一种荷载药物及脂肪来源间充质干细胞的多肽水凝胶支架及其制备方法
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及一种多肽水凝胶支架，尤其涉及一种荷载药物及脂肪来源间充质干细 胞的多肽水凝胶支架及其制备方法。
【背景技术】：
[0002] 与2D单层细胞培养相比，3D培养模型能更好地模仿天然组织中细胞的微环境，因 此该技术在研宄疾病进展及细胞对药物反应中更有价值。在众多材料中，以多肽为基本组 成单元，依靠多肽分子天然自组装得到的新颖支架材料具有纳米级纤维组成、简单的氨基 酸成分和充分的含水量，更接近天然细胞外基质，可为细胞提供理想的三维环境，同时多肽 作为一种生物物质，具有生物利用度高，毒性小和特异靶向等良好的生理功能越来越受到 药物创新研宄者的青睐。近年来，随着多肽化学的快速发展，多肽作为释药载体的功能应用 逐渐成为了新药研制的热点之一。但目前还没有利用多肽水凝胶支架同时荷载脂肪来源间 充质干细胞及抗癌药物他莫昔芬的研宄。
【发明内容】
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[0003] 本发明的目的是提供一种荷载药物及脂肪来源间充质干细胞的多肽水凝胶支架 及其制备方法。
[0004] 本发明的荷载药物及脂肪来源间充质干细胞的多肽水凝胶支架，其制备方法包括 以下步骤：
[0005] (1)、用超纯水配置浓度为1. 836 X KT5M~2. 651 X KT5M的枸橼酸他莫昔芬溶液；
[0006] (2)、在培养板中形成含有1.836 X KT5M~2. 651 X KT5M枸橼酸他莫昔芬的1 %多 肽水凝胶；
[0007] (3)、含有1.836X KT5M~2. 651 X KT5M的枸橼酸他莫昔芬溶液换洗步骤（2)中多 肽水凝胶中的溶液至PH为7. 0 ;
[0008] (4)、取人脂肪来源间充质干细胞加入培养板中，培养后即得到荷载药物及脂肪来 源间充质干细胞的多肽水凝胶支架。
[0009] 所述的培养板，优选为24孔培养板。
[0010] 步骤⑵所述的形成含有1. 836 X KT5M~2. 651 X KT5M枸橼酸他莫昔芬的多肽水 凝胶，优选按照 Sigma Aldrich HydroMatrix? Peptide Cell Culture Scaffold说明书的 步骤形成多肽水凝胶。
[0011] 步骤（4)所述的取人脂肪来源间充质干细胞加入培养板中，优选，1.0 X IO5个/ml 每孔加入500 μ 1。
[0012] 步骤⑷所述的培养，优选在37°C，5% CO2孵箱中培养3d。
[0013] 本发明的荷载药物及脂肪来源间充质干细胞的多肽水凝胶支架，既含有抗癌药物 枸橼酸他莫昔芬又含有人脂肪来源间充质干细胞，能作为种子细胞载体的同时对抗肿瘤药 物他莫昔芬起到缓释作用，可用于构建活体组织，填补目前多肽水凝胶培养支架同时荷载 药物-细胞的技术空白，构建能具有治疗效果与组织再生功能的3D培养支架。
【附图说明】：
[0014] 图1是不同浓度TAM对MCF-7和ADSCs的抑制率趋势图；
[0015] 图2是水凝胶外观（1 % w/v)。
【具体实施方式】：
[0016] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0017] 实施例1 :
[0018] 荷载药物及脂肪来源间充质干细胞的多肽水凝胶支架的制备：
[0019] (1)、用超纯水配置浓度为1. 836 X KT5M~2. 651 X KT5M的枸橼酸他莫昔芬溶液；
[0020] (2)、按照 Sigma Aldrich HydroMatrix? Peptide Cell Culture Scaffold 使用 说明书在24孔培养板中形成含有I. 836X KT5M~2. 651 X KT5M枸橼酸他莫昔芬的I %多 肽水凝胶；
[0021] 步骤如下：
[0022] 在水凝胶表面铺展细胞
[0023] 1、用蒸馏水将浓度为1% (w/v)储备液稀释至所需浓度，所得的工作液在使用前 要在冰上放置；
[0024] 2、将工作液加入到培养孔中，工作液的推荐体积详如表1所示，沿着孔壁加入1-2 倍体积的培养基使凝胶开始形成；
[0025] 表1.工作液的推荐体积
[0026]
[0027] 3、将加入工作液的培养板置于37°C环境中孵育1小时使凝胶形成，然后1-2小时 内小心地换液2次并让其在这段时间内保持37°C孵育，孵育后8小时内需使用；
[0028] 4、在水凝胶顶部加入所需数量细胞的培养基混悬液。
[0029] (3)、含有1.836X KT5M~2. 651 X KT5M的枸橼酸他莫昔芬溶液换洗步骤（2)中多 肽水凝胶中的溶液至PH为7. 0 ;
[0030] (4)、取人脂肪来源间充质干细胞以1.0 X IO5个/ml每孔加入500 μ 1，培养3d后 即得到荷载药物及脂肪来源间充质干细胞的多肽水凝胶支架。
[0031] 应用试验数据：
[0032] -、筛选药物浓度
[0033] 1、乳腺癌细胞（MCF-7)与不同浓度他莫昔芬（TAM)溶液平面培养3day
[0034] 表2.不同浓度TAM溶液对MCF-7活力的影响
