层粘连蛋白或其片段包被 培养器的表面来产生。如本文所使用的，"包被"培养器的表面意指层粘连蛋白或其片段通 过层粘连蛋白或其片段与培养器表面之前的一些相互作用对培养器表面的吸附，其中所述 层粘连蛋白或其片段的取向对于实现本发明的效果不会造成特别的问题。培养器没有特别 限制，只要其可以用于细胞培养，并且可以提及例如，皿（也称为培养皿）、有盖培养皿和板 (6孔、24孔、48孔、96孔、384孔、9600孔等的微量滴定板、微孔板、深孔板等）、瓶、载玻片、管、 细胞工厂、滚瓶、转瓶、中空纤维、微载体、珠等。本发明中的培养基质可以应用适当的表面 处理，只要层粘连蛋白或其片段的细胞粘附性不受损。
[0049] "粘附培养"在本发明中是指以下列状态的培养，目的细胞经由层粘连蛋白或其片 段粘附到培养器的底部，并且即使当培养期间轻轻摇动培养器时也不在培养基中漂浮。由 于本发明中使用的层粘连蛋白或其片段可显示非常优异的细胞粘附性，细胞接种后的细胞 优选通过包括快速颤抖培养器等的方法均匀地分散。目的细胞可以在粘附培养前后，在含 有层粘连蛋白或其片段的培养器中进行悬浮培养，只要可以达到本发明的目的。
[0050] 所述培养基由基础培养基、血清和/或血清替代物，以及其它组分构成。作为基础 培养基，可以组合使用通常用于培养哺乳动物细胞的一种或多种合成培养基，和例如，可以 获得市售的产品，诸如DMEM、GMEM等。
[0051] 作为血清，可以使用衍生自哺乳动物诸如牛、人、猪等的血清。血清替代物是用于 细胞培养的替换血清诸如胎牛血清等的低蛋白替换物，并且可以获得市售的产品，诸如敲 除血清替代物(KSR)、化学成分确定的脂质浓缩物(Gibco制造）、Glutamax(Gibco制造)等， 以及用于神经细胞培养的血清替代物N2、B27等。优选地，纯化的或通过重组生产的适当量 的白蛋白和细胞因子，进一步的脂质混合物等也可以独立地与基础培养基组合。在本发明 中，血清替代品是优选的，并且KSR是从目的细胞的质量管理方面特别优选的。
[0052]血清或血清替代物的浓度可适当设定在，例如0.5-30% (体积/体积）的范围内。浓 度可以是恒定的，或逐渐改变。例如，浓度可在以约1-3天(优选2天）间隔的阶段中降低。例 如，血清或血清替代物可以以20 %、15 %和10 %的浓度的3个阶段加入。
[0053]作为构成培养基的其它成分，Rho激酶抑制剂诸如Y-27632等可以用于抑制分散在 培养基中的人多能干细胞的细胞死亡。Rho激酶抑制剂可以在分化诱导步骤的一部分或整 个时期的时期加入。例如，未分化成目的细胞的不必要的细胞可以通过使用不含Rho激酶抑 制剂的培养基在分化诱导步骤的后期通过细胞死亡去除。
[0054]除上述组分之外，培养基还可以包含通常用于培养哺乳动物细胞其它组分。
[0055] 在本发明的生产方法中使用的人多能干细胞的浓度，没有特别限定，只要多能干 细胞可以是均匀地接种并且粘附培养是可能的。例如，当使用l〇cm皿时，其为每皿IX 105-1 X 108个细胞，优选2 X 106-5 X 107个细胞，更优选5 X 105-9 X 106个细胞。
[0056] 在本发明的生产方法中的粘附培养也可以在分化诱导因子的存在下进行。作为分 化诱导因子，可以利用已知作为促进分化诱导成目的细胞的因子的因子。由于本发明的生 产方法包括分化诱导成视网膜色素上皮细胞，期望使用分化成视网膜色素上皮细胞的分化 诱导因子。分化成视网膜色素上皮细胞的分化诱导因子的实例包括Nodal信号抑制剂、Wnt 信号抑制剂、音猬因子(Sonic hedgehog)信号抑制剂和激活素信号启动子等。
[0057] Nodal信号抑制剂没有特别的限制，只要其能够抑制由Nodal介导的信号转导，并 且可以使用蛋白、核酸、低分子量化合物等。Nodal信号抑制剂的实例包括蛋白、肽或核酸诸 如Lefty-A、可溶性Nodal受体、抗Nodal抗体、Nodal受体抑制剂等；低分子量化合物诸如 SB431542等等。具体地，容易获得并显示批次之间较小差异的低分子量化合物诸如 SB431542等是优选的。
