专利名称：恒河猴视网膜变性模型及其药物筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种恒河猴视网膜变性动物模型，具体地，是碘酸钠施用于恒河猴制备而成的动物模型。
背景技术：
视网膜变性是当前致盲的主要眼病之一，稳定的动物模型的建立是解决相关科研及临床问题的关键。当前视网膜变性的模型主要针对啮齿类动物、家兔等，如王凯，等，碘酸钠诱导兔视网膜和视神经跨神经元变性的研究，《眼科研究》，2008年沈卷7期，通过试验观察碘酸钠静脉注射能否诱导实验动物的视网膜和视神经出现跨神经元变性。具体方法是48只青紫兰兔，8只为对照组.剩余40只进行碘酸钠静脉注射G0mg/kg)，观察注射后1 周、2周，1、4、18个月实验动物视网膜和视神经的病理改变，并与对照组进行对比。采用DNA 末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)标记凋亡细胞；变色酸2R染视神经髓鞘； Guillery Shirra-Webster法染变性的神经纤维；结果视网膜内核层的神经元在碘酸钠注射后1周开始凋亡；视网膜神经节细胞(RGCs)在注射后1个月开始凋亡；在注射后的4个月和18个月，可见视神经不同程度的脱髓鞘和变性；结论碘酸钠静脉注射可诱导实验动物视网膜跨神经元变性。旌撒，表皮生长因子治疗碘酸钠诱导视网膜色素上皮变性扫描电镜观察，《眼科研究》,1996年14卷4期，报道了给家兔静脉注入磺酸钠，分别间隔48小时和 72小时再注射一次，第7天出现部分眼部，扫描电镜观察RPE细胞外形及数量，余右眼球玻璃体内注入hEGF提取液，左眼注等量生理盐水。非人灵长目动物在种属上与人类十分接近，目前尚无灵长类视网膜变性的模型的报道。
发明内容
本发明提供了一种恒河猴视网膜变性模型的制备方法，本发明还提供了一种筛选治疗视网膜变性的药物的方法。本发明提供了一种恒河猴视网膜变性模型的制备方法，将剂量为15_75mg/kg的碘酸钠施用于恒河猴。进一步优选地，所述的碘酸钠的剂量为50mg/kg。本发明还提供了所述的方法制备的动物模型在筛选治疗视网膜变性的药物中的用途。本发明还提供了一种筛选治疗视网膜变性的药物的方法，它包括如下步骤a、用碘酸钠施用于恒河猴，建立恒河猴视网膜变性模型；b、将候选药物施用于变性模型；C、观察候选药物对视网膜变性、损伤程度的量化指标的影响情况，并进行评分，评价潜在在治疗视网膜变性的药物。其中，步骤a中所述的碘酸钠的施用剂量为15-75mg/kg。其中，步骤a中所述的碘酸钠的施用剂量为50mg/kg。
本发明首次尝试将碘酸钠静脉推注入恒河猴体内构建灵长类视网膜变性模型，筛选合适的造模剂量，并建立系统的模型评估体系。
图1造模后闪光ERG的波幅变化图2造模后闪光ERGa波波幅的变化曲线图3造模后闪光ERGb波波幅的变化曲线图4 50mg/kg组造模后眼底照相的变化造模后7天眼底未见明显改变，自14天起，视网膜后极及周边均出现点状、块状色素沉积二8天更为明显。图5 50mg/kg组造模后眼底荧光血管造影变化造模后视网膜各部出现大量代表视网膜色素上皮损伤的透见荧光，少量渗出。图6造模后HE染色结果A为正常猴眼视网膜，色素上皮平滑，细胞核间距离相近， 各层细胞等大，排列整齐，B为30mg/kg组3周后视网膜，色素上皮缺失，光感受器层出现空泡样变性，但是内部各层细胞未出现明显改变。C为50mg/kg组6周后视网膜，色素上皮细胞核不等大，核间距离差异大，光感受器层变性，内外核层细胞核不等大，排列见紊乱。
