一种骨组织工程支架材料及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及组织工程材料，特别涉及一种骨组织工程支架材料及其制备方法，属于高新材料制造技术领域。
[0002]
【背景技术】
[0003]骨缺损的治疗一直以来是骨科临床上的难题之一。全球每年骨折和骨缺损的患者数以千万计，传统的治疗方法主要有自体骨移植、同种异体骨移植、人工骨移植，然而这些方法都存在较大的缺陷。自体骨移植作为骨移植技术的“金标准”，存在造成新的病损、来源有限、引起骨区感染、疼痛、手术时间长等缺陷；同种异体骨移植存在易被人体吸收，易感染，免疫排斥反应严重等；人工骨移植存在来源有限，成骨困难，原料孔隙率变异大等缺陷。由于现行骨缺损修复方法的种种缺陷，目前研宄者们将修复骨缺损目标转向骨组织工程。
[0004]骨组织工程是采用组织工程学的原理和方法，研制具有修复骨缺损能力的骨替代物的一门科学，基本原理是在体外构筑支架材料-种子细胞-生长因子复合物，然后移植到骨缺损处，经过材料的吸收和组织的增生，实现自身骨组织代替组织工程骨，最终实现骨的形态和功能上的修复。骨组织工程的研宄和应用将会克服现有骨缺损修复中自体骨移植来源少、异体骨移植存在排斥反应的问题和不足。因此通过研宄骨组织工程来修复骨缺损，不仅对我国骨治疗领域具有重要意义，而且对我国骨组织工程的发展具有推动作用。
[0005]骨组织工程研宄的中心环节是研制能够作为细胞移植与引导新骨生长的支架材料，以作为细胞外基质的替代物。目前支架材料主要有人工合成支架材料和天然支架材料。人工合成支架材料即用物理化学的方法合成的细胞外基质替代物，主要的无机材料有羟基磷灰石、磷酸三钙；有机高分子材料有聚乳酸、聚羟基乙酸等。Zhao等采用仿生矿化的方法，使PLGA网孔内壁沉积磷灰石矿化层，该法显著提高了 PLGA对骨髓基质干细胞的早期黏附，或能在临床上缩短患者的治疗时间。周立伟等将羟基磷灰石与聚酰胺(n-HA/PA66)复合成人工骨，并成功修复兔颅骨的缺损，试验中复合材料表现了良好的生物相容性，未对颅内代谢产生不良影响，植入12周后材料和颅骨之间界线模糊，显示复合材料的骨引导作用。
[0006]天然支架材料主要有天然高分子材料(壳聚糖、甲壳素、透明质酸、胶原等)和天然无机材料(天然珊瑚、人或动物的脱蛋白骨等)。曹罡等用珊瑚羟基磷灰石体外培养骨髓基质细胞，发现在体外细胞能继续增殖并表达成骨活性，Amaral等将鼠骨髓基质细胞种植到壳聚糖膜上进行体外培养发现，细胞可以大量黏附、扩增并有成骨倾向。Liu等用珊瑚支架复合自体脂肪干细胞，成功修复犬眶壁的重度全层缺损。但是CHA机械性能差，不能用于承重部位，难以塑形，植入后有一定体积丧失，大块植骨时吸收速度过慢，降解速度难以调控等缺陷也不能忽视。
[0007]可以说迄今为止开发的各类支架都存在着问题。人工合成的支架材料其最大优点是品种多，可选择范围广，生物降解速度可调。此外，合成材料还有力学性能和加工性能好，价格便宜，重现性好，利于大规模生产。缺点是生物相容性和细胞的亲和性比天然材料差。
[0008]天然支架材料一般具有细胞信号识别能力，能促进细胞的粘附、增殖和分化，大都无毒副作用，具有良好的生物相容性及良好的生物降解性，显示出人工合成材料无可比拟的优势。但其加工性、重现性、降解速度可调性不甚理想。部分天然-合成材料克服了一些问题，但是在成型、降解方面存在的问题也困扰着组织工程研宄人员。特别如人体软组织用的支架，对随模具成型性、强力、伸长度、弹性、柔韧性，以及与细胞生长相匹配的降解性能等要求甚高。
[0009]因此，开发一种具有诱导骨细胞长入、降解也可调控、具有优秀力学性能且生物相容性的骨组织组织工程支架是亟需解决的问题。
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【发明内容】
[0011]针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种骨组织工程支架材料，该组织工程支架材料具有力学性能优异，生物相容性好，与骨细胞生长性匹配的降解性，成型性好，以及能诱导骨细胞长入材料的优点，该支架材料加快骨细胞长入的生理过程，具有促骨生长性，能缩短病人的康复时间，加快临床治疗的过程，降低病人的痛苦。
[0012]本发明的另一个目的是提供一种所述的骨组织工程支架材料的制备方法，该制备方法具有反应条件温和，工艺简单，成本低廉，适于放大生产的优点。