[0058] Wnt信号抑制剂没有特别的限制，只要其能够抑制由Wnt介导的信号转导，可以使 用蛋白、核酸、低分子量化合物等。Wnt信号抑制剂的实例包括蛋白、肽或核酸诸如DKK1、 Cerberus蛋白、Wnt信号受体抑制剂、可溶性Wnt受体、Wnt抗体、酪蛋白激酶抑制剂、显性失 活的Wnt蛋白等;和低分子量化合物诸如CKI-7(N-(2-氨基乙基)-5_氯-异喹啉-8-磺酰胺）、 D4476(4-{4-(2,3-二氢苯并[1，4]二噁英-6-基)-5_吡啶-2-基-1H-咪唑-2-基}苯甲酰胺）、 IWR-1-内型（IWRle)、IWP-2等。具体地，容易获得并显示批次之间较小差异的低分子量化合 物是优选的。其中，具有选择性地抑制酪蛋白激酶I活性的低分子量化合物是优选的，并且 可以使用，例如，CKI-7，D4476等。
[0059] 激活素信号启动子的实例包括属于激活素家族、激活素受体、激活素受体激动剂 等的蛋白。
[0060] 这些分化诱导因子的浓度可以根据分化诱导因子的种类适当地选择。具体地，当 SB431542用作Nodal信号抑制剂时，浓度为，例如，0.01-50 yM，优选0.1 - 10 yM，更优选5 yM;当CKI-7用作Wnt信号抑制剂时，其以0.01 - 30 yM的浓度添加，优选0.1 - 30 yM，更优 选为3 yM。
[0061 ]在本发明的生产方法中，优选使用Nodal信号抑制剂（例如，SB431542)和Wnt信号 抑制剂(例如，CKI-7)的组合作为分化诱导因子。
[0062]根据上述方法的培养诱导多能干细胞分化为视网膜色素上皮细胞，从而视网膜色 素上皮细胞通常可以在接种多能干细胞的第25-45天生成。视网膜色素上皮细胞的生成可 根据上述方法来确认。当视网膜色素上皮细胞的生成被确认时，该培养基与用于视网膜色 素上皮细胞维持培养基交换，并且，例如，所述细胞优选进一步培养5 - 10天，同时以不超 过3天一次的频率交换培养基的总量。结果是，可以更清楚地观察到粘附到基底层粘连蛋白 的黑色素染料沉积的细胞群体和多边形扁平细胞群体。
[0063]作为视网膜色素上皮细胞的维持培养基可以使用，例如，描述于下列的那些I0VS， March 2004， Vol. 45， No.3， Masatoshi Haruta，等，I0VS， November 2011， Vol. 52，No. 12，Okamoto and Takahashi, J. Cell Science 122 (17), Fumitaka Osakada,等，I0VS, February 2008, Vol. 49, No. 2, Gamm,等，其由基础培养基、血 清和/或血清替代物，和其它组分构成。作为基本培养基，可以组合使用通常用于培养哺乳 动物细胞的一种或多种合成培养基，和例如，可以获得市售的产品，诸如DMEM、GMEM等。
[0064]作为血清，可以使用衍生自哺乳动物诸如牛、人、猪等的血清。血清替代物是用于 细胞培养的替换血清诸如胎牛血清等的低蛋白替换物，并且可以获得市售的产品，诸如敲 除血清替代物(KSR)、化学成分确定的脂质浓缩物(Gibco制造）、Glutamax(Gibco公司制造） 等，以及用于神经细胞培养的血清替代物N2、B27等。在本发明中，血清替代品是优选的，并 且B27是从目的细胞的质量管理方面特别优选的。
[0065]其它组分的实例包括L-谷氨酰胺、青霉素钠、硫酸链霉素等。
[0066]含有根据本发明通过培养得到的视网膜色素上皮细胞的细胞群体，除了视网膜色 素上皮细胞之外还可以包括，细胞诸如视觉细胞样细胞、神经样细胞、神经胶质细胞、穆勒 细胞、无长突细胞、双极细胞、水平细胞、神经节细胞，以及各种基质组分，诸如多糖、磷脂和 粘附蛋白等。更具体地，在根据本发明的培养中，接种多能干细胞后，细胞经由细胞粘附优 异的层粘连蛋白-E8迅速粘附并固定在培养器上，并且细胞大量分层覆盖粘附到培养器的 细胞以形成显示出各种形式的细胞层，即，从多能干细胞的接种约20天形成复合细胞层结 构，其中具有轻度升高并覆盖整体的细胞层是基底，并且在其上形成管状和缆索结构或蛛 网状或圆形的细胞团（cell group)。在形成结构后，通过进一步继续培养，可以诱导并产生 视网膜色素上皮细胞，同时埋在粘胶物质(胶状物质）中，其显然似乎是视觉细胞和细胞外 基质组分诸如各种基质蛋白、多糖和磷脂的混合物。
[0067] (2)通过在过滤器上引入在（1)中得到的"含有视网膜色素上皮细胞的细胞群体" 纯化视网膜色素上皮细胞的步骤 在此步骤中，为了从（1)中获得的"含有视网膜色素上皮细胞的细胞群体"纯化视网膜 色素上皮细胞，所述细胞群如下述引入到过滤器上。
[0068] 期望地如上述通过多能干细胞分化诱导得到含有视网膜色素上皮细胞的细胞群 体，并且所述细胞群体除了目的视网膜色素上皮细胞之外还可以包含，不期望的在不同分 化诱导阶段的视网膜前体细胞、视觉细胞和神经细胞，以及假定已由这些细胞产生的细胞 外基质组分。
