一种制作灵长类动物视网膜色素变性疾病模型的方法
【专利摘要】本发明公开了一种在灵长类动物上制作视网膜色素变性疾病模型方法，将一定剂量碘酸钠以颈动脉注射的方式施于灵长类动物。本发明的操作方法简单易行，造模成功率高，可重复性好，模型稳定；所需碘酸钠药物量少，避免了大剂量碘酸钠对动物的全身损伤，动物长期存活，为后续试验提供可能；可根据需要做任何一侧或双侧模型；做一侧造模时对对侧眼没任何损伤，保证了动物的正常生活视力；可在一只动物上做双侧眼的自身对照，提供了试验的可信度，减少了试验动物的需要量；本发明为视网膜色素病变研究提供了一个良好的工具，对这一疾病的病理生理学研究及治疗研究都具有重要意义。
【专利说明】一种制作灵长类动物视网膜色素变性疾病模型的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及医疗【技术领域】，具体的说是一种制作灵长类动物视网膜色素变性疾病模型的方法。
【背景技术】 [0002]视网膜色素上皮对维持正常视网膜的功能至关重要，视网膜色素变性(RetinitisPigmentosa，RP)，属于视锥、视杆细胞营养不良，是一组遗传性病，以夜盲、视野缩小、眼底骨细胞样色素沉着和光感受器功能不良为特征。可能的发病机理由于视网膜色素上皮细胞对视细胞外节膜盘的吞噬、消化功能衰退，致使膜盘崩解物残留、规程形成一层障碍物，妨碍营养物质从脉络膜到视网膜的转动，从而引起视细胞的进行性营养不良及逐渐变性和凋亡。当今仍然无明确有效的治疗手段，其发病机理和治疗方法成为研究热点，但因为没有理想的动物疾病模型，极大的阻碍了其研究进展。
[0003]碘酸钠是一种抗代谢药，能够破坏视网膜色素上皮糖代谢有关的酶的活性，因而可以选择性破坏视网膜色素上皮。通过静脉注射碘酸钠，在兔和鼠可以制作出视网膜色素变性疾病模型。灵长类动物与人类结构和功能最为相似，灵长类的疾病模型对人类疾病的研究极为重要，但在灵长类动物中，相应剂量的碘酸钠静脉注射并不能取得满意的视网膜色素变性模型，增加剂量则增加药物的全身毒性，动物甚至因药物全身毒性而死亡。申请号为201010131148.0，名称为“恒河猴视网膜变性模型及其药物筛选方法”的中国专利公开了一种采用静脉注射碘酸钠制备恒河猴视网膜变性模型的方法，然而采用静脉注射碘酸钠造模，药物先经静脉回流到心脏，后再经心脏泵出通过主动脉，颈动脉，眼动脉进入视网膜脉络膜循环，药物经过全身循环使到达眼部的药物浓度已经大幅度降低，而药物对色素上皮的作用是浓度依赖性的，为了达到破坏色素上皮的目的，要加大给药物量，但这样会相应增加药物的全身毒性。我们的预实验显示静脉注射碘酸钠造模，药物致死剂量和造模剂量接近，全身给药的剂量需在60mg左右，个体差异很大，70mg的药物就出现动物死亡，即使是60mg动物在半个月开始ERG功能自发恢复，且全身副作用，血尿，急性肾损伤等常见，其成模率低，死亡率高，增加了实验难度，浪费了实验动物，损伤了动物权益，不能满意用于实验。
【发明内容】
[0004]本发明针对现有技术不足，提供了一种满意的灵长类动物视网膜色素变性的疾病模型，通过经颈动脉给药，药物经颈动脉到眼动脉，进入视网膜脉络膜循环，药物没有经过全身循环的稀释，到达眼部的药物浓度高，从而使用少量的药物而达到相应目的，还可进一步通过控制颈动脉的阻断时间，控制药物在眼部停留的时间，延长药物对色素上皮的作用，可调控视网膜色素上皮损伤的范围和程度。
[0005]本发明具体技术方案如下:
一种制作灵长类动物视网膜色素变性疾病模型的方法，将碘酸钠以颈动脉注射的方式施于灵长类动物，上述碘酸钠的剂量为15-20mg/kg,优选20mg/kg。
