专利名称：用于治疗视网膜变性病的改良模式的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及用于视网膜变性和其它视觉障碍的改良的基于细胞疗法及帕金森氏病治疗和用于使哺乳动物胚胎干细胞和哺乳动物胚胎衍生细胞分化成视网膜色素上皮(RPE)细胞和其它眼球组织包括但不限于视杆、视锥、两极、角膜、神经、虹膜上皮、和祖细胞的方法。
背景技术：
中枢神经系统(CNS)的许多部分都呈现出薄层状的组织，而神经病理学过程通常涉及这些复合细胞层中一层以上的组织。CNS疾病常常包括神经细胞损失，而且由于缺乏内源性的再生，CNS相关疾病后功能的有效恢复非常有限或者没有。具体而言，常见的视网膜疾病中已知的年龄相关的黄斑变性(AMD)是由于光感受器与视网膜色素上皮(RPE)一起损失造成的，另外不定量的涉及内核层(INL)的中间(“传递”)神经元。因此，恢复中度至高度敏锐的视觉需要从功能上置换某些或所有的受损细胞层。
在解剖学上，色素性视网膜炎(RP)，一种遗传性的视网膜病变，是光感受器细胞核数目持续减少导致视力丧失。尽管大部分形式RP之间表型相似，但它们潜在的细胞机制是不同的，且是由于许多基因的各种突变造成的。大部分涉及的突变改变了光感受器细胞特异性基因的表达，其中大约10％是由于视紫红质基因的突变造成的。在该疾病的其它类型中，调控凋亡的基因被改变了(例如，Bax和Pax 2)。AMD是包含分子水平上病因可能有所不同的一系列病变在内的一种临床诊断。所有的AMD病例都具有在中央视网膜内光感受器细胞丢失的特征。不过，这一共同的最终现象似乎是早期RPE、新血管形成和潜在脉络膜水平异常的次级后果。后者可能涉及光感受器膜翻折困难，具体机理目前尚不清楚。
此外，视网膜色素上皮是眼睛内最重要的细胞类型之一，因为它对于维持光感受器功能而言至关紧要。它具有几种复杂的功能，包括对视杆和视锥的脱落外部片段的吞噬作用、维生素A的代谢、视网膜底空间内代谢物交换中涉及的黏多糖合成、代谢物的转运、血管发生的调控、光吸收、图像分辨率的增强以及通过诸如蛋白酶和蛋白酶抑制剂等分泌蛋白进行的视网膜内许多其它功能的调控。
在AMD的某些病例中显现的另一特征是出现异常的血管，这导致了大家所知道的脉络膜新血管形成(CNV)病。这种新血管(“湿的”)形式的AMD特别具有破坏性，而且似乎是由于对血管发生缺乏适当的调控所造成的。RPE功能障碍造成的脉络膜破裂使得新血管从脉络膜循环进入视网膜底空间，在那它们可破坏外部区段组织并引起血管渗漏或出血导致额外的光感受器损失。
CNV可激光定向治疗。因此，激光治疗“湿”AMD在美国是普遍使用的。不过，这通常存在令人不快的副作用，因此患者不满意治疗效果。这是由于如果发生了激光烧伤，它们会涉及光感受器死亡和视野内相应部分的绝对的、不能挽回的视觉缺失。此外，激光治疗不能使潜在的易患病体质向CNV的发展。事实上，激光烧伤已被用作常规方法诱发猴子的CNV(Archer和Gardiner″1981)。在诸如英国等其它国家内斑点激光治疗CNV的使用要保守的多。对于更常见的“干”式AMD则没有一般公认的疗法，其中存在与斑点内RPE萎缩的不规则碎片重叠的光感受器损失和被称为玻璃疣的相关胞外物质。
由于RPE在光感受器维护和血管发生的调控中起重要作用，各种体内RPE功能障碍都与改变视力的疾病相关，诸如色素性视网膜炎、RPE脱离、发育不良(displasia)、萎缩、视网膜病变、黄斑变性或变性，包括年龄相关的黄斑变性，它们可导致光感受器损伤和失明。
特别是除了AMD之外，影响黄斑的多种其它变性疾病包括，但不局限于视锥变性、视锥-视杆变性、malattia leventinese、多因蜂窝状萎缩(Doyne honeycomb dystrophy)、Sorsby′s变性、Stargardt病、pattern/butterfly变性、贝氏卵黄状变性、北卡罗林纳变性、中央网形脉络膜变性、血管样条纹症和毒性黄斑变性。
一般可继发地影响黄斑的视网膜病变包括视网膜脱离、病理性近视、色素性视网膜炎、糖尿病性视网膜病变、CMV视网膜炎、闭塞性视网膜血管病、早熟的视网膜病变(ROP)、脉络膜破裂、眼组织胞浆综合症(POHS)、弓形虫病和Leber′s先天性黑朦。所有以上列举的都不是穷举的。
所有以上病征均涉及光感受器的损失，因此，可供选择的治疗方法是不多的且不够的。
因为它的伤口修复能力，RPE已被广泛试验用于移植治疗中。2002年，进入试验的一年，患者显示出30-50％的改善。在几种动物模型和人中都显示出(Gouras等，2002，Stanga等，2002，Binder等，2002，Schraermeyer等，2001，由Lund等综述，2001)RPE移植具有良好的视觉恢复潜能。不过，即使在诸如眼部等免疫特许的位置，也存在移植物排斥反应的问题，阻碍了在异源移植时利用此方法。尽管新的光感受器(PRCs)已通过移植被从实验上引入，但被移植的PRC在与宿主视网膜原存活神经元之间的连接非常勉强。对胚胎组织来源的RPE细胞的依赖是另一问题，因为这些细胞已显示出非常低的增殖潜能。Emory大学的研究者进行了一个试验，即他们将来自人眼供体的RPE细胞进行体外培养并移植给6名晚期帕金森症患者。尽管移植一年后发现症状减轻了30-50％，但因眼睛供体不足，仍未经FDA核准，并会依然存在超过捐赠眼组织所能提供的需求。
迄今为止，利用异位RPE细胞的疗法已显现出类似成纤维细胞的作用，并且与许多破坏性视网膜并发症相关，包括轴突损失(Villegas-Perez等，1998)和具视网膜脱离现象的增殖性玻璃体视网膜病变(PVR)(Cleary和Ryan，1979)。以松散的片状形式运送的RPE趋向于卷起来。这导致光感受器不能有效覆盖以及多层具有错误极性的RPE，可能造成囊肿形成或黄斑水肿。
有关运送神经视网膜移植物至患者眼睛的视网膜下(黄斑下)空间的情况可参阅文献Kaplan等(1997)，Humayun等(2000)和delCerro等(2000)。其中存在的一个严重问题是神经视网膜移植物通常在功能上不能与宿主视网膜一体化。此外，缺乏完整的RPE单层意味着RPE功能障碍或脉络膜的破坏未被矫正。二者都是视觉丧失的基本前提条件。
因此，在任一目前的治疗方法中都不存在有效的重组RPE的方式，因此各种方法都仍有不足，尤其是在移植物和宿主视网膜之间存在的功能不联贯的基本问题。
因此需要有改进的视网膜治疗方法。
发明概述本发明的目的是提供用于由干细胞衍生眼球细胞的改良方法，所述细胞包括但不限于神经细胞包括水平细胞和无长突细胞、视网膜细胞诸如视杆和视锥、角膜细胞、血管细胞、及RPE和RPE样细胞，和提供用于治疗视网膜变性的改良方法和疗法。具体而言，这些方法牵涉由人胚胎干细胞衍生的RPE和RPE样细胞的使用。