[0069] 例如，在描述于W0 2005/123902的SFEB方法中，有必要在没有支撑细胞的情况下 专门的无血清培养基中在悬浮状态培养干细胞以形成聚集物，进行未成熟的神经祖细胞的 分化诱导并在光学显微镜下从由这些细胞形成的非粘附细胞聚集物中回收视网膜上皮细 胞团。即使在类似该方法的使用弱细胞粘附包被剂诸如聚-L-赖氨酸和明胶(改良SFEB方法 (描述于US20130224156 A1))的方法中，分化诱导后含有视网膜色素上皮细胞的细胞群体 被解离到一定程度，细胞聚集物通过悬浮培养一次形成，在显微镜下根据显色水平或黑-褐 色分布选择具有强黑色素生产性的细胞聚集物，所述细胞聚集物进一步进行粘附培养，并 且培养直至达到足够的纯度和细胞数，同时在它们生长时在显微镜下手动除去不规则形状 或异种细胞，并然后回收。在不使用层粘连蛋白或其片段作为基质的这种传统的方法中，视 网膜色素上皮细胞的出现率极低。即使当它们经历悬浮培养并生长以形成细胞聚集物时， 也有必要选择目标细胞之外的细胞以从每个细胞聚集物中手工除去，因为目标视网膜色素 上皮细胞与目标之外的细胞整合以形成组织。
[0070] 因此，通过常规已知的方法，当诱导从多能干细胞分化视网膜色素上皮细胞时，不 仅目的视网膜色素上皮细胞，而且目标细胞以外的细胞通常同时获得。此外，直接手工取出 并且纯化视网膜色素上皮细胞的复杂和专门的步骤，因为视网膜色素上皮细胞群体（显示 黑色素黑色-褐色的细胞聚集物）可以目视确认，但是量小，并且与细胞聚集物整合形成组 织。
[0071] 在本发明的纯化方法或生产方法中，由于利用层粘连蛋白或其片段作为基质用于 分化诱导，iPS细胞对基质的粘附明显稠密。然而，在分化诱导步骤的最后阶段，大量得到不 仅视网膜色素上皮细胞，还有目标细胞以外的细胞。通过在光学显微镜下观察，同时获得含 有视网膜色素上皮细胞的细胞群体以及目标细胞之外的视觉细胞与假定已由这些细胞产 生的细胞外基质组分的混合物(上述的果冻状物质），并且所述细胞群体明显埋在这些混合 物中（图3)。因此，如在上述改良的SFEB方法中，它们也需要在显微镜下直接收获，并且不能 方便地和有效地获得高纯度的视网膜色素上皮细胞，其中通过简单地将它们引入在过滤器 上纯化视网膜色素上皮细胞是不可以想象的。
[0072] 但是，通过由本发明人仔细观察，发现由于对作为基质的层粘连蛋白或其片段的 强粘附作用，分化诱导的视网膜色素上皮细胞没有简单地埋在多层细胞混合物中，而是存 在于包含其它视觉细胞等的果冻状物质下面（即在层粘连蛋白或其片段上），而不与果冻类 物质形成混合物。根据细胞群体这样的存在方式，获得了通过将视网膜色素细胞引入到过 滤器上的纯化方法的想法。这种纯化方法不需要象常规方法那样复杂、专门的和技术性纯 化步骤，并且是方便、高效和极有用的，因为其可用于一般用途。
[0073] 对于引入在过滤器上，所获得的细胞群体从培养器上脱离。脱离可以通过用移液 器或细胞刮刀等从接触表面物理刮去细胞，或通过用蛋白酶诸如胰蛋白酶、胶原酶、分散酶 等处理来进行。优选地，通过用蛋白酶诸如胰蛋白酶、胶原酶、分散酶等处理进行脱离。这些 处理可根据本身已知的方法进行。
[0074] 在上述脱离后的细胞群体优选进行处理，以解离细胞之间的粘附到一定程度，然 后引入到过滤器上，以便使覆盖的果冻类物质不会填充过滤器的孔。可以例如，通过往复吸 打几次细胞群体进行处理。过度的细胞解离处理是不期望的，因为它破坏了果冻状物质。此 外，期望通过离心与上清一起除去细胞混合物中的蛋白酶溶液及其残留杂质，和基质组分 等。
[0075] 回收如上所述获得的细胞群体，引入在过滤器上。根据本发明的方法，视网膜色素 上皮细胞经过过滤器，含有其它细胞(例如，视觉细胞等）和各种基质组分的混合物可以在 过滤器上被捕获，并且可以纯化视网膜色素上皮细胞。本发明中的过滤器处理对于过滤器 的形式和步骤等没有特别的限制，只要它可以实现目标。过滤器处理在下面详细解释。
[0076] 作为过滤器的材料，那些通常用于过滤细胞培养基的材料都可以使用。例如，其是 选自下列的至少一种的合成聚合物:聚酯、聚丙烯、聚苯乙烯、丙烯酸、人造丝、聚烯烃、维尼 纶、聚乙烯、尼龙、聚氨酯等。优选的是显示低极性和蛋白吸附少的尼龙等。难以使用那些显 示高极性和高离子电荷，或强疏水性的材料，因为过滤器的表面容易被果冻状物质覆盖。 [0077]尽管过滤器的形式可以是具有连通孔结构的多孔形式、纤维集合体、织物等，但是 更优选非织造布。因为果冻状物质覆盖在过滤器表面上造成堵塞，所以不期望使用扭曲的 纤维。