[0040] 3、不同浓度TAM对MCF-7和ADSCs的抑制率如图1所示。当TAM浓度大于5 μ mol/ L时，其对于MCF-7活力的影响开始有显著性抑制，而当TAM浓度大于25 μ mol/L时，其对 ADSCs的活力影响才有显著性抑制。由此我们推论在TAM浓度为25 μ mol/L~50 μ mol/L 时，可以控制TAM对ADSC活力影响的同时能有效地抑制MCF-7的活力。
[0041] 4、计算半数致死量最后确定药物浓度
[0042] IC50(MCF-7) = 18. 36 ymol/L
[0043] IC50(ADSC) = 26. 51 ymol/L
[0044] 二、自组装多肽支架基本数据及表征：
[0045] 1、水凝胶多肽支架的基本数据：
[0046] 供应商：Sigma Aldrich，外观（颜色）：白色
[0047] 分子量：1526. 47g/mol，外观（形态）：固体
[0048] 纯度（HPLC) :94%
[0049] 2、水凝胶支架的表征：
[0050] 含水率：
[0051] WR(% ) = (mw-md)/md mw(干燥前重量）=0· 4964g
[0052] md(干燥后重量）=0· 02476g WR(% ) = 95. 01%
[0053] 三、平面培养与载药支架培养条件下对MCF-7活力影响的比较：（培养5day，ΤΑΜ 浓度均为25ymol/L)
[0054] 表4.载药支架培养条件下对MCF-7的抑制率
[0059] 抑制率= 80. 24%
[0060] 载药支架培养条件下对MCF-7抑制率（81. 92% )高于平面培养条件下对MCF-7 的抑制率（80. 24% )，我们可以推论，3D培养环境有利于药物与细胞的相互作用，在此前提 下，植入支架所用药量可根据实际情况进行减量，可在不影响正常药效的前提下，减少药量 有利于其他正常细胞的生长。
[0061] 四、平面培养与载药支架培养条件下对ADSCs活力影响的比较：（培养5day，TAM 浓度均为25ymol/L)
[0062] 表6 :载药支架对ADSCs的抑制率
[0067] 抑制率= 44. 86%
[0068] 结论：载药支架培养条件下对ASCs抑制率（25.40%)低于平面培养条件下对 ASCs的抑制率（44. 86% )，推测，ASCs在3D培养条件下，药物对其的不利影响显著少于3D 培养环境对其的有利影响。
[0069] 综上，我们可以推断，3D载药培养支架在有效抑制MCF-7活力的同时，对ADSCs的 影响是有限的，可以抑制乳腺癌的增殖速度的同时，维持植入支架中的种子细胞ADSCs的 正常增殖，该支架在用于构建治疗性活体组织方面具有可行性。
【主权项】
1. 一种荷载药物及脂肪来源间充质干细胞的多肽水凝胶支架，其特征在于，是通过以 下方法制备的： (1) 、用超纯水配置浓度为1. 836 X KT5M~2. 651 X KT5M的枸橼酸他莫昔芬溶液； (2) 、在培养板中形成含有1. 836 X KT5M~2. 651 X KT5M枸橼酸他莫昔芬的1 %多肽水 凝胶； (3)、含有1. 836 X KT5M~2. 651 X KT5M的枸橼酸他莫昔芬溶液换洗步骤⑵中多肽水 凝胶中的溶液至PH为7.0 ; (4) 、取人脂肪来源间充质干细胞加入培养板，培养后即得到荷载药物及脂肪来源间充 质干细胞的多肽水凝胶支架。2. 根据权利要求1所述的荷载药物及脂肪来源间充质干细胞的多肽水凝胶支架，其特 征在于，所述的培养板为24孔培养板。3. 根据权利要求1所述的荷载药物及脂肪来源间充质干细胞的多肽水凝胶支架，其特 征在于，步骤（2)所述的形成含有1. 836 X KT5M~2. 651 X KT5M枸橼酸他莫昔芬的多肽水 凝胶，按照 Sigma Aldrich HydroMatrix?Peptide Cell Culture Scaffold 说明书的步骤 形成多肽水凝胶。4. 根据权利要求1所述的荷载药物及脂肪来源间充质干细胞的多肽水凝胶支架，其特 征在于，步骤（4)所述的取人脂肪来源间充质干细胞加入培养板中，具体为=LOXlO 5个/ ml每孔加入500 y 1。5. 根据权利要求1所述的荷载药物及脂肪来源间充质干细胞的多肽水凝胶支架，其特 征在于，步骤（4)所述的培养，具体为：在37°C，5% CO2孵箱中培养3d。
【专利摘要】本发明公开一种荷载药物及脂肪来源间充质干细胞的多肽水凝胶支架及其制备方法。(1)用超纯水配置浓度为1.836×10-5M～2.651×10-5M的枸橼酸他莫昔芬溶液；(2)在培养板中形成含有1.836×10-5M～2.651×10-5M枸橼酸他莫昔芬的多肽水凝胶；(3)含有1.836×10-5M～2.651×10-5M的枸橼酸他莫昔芬溶液换洗步骤(2)中多肽水凝胶中的溶液至PH为7.0；(4)取人脂肪来源间充质干细胞以1.0×105个/ml每孔加入500μl，培养3d后即得到荷载药物及脂肪来源间充质干细胞的多肽水凝胶支架。本发明的多肽水凝胶支架，既含有抗癌药物枸橼酸他莫昔芬又含有人脂肪来源间充质干细胞，可用于构建活体组织。
【IPC分类】A61L27/54, A61K31/138, A61K47/42, A61P35/00, A61L27/22, A61L27/52, A61L27/38
【公开号】CN104984403
【申请号】CN201510332362
【发明人】徐峰, 伍慧敏
【申请人】南方医科大学珠江医院
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年6月16日