本发明的一个实施方案提供了使用衍生自哺乳动物胚胎干细胞的RPE细胞、RPE样细胞、这些细胞的祖细胞或任何两种或三种上述细胞的组合的视网膜变性疗法生成细胞的改良方法，以治疗多种状况，包括但不限于色素性视网膜炎和黄斑变性及相关状况。可使用本发明生成的细胞类型包括但不限于RPE、RPE样细胞、和RPE祖细胞。还可生成的细胞包括虹膜有色上皮(IPE)细胞。视觉相关的神经细胞包括中间神经元(例如，内核层(INL)的“传递”神经元)和无长突细胞(在垂直方向第二突触水平上相互作用的中间神经元，所述途径由光感受器-两极-神经节细胞链组成，它们在内网织层(IPL)内突触水平上活跃并用于将呈递给神经节细胞的视觉信息整合、调整并放入一暂时的区域内)也可利用本发明产生。此外，还可产生视网膜细胞、视杆、视锥和角膜细胞。在本发明的另一实施方案中，还可产生提供眼睛脉管系统的细胞。本发明的细胞可利用玻璃体切割术被移植入视网膜底空间。
非限制性的例子包括将这些细胞在悬浮液、基质或基底中进行移植。可治疗的色素形视网膜炎的动物模型包括啮齿动物(rd小鼠、RPE-65敲除小鼠、桶状样小鼠、RCS大鼠、猫(阿比西尼亚猫)，以及狗(视锥病变″cd″狗、进行性视杆-视锥病变″prcd ″狗，早期视网膜病变″erd″狗、1型、2型和3型视杆-视锥发育异常″rcd1，rcd2 & rcd3″狗、光感受器发育异常″pd″狗和Briard″RPE-65″(狗)。用行为试验、荧光血管造影术、组织学或功能检测进行评估，所述的功能检测有诸如检测细胞完成吞噬作用的能力(光感受器片段)、维生素A的代谢、紧密连接点传导性等，或者用电子显微镜进行检查。与只局限于使用眼睛供体组织可能治疗的患者人数相比，此处所提出方法的众多优势之一在于它的生产能力和能治疗更多的患者。
本发明的另一实施方案提供了使hES细胞自发分化成具有无数RPE特征的细胞的方法。这些PRE制品能在培养中表现有所变化并在多次传代中仍保持RPE的特征。本发明还提供了使已建立的RPE细胞系分化成预备的神经元细胞系、角膜细胞、视网膜细胞的方法，非限制性的例子是通过使用bFGF或FGF。
本发明的另一实施方案是从现存的和新的ES细胞系中衍生出新的RPE细胞系和祖细胞的方法。当它们来自不同ES细胞系时，它们在特性上可能有所变化，诸如RPE样细胞的生长速率、色素表达或培养中的去分化和再分化。它们在功能和核型稳定性上可能有某些变化，因此希望能提供针对新RPE系列和新ES细胞系衍生物的方法，使得可以挑选具有预期特性的细胞系，能被无性繁殖选择，以产生纯的高质量的RPE样细胞群。
也可来源于现存的和新的ES细胞系的细胞包括虹膜有色上皮(IPE)细胞。在另一实施方案中，包括中间神经元(例如，内核层(I NL)的“传递”神经元)和无长突细胞在内的视觉相关神经细胞也可利用本发明产生。此外，可产生视网膜细胞、视杆、视锥和角膜细胞。在本发明的另一实施方案中，还可产生提供眼睛脉管系统的细胞。
本发明的另一实施方案是产生具有增强的预防新血管形成能力的RPE细胞系衍生物或RPE细胞前体的方法。所述细胞可通过如下方式产生，即使来自患者的体细胞老化，从而使端粒酶缩短，其中细胞正常复制寿命的10％被跨越，然后使用所述体细胞作为核转移供体细胞产生过表达诸如色素上皮衍生因子(PEDF/EPC-1)等血管发生抑制剂的细胞。或者所述细胞可用抑制新血管形成的外源基因遗传修饰。
本发明的另一实施方案利用了在HLA区域具有纯合性的ES或胚胎来源细胞库，从而使所述细胞在其HLA抗原上的复杂性降低。
因此，本发明的另一实施方案包括ES来源RPE样细胞的定性。尽管ES来源的有色上皮细胞在其形态学、行为和分子标记上都非常类似RPE，但它们的治疗价值取决于它们发挥RPE作用且不致癌的能力。因此，用以下一种或多种技术对ES来源RPE细胞进行表征(i)评估它们的功能性，即光感受器片段的吞噬能力、维生素A的代谢、伤口愈合能力；(ii)通过动物模型(作为非限制性的例子，此处可用SCID小鼠)移植评估RPE样ES细胞衍生物的多能性；(iii)RPE样细胞的表型和核型；(iv)通过基因表达图谱评估ES细胞来源RPE样细胞和RPE组织；(v)在蛋白质水平评估RPE分子标记物的表达，包括促贝斯特素(bestrophin)、CRALBP、RPE-65、PEDF。也可基于细胞中眼睛发育通常所需的转录激活剂的表达对其进行评估，包括rx/rax、chx10/vsx-2/alx、ots-1、otx-2、six 3/optx、six6/optx2、mitf、pax6/mitf和pax6/pax2(Fischer和Reh，2001，Baumer等，2003)。
本发明的另一实施方案是用至少以下一种技术对ES来源RPE样细胞进行定性的方法(i)评估ES来源RPE样细胞的功能性；(ii)通过动物模型移植评估RPE样ES细胞衍生物的多能性；(iii)RPE样细胞的表型和核型；(iv)评估基因表达图谱；(v)在蛋白质水平评估RPE的分子标记物的表达；以及(vi)眼睛发育正常需要的转录激活剂的表达。在另一实施方案中，这些技术可被用于评估多重hES细胞来源的细胞类型。
本发明的另一实施方案是不产生ES细胞系，直接从人和非人动物桑椹胚或胚泡期胚胎(EDCs)衍生RPE细胞和RPE前体细胞。
胚胎干细胞(ES)在未分化阶段可体外不确定的维持并实质上能分化成任一细胞类型。因此人的胚胎干细胞(hES)可用于研究人细胞的分化，并被考虑作为移植疗法的可能来源。迄今为止，已有关于人和小鼠ES细胞分化成许多细胞类型的报道(由Smith综述，2001)，所述细胞类型包括心肌细胞[Kehat等，2001，Mummery等，2003Carpenter等，2002]、神经元和神经前体(Reubinoff等，2000，Carpenter等，2001，Schuldiner等，2001)、脂肪细胞(Bost等，2002，Aubert等，1999)、肝细胞样细胞(Rambhatla等，2003)、造血细胞(Chadwick等，2003)、卵母细胞(Hubner等，2003)、胸腺细胞样细胞(Lin RY等，2003)、胰岛细胞(Kahan，2003)和造骨细胞(Zur Nieden等，2003)。
本发明的另一实施方案是鉴定来源于胚胎、胚胎干细胞系或其它胚胎细胞并通过比较体内来源细胞和所述细胞的信使RNA转录物发现它具有分化成有用的细胞类型的能力的细胞的方法，所述细胞诸如RPE细胞、造血细胞、肌肉细胞、肝细胞、胰腺β细胞、神经元、内皮、祖细胞或细胞疗法或研究中有用的其它细胞。此方法方便了正常表型细胞的鉴定，并可优化细胞用于细胞疗法和研究中。