[0078] 过滤器的纤维直径没有特别限制，只要可以捕获不需要的组分并且视网膜色素上 皮细胞可以有效通过。考虑到视网膜色素上皮细胞的通过，其小于过滤器的孔径，并且，例 如，5 - 20 ym。
[0079] 尽管过滤器的孔径没有特别限制，只要可以捕获不需要的组分并且视网膜色素上 皮细胞可以有效通过，其通常为15 _ 100 Mi。考虑到细胞的大小和不必要组分的捕获效 果，20 - 70 mi是优选的，20 - 40 mi是更优选的。当孔径小于20 mi时，视网膜色素上皮细 胞的通过率可能会降低，并且当其大于100 Mi时，可能导致不必要组分的捕获效果在捕获 效率方面的降低。
[0080] 可通过扫描型电子显微镜拍摄过滤器，通过用图像分析仪在50个随机点测量由两 个或更多不同的纤维的交叉点形成的实质性孔的孔(最大长度)和并确定平均值来测量过 滤器的孔径。
[0081] 过滤器的使用形式可以是任何诸如球体、容器、盒、袋、管、柱等。具体优选的实例 包括具有约〇.l-l〇〇〇ml体积和直径约0.1 - 24cm的透明或半透明的圆柱形容器，或具有一 侧约0.1 cm - 20 cm长度，和约0.1cm - 5 cm厚度等的厚度的具有方形或矩形的四棱柱形 式。
[0082] 溶液通过过滤器可通过从含有细胞群体(细胞悬浮液)的袋等自然下落，或通过使 用注射器或栗进行。
[0083]通过上述操作，引入到过滤器上的细胞培养基中不必要的组分被过滤器捕获并且 视网膜色素上皮细胞选择性地通过过滤器，从而可以将细胞纯化。对于通过过滤器的液体 中细胞的数目，可以获得，例如，不小于80%的视网膜色素上皮细胞的纯度，优选不小于 90%，更优选不小于95%。对于纯度，进行Pax6、Bestrophin或Mitf免疫染色，当细胞用其中 的任何染色时，细胞被确定为视网膜色素上皮细胞，当在细胞中未见荧光时，检验细胞中是 否存在黑色素的深褐色-黑色显色，并且当确认生成色素时，可以确定细胞为视网膜色素上 皮细胞。此外，通过在包被有层粘连蛋白或其片段的新的培养容器中接种获得的细胞群体， 并再次进行所述纯化操作，可进一步提高纯度。在此阶段中得到的视网膜上皮色素细胞的 产率是通过SFEB改良方法的约50到100倍。
[0084] 根据本发明的生产方法，人多能干细胞可经由在细胞粘附方面优异的层粘连蛋白 或其片段迅速粘附到培养器，并且以固定化状态的培养显著地改善分化诱导效率，并且此 外，可以抑制在培养基交换期间的细胞损失。此外，可以非常有效地通过简单和容易的操作 在短时间内通过上述纯化步骤大量地获得高浓度的视网膜色素上皮细胞的细胞群体。此 外，根据本发明的生产方法，视网膜色素上皮细胞可以彼此粘附，以形成片状的结构。因此， 通过本发明的生产方法可以生产视网膜色素上皮细胞的片。如下面详细描述的，作为细胞 群体用作用于视网膜疾病的治疗的细胞移植治疗药，视网膜色素上皮细胞的片是有用的。
[0085] 如上所述生产的视网膜色素上皮细胞，也可以进行进一步扩增培养。扩增培养可 以通过如下进行，类似上述方法中，在包被层粘连蛋白或其片段的培养器上接种视网膜色 素上皮细胞，以允许细胞粘附到层粘连蛋白或其片段，并进行粘附培养。这样传代和扩增培 养选择，仅选择能够特异性粘附于作为基质的层粘连蛋白或其片段的细胞。结果是，由于主 导视网膜色素上皮细胞的单层结构稳定地保持，并且包含在分化诱导的视网膜色素上皮细 胞中的细胞(其不可以诱导分化)可以相对减少，其也可以用作视网膜色素上皮细胞的进一 步纯化方法。
[0086] 接种的视网膜色素上皮细胞的浓度没有特别限制，只要可以进行视网膜色素上皮 细胞的均匀粘附培养。例如，当使用l〇cm皿时，其为每皿1 X 105-1 X 108个细胞，优选2 X 106-5X 107个细胞，更优选5 X 105-1 X 107个细胞。
[0087] 在扩增培养中，层粘连蛋白或其片段，以及对培养基质的包被方法与上述那些相 同，并且因此是优选的实施方案。
[0088] 作为培养基，可以使用上述维持培养基用于视网膜色素上皮细胞。