具体实施例方式试验例1本发明动物模型的制备1、试验目的建立碘酸钠致恒河猴视网膜变性的模型，建立系统的模型评估体系。2、试验材料2. 1主要试剂麻醉剂3%戊巴比妥30mg/kg、盐酸氯胺酮50mg/ml硫酸阿托品10mg/2ml消毒剂聚维酮碘伏5. Og/L造模剂碘酸钠50mg/ml眼底造影剂20%荧光素钠、吲哚青绿2. 2主要仪器、器械SL-2F 裂隙灯直接检眼镜JFY2EP-1000 眼电生理仪Heidelberg眼底荧光造影仪Heidelberg 眼底照相机2. 3实验动物2. 3. 1动物饲养管理恒河猴饲养于国家成都中药安全性评价中心普通动物房，实验前动物适应环境并进行驱虫治疗，选择健康(雌性须未孕)动物作为受试动物，不锈钢猴笼分笼饲养，饲养条件符合国标GB14925-2001，室温18 士 ，相对湿度40 士 70 %。猴精饲料喂养，自来水装瓶自由饮用，每日喂饲水果。
动物挂颈牌和笼上贴标签作为动物识别标记。2. 3. 2实验动物筛选普通级成年健康恒河猴10只，雌雄各半，拟由四川成都平安动物繁育研究基地 (生产许可证号SCXK(川)2004-013)引进。入室前一周进行结核菌素、寄生虫、沙门氏菌、 致贺氏菌检查。纳入标准4-5岁，体重44kg，无B疱疹病毒、猴逆转录病毒、猴白血病病毒和免疫缺陷病毒感染的健康恒河猴。动物入室后需经血常规、出凝血试验、血清生化检查的初次筛选，排除重大器官病变。之后进行裂熄灯、眼底检查、闪光ERG检查、荧光血管造影检查的二次筛选排除眼科疾患。两次筛选结果正常的动物可纳入本实验研究。3、试验方法采用肘静脉推注的方法，分别对恒河猴进行15mg/kg、30mg/kg、50mg/kg、75mg/kg 4个剂量的试验，通过闪光ERG、荧光血管造影检测造模后视网膜的功能损伤；通过裂熄灯检查、眼底照相检测大体形态的损伤；通过硬组织固定HE染色、电镜检查检测超微组织学损伤；通过血液血血常规、血生化、出凝血实验及重大脏器的HE染色检测对全身脏器功能和形态的损伤。根据综合评价结果选择合适的给药剂量。4、试验结果4. 1闪光ERG 见图1、图2、图3分析造模后不同剂量组ERG的波幅都出现明显变化。75mg/kg组出现全身的严重反应，ERG波幅消失，15mg/kg、30mg/kg组造模后出现一过性降低，于3周恢复到造模前水平。50mg/kg剂量组2周达最低，3周稍有恢复，直到造模后6周平稳维持在较低水平。4. 2眼底照相(见图4)4. 3眼底荧光血管造影(见图5)4. 4视网膜HE染色(见图6)
4. 5重大器官病理学检测碘酸钠(50mg/kg、75mg/kg)静脉给予恒河猴6月后，观察其毒性病理学反应。显微镜下观察75mg/kg组1只动物(05648)肾小管上皮细胞再生，空肠肠腺固有膜纤维化。病变仅发生在高剂量组，不能排除为药物所致的相关病变。显微镜下观察75mg/kg组1只动物(05648)，50mg/kg组1只动物(0622 十二指肠隐窝基底部腺上皮细胞空泡变性。病变在高、低剂量组均有发生，可能为药物所致。显微镜下观察50mg/kg组1只动物(0622 结肠肠腺囊性扩张，内含坏死物，1只动物(06111)萎缩性胃炎。病变发生在低剂量组，不能排除为药物所致的相关病变。