本发明为人ES细胞分化成神经元系列中的特化细胞、视网膜色素屏障上皮(RPE)提供了准备条件。RPE是脉络膜和神经中枢视网膜之间的一层浓密有色上皮单层。它是血流和视网膜之间屏障的一部分，它的功能包括对脱落视杆和视锥外部区段的吞噬作用、杂散光的吸收、维生素A的代谢、视黄醛衍生物的再生和组织修复。(Grierson等，1994，Fisher和Reh，2001，Marmorstein等，1998)。通过其黑色细胞且鹅卵石状的细胞形态很容易识别RPE。此外，有数种已知的RPE标记物，包括细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)，一种同样发现于顶突处的胞质细胞(Bunt-Milam和Saari，1983)；RPE 65，视黄醛衍生物代谢中涉及的胞质蛋白(Ma等，2001，Redmond等，1998)；促贝斯特素，贝斯特卵黄状黄斑变性基因的产物(VMD2，Marmorstein等，2000)和色素上皮衍生因子(PEDF)，具有制管张特性的48kD分泌蛋白(Karakousis等，2001，Jablonski等，2000)。
RPE的不寻常特性是其表观可塑性。RPE细胞在有丝分裂期通常是静止的，但受损伤或光凝固后可开始分裂。RPE细胞邻近受损平面并增殖形成新的单层(Zhao等，1997)。几种试验已表明RPE单层可产生成纤维细胞外观的细胞，它稍后能恢复成其最初的RPE形态(Grierson等，1994，Kirchhof等，1988，Lee等，2001)。目前仍不清楚分裂的细胞和有色上皮层是否来自同一世系，因为分离出了两种RPE细胞群上皮状的和纺锤状的(McKay和Burke，1994)。在体外，取决于生长因子的组合和基质，RPE可作为上皮保持或快速去分化并变成增殖性的(Zhao1997，Opas和Dziak，1994)。有趣的是，在长期的静止培养中可重新出现上皮的表型(Griersion等，1994)。
在哺乳动物发育中，RPE与神经中枢视网膜-眼泡神经上皮具有相同的祖先。在某些情况下，有人提出RPE可反式分化成神经元祖细胞(Opa s和Dziak，1994)、神经元(Chen等，2003，Vinores等，1995)和晶状体上皮(Eguchi，1986)。可刺激RPE变成神经元的因子之一是bFGF(Opaz和Dziak，1994，与眼睛发育通常所需的转录激活剂表达相关的过程，包括rx/rax、chx10/vsx-2/alx、ots-1、otx-2、six3/optx，six6/optx2、mitf和pax6/pax2(Fischer和Reh，2001，Baumer等，2003)。最近，研究显示小鸡视网膜边缘包含神经干细胞(Fischer和Reh，2000)且在该区域内表达pax6/mitf的有色细胞能响应FGF形成神经细胞(Fisher和Reh，2001)。
本发明为从hES衍生小梁网细胞以及为遗传修饰小梁网细胞用于青光眼治疗提供了条件。
本发明还为从RPE祖细胞和RPE样细胞衍生出小梁网细胞以及为遗传修饰小梁网细胞用于青光眼治疗提供了条件。
本发明包括不产生ES细胞系、直接从人和非人动物桑椹胚或胚泡期胚胎(EDCs)产生RPE细胞和RPE前体细胞的方法，包括a)体外维持未分化状态的ES细胞；b)使ES细胞分化成RPE和RPE前体细胞；并c)通过比较所述细胞和体内来源细胞的信使RNA转录物鉴别RPE细胞。
本发明另外提供了RPE系或RPE细胞前体的衍生方法，所述RPE细胞具有增强的防止新血管形成的能力，所述方法包括a)使来自动物的体细胞老化，从而使端粒酶缩短，其中细胞正常复制寿命的10％被跨越；和b)使用所述体细胞作为核转移供体细胞产生过表达血管发生抑制剂的细胞，其中的血管发生抑制剂可以是色素上皮衍生因子(PEDF/EPC-1)。
本发明提供了用hES细胞来源RPE、RPE-样和/或RPE祖细胞治疗帕金森症的方法。这些可通过立体定位性内条纹植入或微载体递送。或者，它们可不使用微载体递送。也可通过本领域技术人员已知的任何方法扩大培养细胞并用于治疗帕金森症。
本发明的其它特征和优势将由以下详述体现。
附图描述
图1A-F是显示自然分化hES细胞内有色区外观(RPE细胞的特征)的一组照片。图1A是在6孔板中黏附培养2.5个月后有色区的照片；图1B是在EB中培养2.5个月后有色区的照片，放大倍数45x；图1C是黏附培养的有色区的照片；图1D是EB培养的有色区的照片；图1E是有色区和其它培养物之间边界的照片，x200；图F与图E相同，除了放大倍数是x400之外。A和B中的箭头指向有色区。
图2A-F是显示培养过程中色素沉积和上皮形态丧失和恢复的一组照片。图2A是显示初级EB生长晕的照片，1周；图2B是显示用胰酶分离的原代培养细胞照片，1周；图2C是显示被增殖细胞环绕的上皮岛的照片；图2D是显示培养1个月后色素沉积和上皮形态恢复的照片；图2E是显示传3代后培养物的照片，放大倍数为x200；图2F显示的培养物与E相同，放大倍数为x400。Hoffinan显微镜。黑箭头指向有色细胞，白箭头显示无色素的生长细胞。
图3左组图(A-D)和右边组图是一组照片和一张曲线图-显示了hES细胞来源有色上皮细胞中RPE的标志。图3A和3B是显示RPE标志促贝斯特素免疫定位的照片和相应的相位显微镜视野，放大倍数为x200；图3C和3D是显示CRALBP和相应相差显微镜视野的照片，放大倍数为x400。箭头显示的是促贝斯特素(A)和CRALBP(C)对有色细胞的共定位(C，D)；箭头状物指向无色区内无这些蛋白质(A，B)的着色(C，D)。图3右组图显示用促贝斯特素(a)和CRALBP(b)抗体进行的细胞裂解物(系hES#36)蛋白质印迹分析的照片和图表；c，d-未分化的hES细胞，c--抗CRALBP抗体的对照，d-抗促贝斯特素抗体的对照。
图4显示的照片证明了标志物Pax6(图4A)、Pax2(图4E)和mitf(图4B、图4F)在长期静止培养的RPE样细胞中的表达。图4C、图4G-相差，图4D、图4H-Pax6/mitf/相差(图4A、图4B、图4C)和Pax2/mitf/相差(图4E、图4F、图4G)的合并图像。
图5A-B显示了人胚胎来源细胞培养中RPE分化的照片绕过了ES细胞系衍生阶段。
图6显示了RPE制品的转录比较，图6A-F-基于本体论的注释，此表代表了RPE相关基因针对hES细胞来源视网膜色素上皮(hES-RPE)、hES细胞来源反式分化细胞(hES-RPE-TD)、ARPE-19和D407和新鲜分离的人RPE(fe-RPE)的表达。图6G-显示已知的RPE特异性存在的更多资料，诸如黑色素的生物合成、视觉-视黄醇结合，只在胎儿RPE和ES-RPE中有，但在ARPE-19中没有。
发明详述本发明的多种实施方案详述于此并可能通过所提供的实施例进行了进一步的说明。当应用于本说明书和以下全部权利要求中时，除非上下文明确指出，否则“一个”、“一种”和“这个”的意思包括多于一个的涵义。此外，当用于本说明书中时，除非上下文中明确指出，否则“在里面(in)”的意思包括“在里面(in)”和“在上面(on)”。