[0089] 虽然培养期没有特别限制，接种视网膜色素上皮细胞后，优选进行培养同时用维 持培养基交换培养基的总量，不少于3天一次，持续约3周。培养后的细胞培养基优选进行与 上述步骤(2)相似的处理（即，从培养器脱离，任选的细胞间的解离处理，以及过滤处理），以 进一步纯化视网膜色素上皮细胞。此外，使用这样获得的视网膜色素上皮细胞，优选进行约 2周类似于上述的扩增培养，并且将得到的细胞培养基再次进行与上述的步骤(2)相似的处 理以进行进一步纯化。对于通过上述操作通过过滤器的液体中细胞的数目，可以获得，例 如，不小于85%的视网膜色素上皮细胞的纯度，优选不小于95%，更优选不小于99%。
[0090] 根据本发明的扩增方法，由于视网膜色素上皮细胞经由细胞粘附性优异的层粘连 蛋白或其片段被迅速固定培养器上，可以抑制培养基交换过程中的细胞损失，并且可以抑 制由于传代的细胞形态的变形，可以稳定地进行视网膜色素上皮细胞的维持培养和培养物 生长。此外，根据本发明的扩增方法，也可以直接或以悬浮液的形式利用膜状视网膜色素上 皮细胞团，所述膜状视网膜色素上皮细胞团从培养基质分离回收，用于固定到新的基质或 支撑材料(可生物降解的，多孔的，网状结构等）以形成适合用于细胞移植于其上的患处的 形状，并利用为治疗药物用于下面显示的视网膜疾病。
[0091] 2.视网膜色素上皮细胞 通过本发明的纯化方法或生产方法获得的视网膜色素上皮细胞具有高纯度并具有优 异的性能，无论单独作为细胞还是作为片使用。
[0092] 3.用于视网膜疾病的治疗药物 通过本发明的纯化方法或生产方法获得的视网膜色素上皮细胞，可作为细胞移植治疗 药使用，以悬浮液或片的配制形式移植到活生物体用于视网膜疾病的治疗。视网膜疾病是 与视网膜相关的眼科疾病，并且还包括与其它疾病，诸如糖尿病等的并发症。
[0093] 4.毒性，疗效评价药物 通过本发明的扩增方法或生产方法生产的视网膜色素上皮细胞可以用作正常或疾病 模型细胞用于筛选针对视网膜疾病的治疗性药物和针对其它并发症的治疗性药物，诸如疗 效评价糖尿病等，或其预防性药物，化学物质的安全性测试等，压力测试，毒性测试，副作用 测试，感染/污染测试。另一方面，它们也可以用于视网膜细胞特有的光毒性的毒性研究、毒 性测试等，视网膜兴奋性毒性等。其评价方法包括通过刺激、毒性测试诸如细胞凋亡评价 等，以及用于对从祖细胞正常分化为视网膜色素上皮细胞和视觉细胞的影响的评价测试 (表达的蛋白分析和吞噬能力测试，通过各种基因标志物的RT-PCR，细胞因子的ELISA等）， 光毒性的毒性测试等，对视觉功能的视网膜电位和跨上皮阻抗，自体免疫反应导致的细胞 损伤测试等。作为用于这些测试的细胞，可以使用不仅视网膜色素上皮细胞，还有其祖细 胞，并且可以提供例如，细胞通过接种粘附在其上的板、细胞悬浮液、其片或压块 (compac t)。它们可以用作人和动物测试的外推测试。
[0094] 在本说明书，包括专利和专利申请中引用的任何出版物中公开的内容，在此以其 整体并入作为参考，达到它们已在本文中公开的程度。本发明在下面通过参考实施例进行 更详细地解释，所述实施例不应当被解释为限制性的。
[0095] 实施例研究实施例1衍生自iPS细胞的RPE细胞的生产 试剂 ?分化诱导基本培养基(GMEM培养基（Invitrogen)、KSR(Invitrogen)、0.1 mM MEM 非 必需氨基酸溶液（11^;[1：1'08611)，111^丙酮酸钠（3161^)、0.1112-疏基乙醇（￥31^0?11代 Chemical Industries, Ltd.)、100 U/ml 青霉素-100 μg/ml 链霉素（Invitrogen)) ?初级分化诱导培养基（包含20%KSR、10yM Y-27632(Wako Pure Chemical Industries, Ltd. )、5 yM SB431542(SIGMA)、3yM CKI-7(SIGMA)的分化诱导基本培养基） ?二级分化诱导培养基（包含 15%KSR、10yM Y-27632(Wako Pure Chemical Industries, Ltd. )、5 yM SB431542(SIGMA)、3yM CKI-7(SIGMA)的分化诱导基本培养基） ?三级分化诱导培养基（包含 10%KSR、10yM Y-27632(Wako Pure Chemical Industries, Ltd. )、5 yM SB431542(SIGMA)、3yM CKI-7(SIGMA)的分化诱导基本培养基） ?四级分化诱导培养基(含10%KSR的分化诱导基本培养基） ?RPE维持培养基(67% DMEM 低葡萄糖(SIGMA)、29% F12(SIGMA)、1.9 mM L-谷氨酰 胺（Invitrogen)、1.9% B-27添加物（Invitrogen)、96 U/ml 青霉素钠、96 yg/mL链霉素硫 酸盐）。 _6] 视网膜色素上皮细胞的生产(分化诱导) 衍生自人外周血（单核细胞）的iPS细胞（1120C7,由京都大学提供）以9xl06个细胞/9 cm培养皿接种在层粘连蛋白包被的培养皿中（由Sumitomo Bakelite Co.，Ltd?制造）。通 过用0.5 yg/cm2的层粘连蛋白-511 E8片段的水溶液(蛋白公开于W0 2011043405的实施例 (3)中，（由Nippi制造（iMatrix-511，NIP-8920-02))包被9 cm 培养皿（BD FALCON)在37°C 不小于1小时，生产层粘连蛋白包被的培养皿。iPS细胞迅速粘附在培养皿中，并且没有确认 到悬浮聚集物的形成。
[0097]用培养的第一天作为第0天，从培养开始（1天）到大约40天（当确认色素细胞时）， 每天交换培养基的总量。培养基的组合物在如下所示阶段中改变。即，初级分化诱导培养基 (20 %KSR)用于1-4天，二级分化诱导培养基（15%KSR)用于5-8天，三级分化诱导培养基 (10%KSR)用于9-12日并且四级分化诱导培养基（10%KSR)用于从13日到大约40天（当确认 色素细胞时）。
[0098]大约40天之后，当确认色素细胞时，培养基的总量与RPE维持培养基以不低于每3 天一次交换，至多达47天。随着培养进行，细胞色素变得更暗，并且在第47天，观察到很多含 有暗色素细胞团。在第47天，回收含有色素细胞的细胞群体。
[0099]使用层粘连蛋白-511 E8片段作为包被剂，接种的iPS细胞以高密度迅速粘附到培 养皿，并且甚至在在分化诱导培养基中培养期间也稳定地保持粘附状态。因此，即使当培养 基的总量反复交换时，细胞损失也可以被抑制得较低。此外，相比当iPS细胞接种在包被胶 原蛋白的培养器上时，色素细胞的生成速度显著提高并且分化诱导效率显著提高。
[0100] 研究实施例2 RPE细胞(其它iPS细胞)的生产 通过类似于研究实施例1的方法，除了使用衍生自人皮肤（成纤维细胞）的iPS细胞 (201B7,京都大学提供)代替衍生自人外周血(单核细胞）的iPS细胞（1120C7,京都大学提 供），获得色素细胞。
[0101] 结果是，像研究实施例1，相对于接种的iPS细胞，色素细胞的生成速度显著提高并 且分化诱导效率显著提高。
[0102] 实施例1衍生自iPS细胞的RPE细胞的纯化与扩增 在第47天包含色素细胞的细胞群体，其在研究实施例1和研究实施例2的培养皿中经历 粘附培养（图3)，用0.01%胰蛋白酶-0.53 mM EDTA处理，并且细胞聚集物从培养皿脱离。然 后，细胞间的粘附通过温和吸打分离。在细胞混合物中的蛋白酶液体和其残留杂质与离心 上清一起被除去，然后，不必要的细胞通过经过细胞过滤器(DB Falcon Cell Strainer 40 Mi Nylon)的过滤器过滤分离法进行分离，并回收含有RPE细胞的细胞群体(48天）。
[0103]将获得的细胞以9xl06个细胞/9 cm培养皿接种在研究实施例1中所述的RPE维持 培养基中，在与研究实施例1相同的包被层粘连蛋白-511 E8的5个培养皿中，并进行静置培 养直到大约50天，当确认视网膜色素上皮细胞集落的粘附时。
[0104]从51天到71天，将培养基的总量用RPE维持培养基交换不少于3天一次持续3周，然 后使用过滤器进行过滤分离(纯化），接种到包被层粘连蛋白-511 E8的相同的5个培养皿的 每一个中并类似培养2周。结果是，视网膜色素上皮细胞从研究实施例1和研究实施例2的任 何细胞群体扩增到25皿（10 cm皿）的产率。所获得的细胞群体的纯度(n =4)为96.4%、 100%、98.6% 或 99.6%。
[0105] 作为一个实例，显示了具有98.6%纯度的皿的纯度计算数据。
[0106] 对于纯度，对于卩&16、86 8丨1'〇卩11；[11和組丨：[>进行免疫染色，并且当任一染色时，细胞 被判断是RPE细胞。当未观察到荧光时，检验细胞内黑色素的存在或不存在，并且细胞基于 色素的确认判断为RPE细胞（因为一些色素抑制荧光观察，所以即使当未观察到荧光时，在 色素的存在下细胞也判断为RPE细胞）。通过包括将各自作为阳性细胞添加的方法来确定纯 度。