[0006] 申请人:发现，在本发明所述灵长类动物视网膜色素变性疾病模型的制作过程中，模型效果以及病变的程度不仅与碘酸钠的剂量有直接关系，还与碘酸钠药物浓度以及推注速度有关，优选碘酸钠的浓度为10mg/ml，推注速度为0.2ml/s。
[0007]上述方法中，颈动脉注射可采用颈动脉穿刺的方式给药。在进行注射时，一般采用平卧位，将动物颈部垫高，头向后仰，尽量暴露颈部，头偏向于穿刺部位的对侧，进行常规的皮肤消毒后，用左手食指或食指、中指固定其搏动明显处的血管，右手食指和拇指固定准针柄部位，进针点为甲状软骨下缘以下，进针时要注意进针方向，其垂直角度以与颈动脉垂直方向为准，刺入后，有搏动性鲜血喷入针管内，即可注入药物，推注速度为0.2ml/s。药物注射完毕压迫止血，可通过进一步按压阻断颈总动脉一定时间，从而进一步延长碘酸钠在眼部聚集的时间，优选阻断时间为1分钟。
[0008]或者，可以采用暴露颈动脉的方式进行注射:1)将动物麻醉，固定，暴露颈部，去毛，消毒；2)喉部正中 线皮肤切口，暴露颈总动脉；3)阻断颈外动脉和颈总动脉血流；4)将碘酸钠经颈总动脉注入，推注速度为0.2ml/s，继续保持颈总动脉血流阻断一定时间，优选1分钟。5)拔针后压迫止血，缝合切口。
[0009]本发明相比现有技术有如下优点:
1)造模成功率高，可重复性好，模型稳定；
2)所需碘酸钠药物量少，避免了大剂量碘酸钠对动物的全身损伤，动物长期存活，为后续试验提供可能；
3)可根据需要做任何一侧或双侧模型；
4)做一侧造模时对对侧眼没任何损伤，动物有正常生活视力，保证了动物福利；
5)可在一只动物上做双侧眼的自身对照，提供了试验的可信度，减少了试验动物的需要量。
[0010]本发明为视网膜色素病变提供了一个良好的工具，对这一疾病的病理生理学研究及治疗研究都具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1为食蟹猴双眼暗适应0.01视网膜电图(右眼为本发明20mg/kg碘酸钠造模后四周)。
[0012]图2为食蟹猴双眼暗适应3.0+震荡电位视网膜电图(右眼为本发明20mg/kg碘酸钠造模后四周)。
[0013]图3为食蟹猴双眼明适应3.0视网膜电图(右眼为本发明20mg/kg碘酸钠造模后四周)。
[0014]图4为食蟹猴双眼明适应3.0闪烁光反应视网膜电图(右眼为本发明20mg/kg碘酸钠造模后四周)。
[0015]图5为各剂量组食蟹猴造模前后双眼暗适应3.0视网膜电图(视杆细胞视锥细胞最大混合反应)a波振幅变化曲线图。
[0016]图6为各剂量组食蟹猴造模前后双眼暗适应3.0视网膜电图(视杆细胞视锥细胞最大混合反应)b波振幅变化曲线图。[0017]图7为20mg/kg组食蟹猴造模后四周双眼眼底照片。
[0018]图8为20mg/kg组食蟹猴造模后四周眼底荧光造影。
[0019]图9为食蟹猴右眼造模前及造模后1，2，3，5，10周时0CT结果。
【具体实施方式】
[0020]以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。
[0021]在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
[0022]下面结合具体实施 例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
[0023]在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法实施例1颈动脉注射碘酸钠建立食蟹猴视网膜色素变性模型。
[0024]目的:通过颈动脉注射碘酸钠建立食蟹猴视网膜色素变性模型，筛选出造模的合适剂量。
[0025]实验材料:
主要试剂:
麻醉药品:50mg/ml盐酸氯胺酮,3%戍巴比妥钠消毒药品:5.0g/L聚维酮碘
造模药品:碘酸钠(Sigma公司，批号:S4007)，在暗室环境下，用0.9%灭菌生理盐水将碘酸钠粉末融至10mg/ml的浓度，并用0.22 μ m滤片过滤。
[0026]眼底荧光造影剂:荧光素钠注射液(立摄得)500毫克/5毫升/支主要仪器:
YZ5F裂隙灯显微镜(杭州六六)
Espion视觉电生理仪(美国Diagnosys公司)
SPECTRALIS 0CT仪(德国海德堡公司)
海德堡荧光造影机，眼底照相机实验动物:
动物饲养与管理按照S0P执行，同时遵循实验动物饲养和使用指南第8版(Instituteof Laboratory Animal Resources, Commission on Life Sciences, National ResearchCouncil; National Academy Press, Washington, D.C., 2010)和美国农业部(USDA)动物福利管理条例(Public Law99-198)0实验动物的使用获得了江苏省科技厅的批准，实验动物使用许可证号:SYXK (苏)2011-0029。
[0027]食蟹猴为动物实验用常规动物，生理特点与人相似，饲养方便，便于试验操作。
[0028]从储备动物中挑选一般体检、血生化及眼科系统性检查正常的食蟹猴8只，给药开始时2-5岁，体重2-5kg。动物项圈上标记动物ID号，同时标记实验动物号作为动物的标识。记录ID号与动物号的对应关系。
[0029]碘酸钠注射造模后一周内采取单笼饲养，其余时间采取群养笼饲养方式。动物房设定温度为18~26°C，湿度为40~70%，光照12小时明暗交替。
[0030]实验方法:8只食蟹猴，随机分为10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg四组，每组各两只，分别对各组食蟹猴右侧颈总动脉注射进行相应剂量的碘酸钠给药，右眼为造模组，自体左眼为未造模对照组。造模后每周进行眼视网膜电图(Electroretinogram,ERG)检查、眼底照相、突光血管造影、OCT检查。上述方法中，颈动脉注射采用动脉穿刺的方式给药:
在进行注射时，采用平卧位，将动物颈部垫高，头向后仰，尽量暴露颈部，头偏向于穿刺部位的对侧，进行常规的皮肤消毒后，用左手食指或食指、中指固定其搏动明显处的血管，右手食指和拇指固定准针柄部位，进针点为甲状软骨下缘以下，进针时要注意进针方向，其垂直角度以与颈动脉垂直方向为准，刺入后，有搏动性鲜血喷入针管内，即可注入药物推注速度为0.2ml/s。药物 注射完毕压迫止血，按压阻断颈总动脉1分钟，从而进一步延长碘酸钠在眼部聚集的时间。
[0031]或者也可选用暴露颈动脉的方式进行注射:1)将动物用氯胺酮(0.2ml/kg)肌注，并戊巴比妥钠(20mg/kg)后肢静脉注射麻醉，仰面固定在手术台上，暴露颈部，去毛，局部用碘伏溶液消毒；2)喉部正中线皮肤切口，暴露颈总动脉；3)阻断颈外动脉和颈总动脉血流；
4)将碘酸钠经颈总动脉分叉处注入推注速度为0.2ml/s，继续保持颈总动脉血流阻断1分钟；5)拔针后压迫止血，缝合切口。
[0032]上述两种方法均可制得食蟹猴视网膜色素变性模型，无明显差异。
[0033]实验结果:
1.眼视网膜电图(Electroretinogram, ERG)检查结果
ERG检查结果如图1-6所示，其中，图1为食蟹猴双眼暗适应0.01ERG(右眼为本发明20mg/kg碘酸钠造模后四周)；图2为食蟹猴双眼暗适应3.0+震荡电位ERG (右眼为本发明20mg/kg碘酸钠造模后四周，图a和图b为暗适应3.0ERG,图c和图d为暗适应3.0震荡电位图，其中图a和图c为右眼，图b和图d为左眼)，图3为食蟹猴双眼明适应3.0ERG (右眼为本发明20mg/kg碘酸钠造模后四周)；图4为食蟹猴双眼明适应3.0闪烁光反应ERG(右眼为本发明20mg/kg碘酸钠造模后四周)；图5为各剂量组食蟹猴造模前后双眼暗适应