在本发明的上下文和使用各术语的特殊上下文中，用于此说明书的术语通常具有其在本领域内的普通涵义。在下文或说明书的其它部分对某些用于描述本发明的术语进行了说明，以便为实践者在描述本发明的组合物和方法以及如何制备和使用它们时提供附加的指引。为了方便，可能利用例如斜体字和/或引用语标志等使某些术语突出显示。使用突出标示对某一术语的范围和意思没有影响，在同一上下文中，无论它是否被突出标示，某一术语的范围和意思都是相同的。可以理解为同样的事情可以以一种以上的方式叙述。因此，对本文所论述的任一个或多个术语都可使用选择性的语言和同义词，无论该术语是否详述或讨论于此，对其都没有任何特殊的意义。本文提供了某些术语的同义词。描述一个或多个同义词并不排斥使用其它的同义词。在本说明书中任何部分所使用的实施例，包括本文所论述的任何术语的例子，都只具有说明的目的，决非限制了本发明的范围和领域，不考虑任何具体的理论或功能设置，只要数据的加工、收集、转换等是依照本发明进行的就应属于本发明的范围。
定义“胚胎”或“胚胎的”意指还未植入母体子宫膜的正在发育的细胞团。“胚胎细胞”分离自胚胎或包含于胚胎中的细胞。这也包括卵裂球，早到两细胞阶段获得的卵裂球和聚集的卵裂球。
术语“胚胎干细胞”指胚胎来源细胞。更具体而言是指分离自胚泡或桑椹胚的内细胞团且已作为细胞系连续传代的细胞。
术语“人胚胎干细胞”(hES细胞)指人胚来源的细胞。更具体而言hES指分离自人胚泡或桑椹胚的内细胞团并且已作为细胞系连续传代的细胞，还可以包括卵裂球和聚集的卵裂球。
术语“人胚胎来源细胞”(hEDC)指桑椹胚来源细胞、胚泡来源细胞，包括内细胞团、胚盾或上胚层的细胞，或者早期胚胎的其它全能或多能性干细胞，包括原始内胚层、外胚层和中胚层以及它们的衍生物，还包括卵裂球和来自聚集的单个卵裂球的细胞块或来自不同发育阶段的胚胎，但不包括已作为细胞系传代的人胚胎干细胞。
具有分化成人体几乎任何组织的能力的胚胎干(ES)细胞为移植疗法提供了能再生且具组织相容性的细胞的无限来源，因为免疫排斥的问题可通过核转移和孤雌生殖技术克服。
Hirano等人(2003)最近的发现显示小鼠ES细胞可在体外分化实验中产生眼睛样的结构。其中对有色上皮细胞进行了描述，类似视网膜色素上皮。
在Advanced Cell Technology上用灵长类和人ES细胞系进行的预备实验显示在专门的培养系统中这些细胞分化成可分离和传代的RPE样细胞。人和小鼠NT，Cyno parthenote ES细胞衍生物具有RPE的多种特性这些有色上皮细胞表达RPE的4种分子标志-促贝斯特素、CRALBP、PEDF和RPE65；象RPE一样，它们在培养中增殖的同时也伴随着去分化，即色素和上皮形态的丢失，在细胞形成单层并静止后这两种特征都恢复了。所述RPE样细胞很容易传代、冻结和融化，因此允许它们的扩充。
本发明的发明者进一步证明了人ES细胞在体外分化实验中也产生多种眼睛(玻璃体)样结构。
这些结构的组织学分析显示细胞的模式与早期视网膜发育一致，包括类似于视杆和视锥的细胞聚集体。
RPE移植目前，对RPE同种异体移植物的长期缓慢的排斥反应阻碍了科学家确定该RPE移植的疗效。有数种方法被考虑用于克服此障碍。最简单的方法是采用全身性的免疫抑制，这伴随着诸如癌症和感染等严重的副作用。第二条途径是移植患者自身的RPE，即自体移植物，但这种方法的缺点在于是用旧的、不健康的RPE去置换更不健康的RPE。还有第三条途径是利用来自同一患者的虹膜上皮(IPE)，但该方法的缺点在于IPE可能完成不了RPE的所有视觉相关功能。最终需要发现一种能消除排斥反应且研究者因此能确定在AMD和ARMD中RPE移植的真正疗效的方法。核转移和孤雌生殖提高了被移植RPE细胞和祖细胞的组织相容性。色素性视网膜炎中的RPE缺陷色素性视网膜炎是一类遗传病，其中视觉感受器由于异常的遗传程序而逐渐被破坏。某些形式引起患者在相对年轻的时候就全部失明，而其它形式则显示出对视觉有少许损伤的特征性“骨针”视网膜变化。在全世界范围内该疾病患者大约有一百五十万人。在专门表达于RPE的基因中发现了引起常染色体隐性RP的两个基因缺陷。一个是由维生素A代谢中所涉及的RPE蛋白质(顺式视黄醛结合蛋白)造成的，第二个涉及RPE独特的另一种蛋白质RPE 65。一旦排斥反应被克服，这两种形式的RP都应能直接通过RPE移植进行治疗。这种治疗在几年前是难以想象的，那时候RP是一种没有希望治愈且了解甚少的失明症。
有关RPE移植的新研究显示有希望对视网膜病变进行治疗，包括黄斑变性在内。而且，许多晚期RP患者在进行胎儿视网膜细胞移植后重新获得了一定程度的有效视力。例如，一名患者从几乎看不见光改善到能数出放在离其脸部约6英尺距离处的手指。在第二个病例中，患者视力提高到能通过管状视野看见字母。在这些研究中移植是通过注射进行的，在现存的神经中枢视网膜下引入了新的视网膜细胞。尽管确定存活的细胞与其它神经元形成连接并在它们周围开始发挥类似光感受器的功能，但是因为所移植的胎儿细胞是异源的(即，非遗传匹配的)，所以不是所有的细胞都能存活的。前8名患者接受移植后大约一年，其中4名患者恢复了一定程度的视觉功能，而第五名患者表现出正在恢复的迹象。
三种新来源的人胚胎干细胞系在特性上与早先所述的相似(Thomson等1998，Reibunoff等，2000，Richards等，2000，Lanzendorf等，2001)它们在传了45代或超过130×2个种群后仍保持未分化的表型并表达未分化hES细胞的已知标志Oct-4、碱性磷酸酶、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81。在EB或长期黏附培养基中以及在畸胎瘤内所有的hES细胞系都分化成三个胚芽层的衍生物。以以下标准判断，其中一个hES细胞分化衍生物与视网膜色素上皮相似从形态学上看，它们具有典型的上皮鹅卵石单层外观并且在其胞质部分包含黑褐色的色素，这已知在人体内只存在于黑素细胞、角质形成细胞、视网膜和虹膜色素上皮(IPE)中。不过，黑素细胞是非上皮细胞，而角质形成细胞不分泌而只是积聚黑色素。这些细胞中存在一批RPE特异蛋白质—促贝斯特素、CRALBP、PEDF，表明它们可能与RPE而非IPE相似。另一相似处是被分离所色素细胞在培养中的行为，在正在增殖的细胞中观察到很少或没有色素，但在紧密堆积的上皮岛中则保留了色素，或者在细胞静止后新建立的鹅卵石单层中重新表达了色素。这样的现象在有关RPE细胞培养的文献中也有描述(Zhao等综述，1997)，且原先已报道过(Vinores等，1995)神经元标志物微管蛋白βIII在体外特异定位于正在分化的RPE细胞中，而不是具有典型RPE形态的细胞中，这反映了RPE的可塑性和其去分化成神经系统细胞系的能力。本发明的发明者观察到微管蛋白βIII以相同模式定位于原代和传代培养的RPE和RPE样细胞中，这反映了所述细胞在培养中的去分化作用或表明分开的细胞群最终分化成神经元，在长期培养的hES细胞整个分化过程中，它们最初的定位邻近有色细胞并可以与RPE样细胞一起被共同分离。