[0013]为实现本发明目的，采用了以下技术方案:
一种骨组织工程支架材料制备方法，步骤如下，
O溶液的准备:
将丝素蛋白粉末溶解于去离子水中，配成浓度为8-15mg/ml的丝素蛋白溶液；
将磷酸溶液用去离子水稀释，配成浓度为0.01-0.lmol/L的磷酸溶液；
将氢氧化钙粉末溶于去离子水中，配成浓度为0.01-0.05mol/L的氢氧化钙溶液； 将丝胶蛋白粉末溶解于去离子水中，配成浓度为4%-8% (W/V)的丝胶蛋白溶液； 将壳聚糖溶解于稀酸溶液中，配成浓度为2-3%(W/V)的壳聚糖溶液；
将甘油磷酸钠溶解于去离子水中，配成浓度为50-60% (W/V)的甘油磷酸钠溶液；
2)制备丝素/羟基磷灰石粉末:将第I)步准备的丝素蛋白溶液与磷酸溶液均匀混合；然后在60-80°C恒温水浴中，将丝素蛋白与磷酸的混合液以40-60滴/min的速度缓慢的滴入到氢氧化钙溶液中，加完后，以150-220r/min搅拌2_3h，搅拌结束后调节反应溶液pH值为9-10，在反应温度水浴中沉化24-48h，真空抽滤，用去离子水漂洗至少三次，即得到丝素/羟基磷灰石粉末；其中，丝素蛋白溶液与磷酸溶液、氢氧化钙溶液的体积比为1: (1.5-2):(10-15)；
3)将步骤2)中得到的丝素/羟基磷灰石粉末添加到步骤I)准备的丝胶蛋白溶液中搅拌混合均匀，得到的丝胶/(丝素/羟基磷灰石)悬浊液，其中丝胶蛋白与丝素/羟基磷灰石粉末的质量比为1:0.5-1 ；
4)将步骤3)得到的丝胶/(丝素/羟基磷灰石)悬浊液，缓慢地加入到壳聚糖溶液中，搅拌均匀，调整体系的温度为1-1o°c，再逐滴加入步骤I)准备的甘油磷酸钠溶液搅拌30min，得到混合溶液；其中丝胶/(丝素/羟基磷灰石)悬浊液、壳聚糖溶液、甘油磷酸钠溶液的体积比为(0.67-1): (5-6):1;
5)将第4)步得到的混合溶液倒入模具中，将模具放入37-38?恒温水浴中，使混合溶液完成溶-凝胶转化，将凝胶材料先放在-10—20°C的温度下预冷冻2-5h，解冻l-3h，然后转到-70—80°C的冰箱中冷冻6-10h，然后放入冷冻干燥机干燥24h以上，真空度控制在10-50 Kpa，即得骨组织工程支架材料。
[0014]步骤I)中所述丝素蛋白粉末的制备方法为:采用盐溶酶解工艺，将废次茧壳或茧丝依次经醚类、醇类有机溶剂浸泡以除去其中的蜡质物、碳水化合物及灰分杂质，再经水煮沸脱胶盐溶后冷冻干燥即得到微米级丝素蛋白粉末。
[0015]步骤I)中丝胶蛋白粉末的制备方法为:将茧壳经醚类、醇类依次分别浸泡24-48h，用蒸馏水洗净、干燥，以除去蜡质和部分有机物和杂质；再将茧壳用蒸馏水煮沸至少6h，将丝胶蛋白溶于蒸馏水中，抽滤得到丝胶蛋白溶液，然后将丝胶蛋白溶液浓缩、冷冻干燥即得丝胶蛋白粉末。
[0016]步骤I)中的稀酸为稀盐酸或稀醋酸，浓度为0.05-0.2mol/Lo
[0017]与现有技术相比，本发明具有以下优点:
(I)根据仿生原理将羟基磷灰石沉聚于丝素蛋白上，合成了丝素/羟基磷灰石，将丝素/羟基磷灰石引入到丝胶/壳聚糖/甘油磷酸钠凝胶体系中，制备出骨组织工程支架材料，同时赋予该支架材料诱导骨细胞长入的功能，该支架材料的骨诱导性源于仿生人体中胶原/羟基磷灰石，因此诱骨生长性更优。
[0018](2)本发明所得的丝胶蛋白(丝素/羟基磷灰石)/壳聚糖/甘油磷酸钠组织工程支架材料，具备良好的生物相容性，降解可调控性及较好的成型性，可以作为用于治疗骨缺损的组织工程支架材料。
[0019](3)本发明所得的丝胶蛋白(丝素/羟基磷灰石)/壳聚糖/甘油磷酸钠组织工程支架材料在任意模具中从溶液转化成凝胶，经预冷冻、解冻、再冷冻，以及最终的冷冻干燥，在这个过程中，形成力学性能优异的组织工程支架材料。并且其力学性能可通过调整加入丝素/羟基磷灰石的量和丝胶蛋白溶液、壳聚糖溶液和甘油磷酸钠溶液之间的比例进行调控。
[0020](4)本发明的制备方法反应条件温和，工艺简单，原料成本低廉，适于放大生产；而且可根据需要调节物料配比从而调解材料力学性能和降解时间等，得到满足相应性能的组织工程支架材料。
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【附图说明】
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