[0107]此实施例提供类似的结果，即使当使用不同系的iPS细胞(201B7)时。此外，即使当 使用具有70 mi或20 wii孔径的过滤器进行类似此实施例的纯化时，也获得类似高纯度的 RPE细胞。
[0108]比较实施例1 通过类似于研究实施例1的方法进行分化诱导步骤，除了在研究实施例1的分化诱导步 骤中，使用用MPC(2-甲基丙烯酰磷酸胆碱)处理的非粘附培养皿(Nunc)进行悬浮培养，代替 使用包被层粘连蛋白-511 E8(BD FALCON)的培养皿的粘附培养。
[0109]结果是，几乎所有的色素细胞在分化诱导步骤中培养基交换过程中丢失，在第47 天不能回收色素细胞。
[0110] 比较实施例2 通过类似于研究实施例1的方法进行分化诱导，除了在研究实施例1的分化诱导步骤 中，使用包被聚-D赖氨酸和明胶的培养皿，代替包被层粘连蛋白-511 E8的培养皿进行粘附 培养。
[0111] 相比于层粘连蛋白-511 E8包被的培养皿，细胞对多聚-D-赖氨酸/明胶包被的培 养皿的粘附性弱，并且在培养基交换过程中细胞容易丢失。因此，通过目视观察色素细胞相 对于在培养皿中的总细胞的数目，在培养开始后第47天的色素细胞的比率为不大于研究实 施例1的1/20，并且分化诱导效率也明显较低。
[0112] (评价1)RPE细胞标志物的表达 根据Journal of Cell Science 2009 Sep 1 122 3169-79中描述的方法使用具有下 列序列的引物，对在研究实施例1和2,以及实施例1中获得的色素细胞进行RT-PCR分析。结 果是，发现RPE细胞特异性基因（RPE65、CRALBP、MERTK、BEST1)表达，类似于市售人RPE细胞 系，从而确认RPE细胞。
[0113] 此实施例提供类似的结果，即使当使用不同系的iPS细胞(201B7)时。作为代表性 实施例，使用RPE65获得的结果显示在图2中。
[0114] (评价2)细胞因子分泌能力 根据IOVS. 2006 47 612-3624中描述的方法通过ELISA针对PEDF的产生量，检测在研 究实施例1和2以及实施例1中获得的色素细胞。结果是，确认了它们类似地具有如成人视网 膜的RPE细胞的细胞因子分泌能力(表2)。
[0115] 表2 PEDF分泌量
[0116] 此实施例提供类似的结果，即使当使用不同系的iPS细胞(201B7 )时。
[0117] (评价3)吞噬能力 根据J Cell Sci. 1993 104 37-49中描述的方法并且使用FluoSpheres(注册商标)荧 光微球（Invitrogen，F13081)，针对吞噬能力分析在研究实施例1和2,以及实施例1中获得 的色素细胞。结果是，确认了细胞具有与市售的人RPE细胞系相同水平的吞噬能力。此评价 提供类似的结果，即使当使用不同系的iPS细胞（201B7)时。此外，即使当根据The Lancet 2012 379 713-720中所述方法，使用不同系的iPS细胞（201B7)和用于吞噬作用的pHrod Green E. coli BioParticles(注册商标）缀合物(Molecular Probes，P35366)时，也获得 了类似的结果。
[0118] (评价4)纯化前后的细胞群体表达的分析 在研究实施例1和2脱离的细胞聚集物通过细胞过滤网(DB Falcon Cell Strainer 40 ul Nylon)，并且保留在过滤器上的细胞群体和含有分离的视网膜上皮细胞团的细胞群体 分别进行基因表达分析并评价细胞类型和分化阶段。
[0119] 具体而言，通过定量RT-PCR法检测到特定基因的表达并且通过过滤器过滤的方法 评价视网膜色素上皮细胞的分离的效果。根据常规方法（RNeasy Micro试剂盒，79254， QIAGEN)在过滤器上下分离的细胞提取RNA，并且使用提取的RNA作为模板合成cDNA (Superscript III 反转录酶试剂盒，18080-044，Invitrogen, 0.5 yg/yL 寡核苷酸 (dT) 12-18 引物，invitrogen, 18418-012，invitrogen, 10 mM dNTP 混合物，18427-013，invitrogen)。使用合成的cDNA作为模板，在1)95°C持续20秒，2)95°C，持续1秒，3)60 °C，持续20秒（2)_3)的40个循环）（20 X TaqMan(注册商标）基因表达测定法，Applied Biosystems，2XTaqMan(注册商标）快速高级主混合物，4444557，Applied Biosystems)的 PCR条件下检测目标基因的表达。