3.0ERG (视杆细胞视锥细胞最大混合反应)a波振幅变化曲线图；图6为各剂量组食蟹猴造模前后双眼暗适应3.0ERG (视杆细胞视锥细胞最大混合反应)b波振幅变化曲线图。结果显示各剂量组，暗适应0.01，暗适应3.0，震荡电位，明适应3.0ERG,明适应3.0闪烁光反应ERG振幅都有所下降，在造模后6周内都缓慢回升，10mg/kg组和15mg/k组基本恢复近造模前水平。25mg/kg组ERG明显下降，不能量化检查。20mg/kg组术后一周ERG明显下降，后六周缓慢上升后维持在较低水平。
[0034]2.眼底照相检查结果
20mg/kg组食蟹猴造模后四周双眼眼底照相检查结果如图7所示，左图为右眼20mg/kg碘酸钠造模组，右图为自体左眼未造模对照组。结果显示造模组眼底后极部色素上皮斑驳状萎缩。
[0035]3.眼底荧光造影
20mg/kg组食蟹猴造模后四周眼底荧光造影检查结果如图8所示(20mg/kg组，右眼为造模眼)，图中a-h为右眼，图1为左眼。从肘静脉注造影剂开始计时，进行连续拍摄，图a-h的图像分别对应的拍摄时间点为12秒，14秒，16秒，26秒，1分16秒，1分18秒，4分22秒，14分19秒，图1的拍摄时间点为15分01秒。结果表明，造影显示动脉前期，后极部透见荧光，随背景荧光增强而增强，未见明显渗漏，说明色素上皮发生萎缩，晚期荧光着染，也表明色素上皮病变。左眼未见明显异常。
[0036]4.0CT检查结果
图9为食蟹猴右眼造模前及造模后1，2，3，5，10周时0CT结果。其中，图a为右眼造模前0CT结果，图b、c、d、e、f分别为右眼造模后1、2、3、5、10周时的0CT结果，结果显示造模前视网膜脉络膜各层结构清晰正常，造模后视网膜外层及色素上皮层结构紊乱，IS/0S层不可见，随时间延长，视网膜各层结构稍清晰，但色素上皮层一直处于变薄状态。
[0037]讨论:
根据ERG结果，10m/kg组振幅下降，但 造模后缓慢上升，六周后基本恢复术前水平，不适合造模。而25mg/kg组振幅明显下降，呈熄灭型，不能进行量化统计，亦不适合造模。15mg/kg组和20mg/kg组造模后振幅明显下降，六周后维持在较低水平。眼底照片和FFA显示15mg/kg组视网膜色素上皮的损伤接近视网膜色素变性的临床改变，0CT在活体上显示了色素上皮和视网膜外层萎缩，与视网膜色素变性改变相似。可见碘酸钠颈动脉注射可以导致视网膜色素上皮的病变，尤其是20mg/kg的碘酸钠注射造成的视网膜色素上皮损伤适中，与人体视网膜色素变性的病理改变相似，对动物全身没有明显损伤，是一个合适的造模剂量。
【权利要求】
1.一种制作灵长类动物视网膜色素变性疾病模型的方法，其特征在于将碘酸钠以颈动脉注射的方式施于灵长类动物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于碘酸钠的剂量为15-20mg/kg。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于碘酸钠的浓度为10mg/ml，推注速度为0.2ml/So
【文档编号】A61K33/18GK103720714SQ201410010513
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2014年1月10日 优先权日:2014年1月10日
【发明者】计江东, 袁松涛, 刘庆淮 申请人:南京医科大学第一附属医院