在正在生长的眼泡内，RPE和神经视网膜共有同一种双潜能神经上皮祖细胞，且它们的命运据显示是由Pax2、Pax6和Mitf决定的(Baumer等，2003)，后者是前两者的靶目标。Pax6在早期用作原神经基因的激活剂，而进一步发育后在RPE中有所下调，在成熟视网膜的无长突细胞和神经节细胞内保持一定的水平(Ashery-Padan和Gruss综述，2001)。在金鱼中，也发现了在有丝分裂期间活跃的再生神经元的祖细胞(Hitchcock等，1996)。本发明的发明者已发现许多RPE样细胞以类似于微管蛋白βIII的模式表达mitf和Pax6，并且只发现于长期培养的有色上皮岛周围的非上皮形态的非有色细胞中或具“部分”RPE表型的细胞中(轻微着色和松散堆积)。在新传代的增殖细胞中，几乎每个细胞中都能发现所有这些标志物，显示出或者RPE样细胞在增殖开始时向祖细胞阶段逆转，或者视网膜祖细胞大量增殖。有趣的是，在同样发现了上皮形态有色细胞岛的畸胎瘤中，Pax6表达于邻近有色区的无色细胞中(资料未显示)。先前的多种研究已显示了RPE在培养中的去分化及其它们的反分化成以下类型细胞神经元表型细胞(Reh和Gretton，1987，Skaguchi等，1997，Vinores等，1995，Chen等，2003)、神经元、无长突细胞和光感受器细胞(Zhao等，1995)、神经胶质细胞(Skaguchi等，1997)、神经视网膜(Galy等，2002)和神经祖细胞(Opaz和Dziak，1993)。所述的祖细胞可轮流与RPE样细胞共存于培养物中或作为RPE样细胞去分化的结果出现。同时，神经视网膜细胞在体外可反分化成RPE(Opas等，2001)，因此选择性的，微管蛋白βIII和Pax6阳性细胞可代表共分离的神经细胞或神经祖细胞反分化成RPE样细胞的瞬时阶段。
使用以下实施例所述方法可使hES细胞自发分化成RPE样细胞，且本发明的发明者注意到有色上皮细胞确实出现于6-8周以上的培养物中，且它们的数量随时间增加-在3-5个月内几乎每个EB都有一个大的有色区。除了所述的hES细胞系之外，还有6个更新的衍生hES细胞系转变成PRE样细胞，这表明由于ES细胞通常自发选择神经系统的方向，通过将默认设置为所述途径的高级阶段可产生RPE样细胞。还可能在所述的长期培养中，正在分化的hES细胞形成了一个多层的外环境，被许可的/或有益的分化信号来自细胞外基质和hES细胞分化衍生物所产生的生长因子。HES细胞分化成RPE样细胞的模型可作为有效的工具用于研究所述的微环境如何协调RPE分化和反分化。
RPE在光感受器的维护中起重要的作用，而体内的各种RPE障碍与许多视觉改变的疾病有关，诸如RPE脱离、营养不良、萎缩、视网膜病变、色素性视网膜炎、黄斑萎缩或变性，包括年龄相关的黄斑变性，它可导致光感受器受损和失明。由于它所具有的伤口愈合能力，RPE被广泛研究应用于移植疗法中。
研究表明在多种动物模型和人中(Gouras等，2002，Stanga等，2002，Binder等，2002，Schraermeyer等，2001，Lund等综述，2001)，RPE移植具有良好的视觉修复潜能。最近另一有关RPE移植的预期生态位被提出并甚至达到了临床试验阶段因为这些细胞分泌多巴胺，它们可用于治疗帕金森症(Subramanian，2001)。不过，即使在免疫特许的眼睛内，如果使用异源移植物，也存在移植的排斥反应的问题，从而阻碍了此方法的进步。另一问题是对胎儿组织的依赖性问题，因为成年RPE的增殖潜能非常低。
作为免疫相容性组织的来源，hES细胞被期望用于移植疗法中，因为免疫排斥的问题可用核转移即使克服。人ES细胞新分化衍生物-视网膜色素上皮样细胞以及所述分化体系的可靠性和简单性可能为移植提供了有吸引力的RPE细胞潜在来源。
实施例实施例1在长期培养中自发分化成有色上皮细胞在缺乏LIF、FGF和Plasmanate的条件下当hES细胞在MEF中培养过满时，它们形成了厚的多层细胞。约6周后，在较大的细胞丛中出现了黑色的细胞岛(图1)。这些黑色细胞可以用裸眼很容易观察到并且在图1A所示的细胞板中看起来象“雀斑”。在较高的放大倍数上，这些细胞岛看上去象典型的上皮细胞鹅卵石单层中紧密堆积的多边形细胞，在胞质中有褐色的色素(图1C)。细胞内的色素量有差异，岛中心部位具有最多的色素，而靠近边缘的最少(图1E、F)。
在前6-8周，当hES细胞形成胚状体(EB)时，有色上皮细胞出现于大约1-2％的EB中(图1B)。随时间推移，越来越多的EB发育成有色细胞，到3个月的时候几乎每个EB都有有色上皮区(图1D)。EB有色区内的细胞形态类似于黏附培养的细胞(图1D)。
实施例2有色上皮细胞的分离和培养本发明的发明者从黏附的hES细胞培养物和EB二者中分离有色上皮细胞。用酶(胰酶和/或胶原酶和/或ordispase)消化有色的多边形细胞，用玻璃毛细管选择性的从这些有色岛中挑选细胞。尽管小心的只挑选有色细胞，但分离的细胞群总是包含某些非有色细胞。将细胞在明胶或层粘连蛋白上铺1-2天后，这些细胞被认为是原代培养细胞(PO)。
原代培养物包含有色多边形细胞岛以及某些单个的有色细胞。培养3-4天后，看上去已失去了上皮细胞的形态(变得更平且细胞具有扁平状伪足)的无色细胞出现在某些细胞岛的外周(图2)。所述外周细胞数目随时间推移而增加，表明这些细胞正在增殖，2周后，新形成的单层细胞中大部分细胞不含或含很少的色素。继续培养2-3周后，有色上皮细胞开始重新出现，与最初的培养物没有明显的区别(图2)。
实施例3RPE标志物的检测将这些分化的人细胞初步定性为RPE是基于它们与先前所描述的RPE培养物的相似性，主要是，它们的上皮形态和含有色素。人体中有三种有色上皮细胞视网膜和虹膜有色上皮和角质形成细胞，但后者不分泌色素。上皮结构和鹅卵石的形态也不是其它有色细胞所共有的，例如黑素细胞。
还值得注意的是RPE细胞在培养过程中表现为丢失而后重新获得它们的色素和上皮形态(Zhao 1997，Opas和Dziak，1994)，而且有色细胞也有相似方式的表现，由此检验ES衍生细胞可能是RPE的假设，它们可以用针对已知RPE标志物促贝斯特素和CRALBP的抗体进行染色。图4(左边组图)显示了促贝斯特素(A)和CRALBP(C)的膜定位，在有色上皮岛中都能找到。不是所有的细胞都被这些抗体染色，而且染色的强度与色素表达和群落“紧密度”相关-在细胞更大且更松散堆积的各有色岛的边界处两种蛋白质都显示出较低的表达。
为了进一步表征可能的RPE细胞，用蛋白质印迹法分析了促贝斯特素、CRALBP的表达。图4(右侧组图)显示了细胞裂解物中相应于促贝斯特素，68kD(a)、CRALBP，36kD(b)的条带。所有这些蛋白质均在两种原代培养物中发现并随后被传代。
用实时RT-PCR在RPE样细胞中找到了另一已知的PRE标志物，RPE65(图4，右侧组图，底部)，PEDF ELISA检测显示了PEDF存在于所有假定RPE培养物的细胞裂解物中，而蛋白质印迹分析显示了一条大约48kD的条带(未显示)。