使用GATOH作为内标，对表达水平进行标准化，通过比较Ct 方法与如1的过滤器过滤之前目的基因的表达水平来计算相对值（图4)。用于基因扩增的引 物序列如下所示。 20 X TaqMan(注册商标）基因表达测定法（RAX(Rx))(Applied Biosystems) Hs00429459_ml 20 X TaqMan(注册商标)基因表达测定法(Pax6)(Applied Biosystems)Hs00240871_ ml 20 X TaqMan(注册商标)基因表达测定法(MITF)(Applied Biosystems)Hs01117294_ ml 20 X TaqMan(注册商标）基因表达测定法（RPE65)(Applied Biosystems) Hs01071462_ml 20 X TaqMan(注册商标）基因表达测定法（CRX)(Applied Biosystems)Hs00230899_ ml 20 X TaqMan(注册商标）基因表达测定法（VSX2(ChxlO))(Applied Biosystems) Hsl584047_ml 20 X TaqMan(注册商标）基因表达测定法（GAPDH)(Applied Biosystems) Hs02758991_gl〇
[0120]结果是，可以确认视网膜色素上皮细胞标志物(RPE65)及其祖细胞标志物Mi tf (色 素上皮细胞，祖细胞)在过滤器下高表达，并且在分化诱导的最初阶段所表达的标志物诸如 Pax6(祖细胞）、Rx(视网膜祖细胞）、Crx(视细胞祖细胞）、ChxlO(双极细胞)等，和目标细胞 以外的视觉细胞和神经细胞标志物在过滤器上高表达。由此认为，在分化诱导步骤的终点 使用纯化方法适宜作为有效地分离视网膜色素上皮细胞的方法。
[0121] 工业实用性 根据本发明的纯化方法，从多能干细胞诱导的视网膜色素上皮细胞，可以方便地以高 产率纯化。根据使用本发明的纯化方法的生产方法，视网膜色素上皮细胞可有效地和以高 纯度，通过使用包被有层粘连蛋白或其片段的培养基质的简单和容易的方法进行生产。本 发明的生产方法在分化诱导效率方面优异，并且可以通过简单和容易的操作纯化视网膜色 素上皮细胞，并且可以通过抑制在步骤期间的细胞损失以高产率生产视网膜色素上皮细 胞。通过本发明的方法生产的视网膜色素上皮细胞不仅对视网膜疾病的治疗，而且作为正 常和疾病模型细胞的生产或制备方法也是有用的。
[0122] 本申请是基于在日本提交的专利申请号2013-212345(申请日2013年10月9日），其 内容被完整并入本文。
【主权项】
1. 纯化视网膜色素上皮细胞的方法，包括将含有视网膜色素上皮细胞的细胞群体引入 在过滤器上并获得通过过滤器的细胞群体的步骤，所述细胞群体通过多能干细胞在层粘连 蛋白或其片段上分化诱导得到。2. 根据权利要求1的方法，其中所述层粘连蛋白或其片段是层粘连蛋白-E8片段。3. 根据权利要求1或2的方法，其中含有所述视网膜色素上皮细胞的细胞群体通过在分 化诱导后用细胞分离溶液处理进行回收。4. 根据权利要求3的方法，其中所述细胞分离溶液包含胰蛋白酶。5. 根据权利要求1-4任一项的方法，其中所述过滤器具有20-70 μπι的孔径。6. 从多能干细胞生产视网膜色素上皮细胞的方法，其包括 (1)通过诱导在层粘连蛋白或其片段上的多能干细胞的分化，获得含有视网膜色素上 皮细胞的细胞群体的步骤;和（2)在过滤器上引入（1)中获得的细胞群体，以获得通过所述 过滤器的细胞群体的步骤。7. 根据权利要求6的方法，其中所述层粘连蛋白或其片段是层粘连蛋白-Ε8片段。8. 根据权利要求6或7的方法，其中在步骤（1)中获得的细胞群体通过用细胞分离溶液 处理含有视网膜色素上皮细胞的细胞群体进行回收。9. 根据权利要求8的方法，其中所述细胞分离溶液包含胰蛋白酶。10. 根据权利要求6-9任一项的方法，其中所述过滤器具有20-70 μπι的孔径。11. 通过权利要求6-10任一项的方法获得的视网膜色素上皮细胞。12. 通过权利要求6-10任一项的方法获得的视网膜色素上皮细胞片。
【文档编号】A61P27/02GK105849254SQ201480055588
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2014年10月9日
【发明人】泽田昌典, 关口清俊
【申请人】希里欧斯株式会社, 国立大学法人大阪大学