自发或散发性病变显微镜下观察75mg/kg组1只动物(05648)，50mg/kg组1只动物(06111)肝脏小肉芽肿。因病变程度轻，且动物该病的发生率较高，多系动物的自发性病变。综上所诉，碘酸钠(50mg/kg、75mg/kg)静脉给予恒河猴6月后，根据病理检查结果，两个剂量均出现消化道病变多系药物相关，50mg/kg较轻微，75mg/kg出现肾脏的改变不能排除与药物相关。5、讨论由闪光ERG看，75mg/kg组波幅消失，不能量化统计。15mg/kg、30mg/kg组造模后出现一过性降低，于3周恢复到造模前水平，证明功能损伤并不严重，HE染色的结果显示， 仅出现色素上皮缺失，光感受器层出现空泡样变性，内部各层细胞未出现明显改变，我们推测，该剂量对视网膜有早期的急性损伤，但未超出恒河猴的代偿能力，损伤可以恢复。50mg/ kg剂量组ERG波幅2周达最低，3周稍有恢复，直到造模后6周平稳维持在较低水平，有较长时间的平稳期，便于量化统计。且HE除视网膜色素上皮及光感受器层损伤外，内外核层细胞核不等大，排列紊乱，从组织学上验证了碘酸钠对视网膜各层的损伤。眼底照相视网膜各部出现色素沉积，FFA显示荧光遮蔽及色素上皮损伤的特征性窗口样缺损，从临床角度验证了模型建立的成功。6、总结50mg/kg碘酸钠静脉推注可以导致恒河猴视网膜变性，损伤程度适中，对身体其他器官损伤小，是适合的造模剂量；闪光ERG可以作为视网膜损伤程度的量化指标对此模型进行评估。试验例2本发明筛选治疗视网膜变性的药物的方法具体步骤a、按实施例1的方法采用碘酸钠施用于恒河猴，建立恒河猴视网膜变性模型；b、将候选药物施用于变性模型；C、观察候选药物对视网膜变性、损伤程度的量化指标的影响情况，并进行评分，评价潜在治疗视网膜变性的药物。
权利要求
1.一种恒河猴视网膜变性模型的制备方法，其特征在于将剂量为15-75mg/kg的碘酸钠施用于恒河猴。
2.根据权利要求1所述的恒河猴视网膜变性模型的制备方法，其特征在于所述的碘酸钠的剂量为50mg/kg。
3.权利要求1或2所述的方法制备的动物模型在筛选治疗视网膜变性的药物中的用途。
4.一种筛选治疗视网膜变性的药物的方法，它包括如下步骤a、用碘酸钠施用于恒河猴，建立恒河猴视网膜变性模型；b、将候选药物施用于变性模型；C、观察候选药物对视网膜变性、损伤程度的量化指标的影响情况，并进行评分，评价潜在治疗视网膜变性的药物。
5.根据权利要求4所述的筛选药物的方法，其特征在于步骤a中所述的碘酸钠的施用剂量为15-75mg/kg。
6.根据权利要求5所述的筛选药物的方法，其特征在于步骤a中所述的碘酸钠的施用剂量为50mg/kg。
全文摘要
本发明提供了一种恒河猴视网膜变性模型的制备方法，它是将剂量为15-75mg/kg的碘酸钠施用于恒河猴。本发明还提供了一种筛选治疗视网膜变性的药物的方法。本发明首次尝试将碘酸钠静脉推注入恒河猴体内构建灵长类视网膜变性模型，筛选合适的造模剂量，并建立系统的模型评估体系。
文档编号A01K67/027GK102198278SQ201010131148
公开日2011年9月28日 申请日期2010年3月24日 优先权日2010年3月24日
发明者余文瀚, 刘旭阳, 刘果, 向浩天, 曹桂群, 李宏霞, 杨吟, 王丽君, 王云, 王莉, 闫乃红, 陈伟伟 申请人:四川大学华西医院, 国家成都中药安全性评价中心, 成都华西海圻医药科技有限公司