RPE样培养物中神经元和视网膜祖细胞标志物的检测图4显示了PAX-6、Pax2、mitf和微管蛋白βIII在新传代和旧培养的hES细胞衍生RPE中的定位。在增殖培养物中(胰酶消化3天后，未显示)，增殖细胞丧失了RPE样形态，几乎每个细胞都显示出存在mitf、Pax6、微管蛋白βIII和nestin(未显示)。Pax2只在一小类呈现mitf阴性的细胞中找到，而存在很大程度的Pax6/mitf、mitf/微管蛋白βIII和Pax6/微管蛋白βIII共定位。在旧的培养物静止培养21天，有色上皮岛复原后，PAX-6和mitf大部分发现于有色上皮岛之间的非上皮形态的无色细胞中(图4，A-C)，而微管蛋白βIII则具有相似模式的分布(未显示)。不过，存在mitf阳性和Pax6阴性细胞群，定位接近有色岛的外周(图4，A-C)。Pax2只在很少的mitf阴性细胞中找到(图4，E-H)。在“成熟”的有色上皮岛细胞中曾发现检测不到这些蛋白质中任何一种的存在。不过，在只具有某些RPE特征的细胞内的这些标记物通常是明显的，即，或者看上去象上皮但无色素，或者在某些远离有色上皮岛的单个有色细胞中。
实施例4来自hES细胞系H9的RPE样细胞和来自Cyno-1ES细胞的ACT J-1和来自现存hES细胞系H1和H7的RPE样细胞衍生物的表征扩充培养RPE样细胞系，并为了冻存和复苏进行检测，用以下方法和RPE细胞的分子标记物进行定性用蛋白质印迹法和免疫荧光检测促贝斯特素和CRALBP，用ELISA和蛋白质印迹法检测PEDF，以及用RT-PCR检测REP65。将细胞注入SCID小鼠，以未分化的hES或Cyno-1细胞作为对照评估肿瘤发生率。在商用临床实验室中研究角化类型的RPE样细胞。然后如本申请书中另外描述的进行RPE样细胞功能特性的定性和它们移植潜能的研究，同时使用了本领域技术人员已知的那些技术。
用Affymetrix人类基因组芯片完成了基因表达图谱的检测。比较了来自ES细胞的RPE样细胞和来自尸检的视网膜样品中基因的表达情况。用数种动物模型验证移植RPE样细胞的有效性，包括但不局限于，恒河猴、大鼠和免子。
实施例5保证RPE样细胞的高产量的分化培养体系的优化ES细胞培养于营养细胞层上或作为胚状体(EB)在bFGF、胰岛素、TGF-β、IBMX、bmp-2、bmp-4或它们的组合物存在的条件下培养，包括逐步添加营养成分。或者，将ES细胞培养于多种胞外基质包被的平板上(层粘连蛋白、纤连蛋白、胶原蛋白I、胶原蛋白IV、Matrigel等)，用来评估ECM在RPE形成中的作用。在不同的时间间隔利用实时RT-PCR检测早期RPE祖细胞的分子标志物(Pax6、Pax2、mitf)和RPE细胞的分子标志物(CRALBP、促贝斯特素、PEDF、REP65)的表达，以证实和确定上文所提及试剂的成功组合和在RPE样细胞或其祖细胞中产生富集的逐步过程。此方法还可用于产生RPE和其它眼睛组织共同的祖细胞，诸如光感受器和神经视网膜，它们由于其分化潜能而被分离和进一步定性并用于移植试验中。
实施例6来自现存的和新的ES细胞系的RPE和其它眼睛组织祖细胞的衍生物利用基因表达图谱的数据，将RPE祖细胞标志物的表达与表面蛋白的表达联系起来，以发现针对RPE祖细胞的表面标志物的独特组合。如果发现了这样的标志物，可用抗表面蛋白质的抗体分离纯的RPE祖细胞群，然后进行培养并进一步在培养中分化，或者用于移植试验中使其在移植后再分化。
如果来自基因表达图谱的资料不够充分，为了分离RPE祖细胞，可以使用以下方法。在以Pax6启动子作为对照的条件下用GFP转染ES细胞和RPE样细胞，挑选稳定的转染子。从被转染的分化ES细胞或增殖(去分化)RPE细胞培养物中，通过FACS分离GFP/Pax6阳性细胞并用作抗原注射小鼠以产生针对Pax6阳性细胞表面分子的单克隆抗体。因为Pax6只存在于RPE祖细胞中，用几种策略可完成筛选(通过FACS)a)抗正在增殖的RPE样细胞，b)抗Pax2阳性RPE细胞，c)抗mitf阳性RPE细胞。对于b)和c)而言，将在相应启动子控制下用GPP转染RPE细胞；使用无这些抗原的RPE或ES细胞作为阴性对照。扩充培养经上述所有三种策略选定的阳性克隆后，检测抗体对筛选中所用的所有类型细胞的反应并进行进一步分析因为此方法可产生识别特异和非特异于RPE祖细胞细胞表面抗原的抗体，就可检测来自正在分化的ES细胞群总体的细胞或用这些抗体选定的RPE细胞的RPE祖细胞分子标志物和它们产生RPE的能力。
利用优化的确定的阶梯式步骤产生RPE或其它眼组织早期祖细胞以及它们独特表面标志物的抗体，可从已分化的ES细胞中分离所述祖细胞并进行体外培养。用目标2中所述策略研究它们分化成各种眼睛组织的能力。
已产生RPE样细胞的三个ES细胞系(H9、ACT J-1、Cyno-1)、RPE-样细胞将被用于继续产生如目标1和目标2中所述的RPE样细胞和它们的祖细胞，而HI和H7hES细胞系将被用于产生新的RPE样细胞系。在扩充培养并对RPE的分子标志物进行定性后，将这些细胞系进行单一的克隆，对所产生的系列如目标1所述进行鉴定。符合RPE细胞标准的细胞系将用于移植试验。新的人ES细胞系将来自未用过的IVF胚胎，来自捐赠者的卵母细胞，受刺激后不受精即发育(孤雌)，应用核转移技术从所产生的获自捐赠卵母细胞并正在发育的胚泡中产生新的人ES细胞系。RPE样细胞和常见的眼睛祖细胞将用目标2中的方法获自这些细胞系，依照目标1鉴定所产生的细胞系。[任选的]从无病毒体系中产生新的人ES细胞系、鉴定并提交临床试验。
实施例7在各种动物模型中RPE样细胞和祖细胞对色素性视网膜炎和黄斑变性的治疗潜能在cynomologus猴(短尾猿)中检测灵长类ES细胞。开始，进行玻璃体切除术并将细胞移植入动物的视网膜下空间处。第一步移植悬浮液形式的细胞，然后移植基底或基质形式的细胞，以产生单层移植。这也可利用衍生自人ES细胞的细胞在免疫抑制的患色素性视网膜炎的兔子或多种其它动物模型中完成，包括啮齿动物(rd小鼠、RPE-65敲除小鼠、桶状小鼠、RCS大鼠、猫(阿比西尼亚猫)和狗(视锥病变″cd″狗、进行性视杆-视锥病变″prcd″狗、早期视网膜病变″erd″狗、1、2和3型视杆-视锥发育异常″rcd1、rcd2和rcd3″狗、光感受器发育异常″pd″狗和Briard“RPE-65”狗)。用荧光血管造影术、组织学方法(是否存在光感受器恢复)和可能的ERG进行检查。也可进行功能检查，包括吞噬作用(光感受器片段)、维生素A代谢、紧密连接的传导性和电子显微镜。
实施例8来自人的胚胎来源细胞的RPE细胞的直接分化在使用或不使用免疫外科手术去除滋养外胚层的条件下将人胚泡期胚胎放在小鼠或小鸡的胚胎成纤维细胞上或者直接放在胞外基质蛋白包被的组织培养器皿中。细胞直接分化，而不是培养和传代产生人ES细胞系。
在缺乏LIF、FGF和Plasmanate的条件下当hES细胞在MEF中培养过满时，它们形成了厚的多层细胞。(或者如本领域技术人员所已知的可以用生长因子、培养基和FBS改变直接分化。)约6周后，在较大的细胞丛中出现了黑色的细胞岛。这些黑色细胞可以用裸眼很容易观察到并且在图5B所示的细胞板中看起来象“雀斑”。在较高的放大倍数上，这些细胞岛看上去象典型的上皮细胞鹅卵石单层中紧密堆积的多边形细胞，在胞质中有褐色的色素(图5A)。细胞内的色素量有差异，岛中心部位具有最多的色素，而靠近边缘的最少(图5B)。
尽管通常不会，但当hES细胞直接分化时它们可能形成胚状体(EB)。在前6-8周，有色上皮细胞出现于大约1-2％的这些分化细胞和/或EB中。随时间推移，越来越多的EB发育成有色细胞，到3个月的时候几乎每个EB都有有色上皮区。EB有色区内的细胞形态非常类似于黏附培养的细胞。
材料和方法MEF培养基高葡萄糖DMEM，补充了2mM GlutaMAXI和500u/ml青霉素、500ug/ml链霉素(均来自Invitrogen)和16％FCS(HyCLone)。HES细胞生长培养基基因敲除用高糖DMEM，补充了500u/ml青霉素、500ug/ml链霉素、1％非基本氨基酸溶液、2mM GlutaMAXI、0.1mMβ-巯基乙醇、4ng/ml bFGF(Invitrogen)、1-ng/ml的人LIF(Chemicon，Temecula，CA)、8.4％的置换血清(SR，Invitrogen)和8.4％Plasmanate(Bayer)。衍生培养基包含与生长培养基同样的组分，不同之处在于与生长培养基相比，它具有较低浓度的SR和Plasmanate(各4.2％)以及8.4％FCS和2倍浓度的人LIF和bFGF。EB培养基除了bFGF、LIF和Plasmanate之外与生长培养基相同；SR浓度是13％。RPE培养基50％EB培养基和50％MEF培养基。
HES细胞系用于这些试验的细胞系hES 35、36、45是改进先前所报道方法的方法产生的(Thomson等，1998，Reubinoff等，2000，Lanzendorf等，2001)。经两个制度审查委员会的批准，人冻存的胚泡(系列hES35)或裂开的胚胎(系列hES36和hES45)由已完成生育力治疗的夫妇捐赠用于研究。
用黏附的hES细胞或胚状体(EBs)进行分化实验。对于黏附分化而言，hES细胞可以在MEF中长满，直至hES细胞失去它们的紧密边缘，此时用EB培养基置换原培养基(通常是在传代8-10天后)。
每1-2天换一次培养基。为了EB形成，将hES细胞用胰酶消化并在低黏附平板(Costar)上培养于EB培养基中。
免疫染色将细胞固定于2％多聚甲醛，用0.1％ NP-40使其可渗透以便胞内抗原的定位，用PBS(Invitrogen)配制的10％山羊血清、10％的驴血清(Jackson Immunoresearch Laboratories，West Grove，PA)封闭至少1小时。在4℃与一抗保温过夜，加入二抗(JacksonImmunoresearch Laboratories，West Grove，PA)一小时。在所有保温操作之间用PBS配制的0.1％ Tween-20(Sigma)洗涤样品3-5次，每次10-15分钟。用带DAPI的Vectashield(Vector Laboratories，Burlingame，CA)为样品着色并在荧光显微镜下(Nikon)观察。碱性磷酸酶的定位或是用Vector Red(Vector Laboratories，Burlingame，CA)定位于活细胞或是依照制造商的说明在免疫染色期间的第二次洗涤后进行定位。所用的抗体促贝斯特素(Novus Biologicals，Littleton，CO)、抗CRALBP抗体由Dr.Saari，University ofWashington惠赠。二抗来自Jackson Immunoresearch Laboratories，而链霉亲和素-FITC购自Amersham。
RPE样细胞的分离和传代用PBS漂洗黏附培养的hES细胞或EB两次并在0.25％胰酶/1mMEDTA(Invitrogen)中37℃保温直至细胞单层松散。用玻璃毛细管将有色区的细胞刮下，转移到MEF培养基中，200Xg离心，并放到明胶包裹平板内的RPE培养基中。细胞附着后更换培养基(通常在1-2天内)，之后每5-7天换一次；每2-4周用0.05％胰酶/0.53mM EDTA(Invitrogen)将细胞传代。
蛋白质印迹分析和ELISA用Laemmli缓冲液(Laemmli，1970)制备样品，缓冲液中补充有5％的巯基乙醇和混合蛋白酶抑制剂(Roche)，煮沸5分钟并用Mini-Protean装置加到8-16％梯度凝胶(Bio-Rad，Hercules，CA)上；每块胶在25-30mA进行电泳；以20伏电压过夜将蛋白质转移到0.2的硝酸纤维素膜(Schleicher and Shull，Keene，NH)上。用Ponceau Red(Sigma)对印迹膜进行暂时染色使条带可见，用Milli-Q水进行洗涤，并用溶于0.1％ TBST(Bio-Rad)的5％脱脂奶粉封闭1小时。加入抗促贝斯特素、CRALBP或PEDF(Chemicon)的一抗2小时，然后用TBST洗3次，每次15分钟；加入过氧化物酶缀合的二抗1小时，并重复上述洗涤。用Super-Signal试剂(Pierce)通过ECL体系检测印迹。依照制造商的说明用PEDF ELISA试剂盒(Chemicon)对细胞裂解物进行PEDF ELISA分析。
实时RT-PCR通过两步法从分化的ES培养物中提纯总RNA。用Trizol试剂(Invitrogon)分离天然RNA并进一步用Rnrazy小柱(Qiagen)进行纯化。用商品化的用于RPE 65检测的引物对(Assay on Demand &num；Hs00165642ml，Applied Biosystems)和Quantitect Probe RT-PCR试剂(Qiagen)，依照制造商的(Qiagen)说明通过实时PCR监测RPE65转录物的水平。
未分化hES细胞系的衍生和表征这些试验中用了两个雌性、一个雄性hES细胞系。有关这些hES细胞系衍生的细节在别处也有报导。所有细胞系已传代超过50次，在此期间它们保持未分化的集落形态、高碱性磷酸酶活性且表达Oct-4、SSEA-3、SSEA-4、TRA I-60和TRA I-81(数据未显示)。其中两个细胞系具有标准的核型(hES36，hES35)，而在hES45中即有标准的也有非整倍体的亚群。由于在体外以及在畸胎瘤中的自发分化，所有细胞系均表达三胚芽层的标志-肌肉肌动蛋白、α-胎蛋白和微管蛋白βIII。
实施例9利用转录基因组鉴定离体分化的正常分化细胞Transcriptomics-hES-细胞衍生物可能在未来的再生医学中扮演着重要的角色。这些衍生物和其它干细胞衍生物的定性检测仍然是一个挑战，可以用功能性基因组的方式进行处理。我们比较了hES-RPE相对于体内同等物-胎儿RPE细胞的转录图谱，研究者已对它的移植价值进行了广泛的研究。然后将两个图谱都与先前所报导的(Rogojina等，2003)有关人RPE细胞系转录物组的资料进行比较。
将我们数据组中的基因表达图谱与两种人RPE细胞系(未转化的ARPE-19和已转化的D407，Rogojina等，2003)进行比较以确定hES-RPE是否具有相似的普遍转录特征。为了说明表达于所有细胞中的共同的持家基因，我们使用了来自未分化hES细胞(H1系列，h1-hES，--sato等，2003)和支气管上皮细胞(BE，Wright等，2004)、公认可利用的Affymetrix数据组作为对照，因为它们具有共同的上皮来源，从而可以排除共同的持家基因和上皮基因并确定RPE特异性基因。
在hES-RPE、hES-RPE-TD、ARPE-19、D407之间存在相似性和差异性。通过分析存在于hES-RPE/ARPE-19但不存在于BE(1026个基因)中的那些基因之间唯一的交叉点进一步证实了它们的相似性。为了说明背景，我们将这与存在于BE/hES-RPE但不存在于ARPE-19(186个基因)中的唯一交叉点进行了比较，这样产生的hES-RPE和ARPE-19中的相似性比用BE进行比较所产生的要高5倍到6倍。D407/ARPE19看上去丢失了RPE特异性基因，诸如RPE65、促贝斯特素、CRALBP、PEDF，它是典型的长期传代细胞(图6)。进一步的资料库显示已知的RPE特异存在处，诸如黑色素生物合成、视觉、维生素A结合等，只存在于胎儿RPE和ES-RPE中，但不存在于ARPE19中。
将hES-RPE、ARPE-19和D407与它们的体内同等物-新鲜分离的人胎儿RPE(feRPE)进行比较，结果与我们早先的资料一致，证明了hES-RPE与人feRPE之间的转录同一性显著高于D407与fe RPE之间(2.3倍差异-849个基因/373个基因)和ARPE-19与feRPE之间(1.6倍差异-588个基因/364个基因)的同一性(图5c/5d)。以上鉴定的只存在于hES-RPE中而不存在于ARPE-19或D407中的RPE特异性标志也存在于feRPE中，表明hES-RPE与其体内同等物之间的相似程度比培养的RPE细胞系之间的相似程度要高。
hES-RPE中的784个基因在feRPE和ARPE-19数据组中没有。由于保持“滋生”基因可能在移植入患者体内时潜在的引起hES衍生物转化成恶性的畸胎瘤，所以我们利用目前可利用的Affymetrix点阵数据组(Abeyta等2004 Sato 2003)建立了保守的潜在“滋生”基因数据。这产生了出现于所有12个数据组中的3806个基因的列表(包括共同的持家基因)。存在于hES-RPE数据组但不存在于feRPE-ARPE-19中的784个基因中只有36个是与3806个潜在滋生基因是相同的。这些基因中没有一个是诸如Oct4、Sox2、TDGF1等已知的滋生性基因。
实施例10利用RPE细胞治疗帕金森症因为hRPE分泌L-DOPA，所以它们可作为备选细胞来源用于帕金森症细胞疗法中。研究显示所述的附着于明胶包被微载体上的细胞可成功的被移植入一侧患帕金森症的猴子中并产生并显著改善症状(每个靶目标移植1万至5万个细胞)，而在FDA核准的试验中，开始在接受hRPE条纹内移植的2000名患者中均未观察到有不利的效果。使用hES细胞来源RPE的许多优势之一是它避开了捐赠的眼组织不足的问题。同时还促进了基因疗法的应用。
其它实施方案从前文的叙述中，显而易见可对本文所述的本发明进行变更和修饰以使其适应不同的用途和条件。
权利要求
1.用于治疗或预防视网膜变性的方法，包括使用选自下组细胞中的至少一种RPE细胞、RPE样细胞、由哺乳动物胚胎干细胞衍生的RPE或RPE样祖细胞。
2.权利要求1的方法，其中视网膜变性状况选自下组中的至少一种色素性视网膜炎和黄斑变性。
3.权利要求1的方法，还包括通过玻璃体切割术将细胞移植到眼球的视网膜下空间中。
4.权利要求3的方法，其中细胞在悬浮液、基质、或基底中进行移植。
5.权利要求2的方法，其中色素性视网膜炎与动物模型有关。
6.权利要求5的方法，其中动物模型选自下组rd小鼠、RPE-65敲除小鼠、矮胖样小鼠、RCS大鼠、阿比西尼亚猫、视锥变性“cd”犬、进行性视杆-视锥变性“prcd”犬、早期视网膜变性“erd”犬、视杆-视锥发育异常1、2和3“rcd1、rcd2和rcd3”犬、光受体发育异常“pd”犬、和Briard“RPE-65”犬。
7.权利要求6的方法，其中使用行为测试、荧光血管造影术、组织学、和功能测试诸如测量细胞进行吞噬(光受体片段)的能力、维生素A代谢、紧密接头传导性、或使用电子显微镜的评估其中一项或多项来评估动物模型的治疗效果。
8.用于使hES细胞自发分化成RPE细胞、RPE样细胞、或RPE祖细胞的方法，所述方法包括a)使hES细胞培养物在MEF上过度生长；b)使hES细胞培养物形成厚厚的多层细胞；c)培养hES细胞；d)由得到的细胞培养物分离并培养有色RPE细胞、REP样细胞、和/或RPE祖细胞。
9.权利要求8的方法，其中分离并培养RPE样细胞包括a)用酶消化培养的hES细胞或EB′s；b)选择性分离有色细胞；c)将分离的细胞平板接种在明胶或层粘连蛋白上培养1-2天以形成原代培养物(P0)；d)将原代培养物继续培养至多达3周的一段时间；和e)分离RPE样细胞。
10.权利要求9的方法，其中酶选自下组中的一种或多种胰蛋白酶、胶原酶、和分散酶。
11.权利要求8的方法，其中培养RPE细胞以建立新的RPE细胞系。
12.权利要求11的方法，其中RPE细胞系分化成交替谱系，包括在培养中用bFGF或FGF处理RPE细胞系。
13.权利要求11的方法，其中在RPE样细胞衍生自不同ES细胞系时，新的RPE细胞系因至少一种选自下组的特征与早已建立的RPE细胞系不同生长速率、色素表达、在培养中去分化、和在培养中再分化。
14.用于使RPE系或RPE细胞前体衍生成具有增加的预防新血管生成能力的RPE细胞的方法，所述方法包括a)使来自动物的体细胞老化，使得端粒酶缩短，其中细胞已经度过了至少10％的正常复制寿命；和b)使用体细胞作为核移植供体细胞以生成过度表达血管发生抑制物的细胞，其中血管发生抑制物可以是色素上皮衍生因子(PEDF/EPC-1)。
15.权利要求14的方法，其中用抑制新血管生成的外源基因遗传修饰体细胞。
16.权利要求8的方法，其中RPE样细胞衍生自HLA区纯合性ES或胚胎衍生细胞库使得ES衍生细胞具有降低的HLA抗原复杂性。
17.权利要求8的方法，其中ES细胞衍生自人。
18.用于治疗帕金森氏病的方法，包括移植RPE样细胞或祖细胞。
全文摘要
本发明涉及用于视网膜变性的改良的基于细胞的疗法和用于使人胚胎干细胞和人胚胎衍生细胞分化成视网膜色素上皮(RPE)细胞和其它视网膜祖细胞的方法。
文档编号A61K35/12GK1968608SQ200580007359
公开日2007年5月23日 申请日期2005年1月24日 优先权日2004年1月23日
发明者I·V·克利曼斯卡亚 申请人:先进细胞技术公司