专利名称：复合骨组织工程支架材料及其制备方法
技术领域：
本发明是涉及一种骨组织工程支架材料，特别是胶原-羟基磷灰石(HA)-硫酸软骨素(CS)-骨形态发生蛋白(BMP)复合骨组织工程支架材料及其制备方法。应用组织工程原理，以该材料为支架材料可构建组织工程化人工骨，用于修复各种原因造成的骨缺损。
背景技术：
由创伤、肿瘤、感染以及其它病因导致的骨缺损的发病率较高，它对人类的健康构成极大威胁。目前，骨缺损的修复主要采用自体骨、异体骨移植材料以及金属、高分子化合物、天然或合成磷酸钙类材料如珊瑚、羟基磷灰石等人造骨。由于供体有限、免疫反应、有传染病菌的危险等原因，这些治疗方法受到很大限制。因此，迫切需要发展具有理想生物相容性和生物功能性的移植材料。这些材料要求具有稳定、良好的生物性能，在新骨生成修复的同时可生物降解，从而真正实现骨缺损的修复。
近年来，随着细胞生物学、材料科学、分子生物学等学科的发展，新兴组织工程学科的形成为骨缺损的修复提供了新的方法和思路。该方法是将细胞种植于多孔三维支架材料上生长、增殖，细胞分泌细胞外基质并形成新的骨组织并且支架材料逐渐降解，然后将其植入缺损部位。三维支架材料，即细胞外基质替代物，是骨组织工程研究的关键之一，它不仅影响细胞的生物学行为和培养效率，而且决定着移植后能否与机体很好地适应、结合和修复的效果。
用于骨组织工程的三维支架材料应满足以下几个要求(1)良好的生物相容性和生物降解性，其在体内的降解产物对人体无害；(2)具有骨传导性，利于细胞粘附和增殖；(3)有一定的强度，能对抗外力；(4)易于塑形，可以根据需要加工成各种形状和大小。目前，用于骨组织工程的支架材料主要有两类，一类是无机材料，如生物活性陶瓷；另一类是有机高分子材料，如α-聚酯等合成材料、胶原等天然材料。研究表明，这些材料均不够理想，高分子材料强度不足，受力时容易变形，这样会损伤移植的细胞，而生物陶瓷降解速度慢，受力后容易碎裂。
天然骨基质主要由有机质和无机质组成。有机质中包括胶原纤维和无定形基质。其中胶原纤维约占有机质的95％，骨组织中绝大多数细胞都贴附在胶原表面生长，同时胶原也维持着骨组织的韧性，扫描电镜下可见骨基质中的胶原纤维的分支连结成网状。天然胶原材料具有引导和诱导细胞生长的作用，我们利用胶原材料制备的组织引导再生胶原膜(专利号94118836.1)显示了这一生物学功能。无定形基质为中性和酸性粘多糖，其中以嗜碱性的4-硫酸软骨素和6-硫酸软骨素为主。它们可促进细胞贴附、提高骨组织的强度和韧性。骨的无机盐是由磷酸钙形成的亚微沉淀物构成，与无机盐HAP[Ca10(PO4)6(OH)2]非常相近，它们位于基质内，胶原纤维物质在表面及内部沿纤维的方向长轴排列。在骨组织中，骨胶原纤维的抗压性和弹性较差，而HAP结晶则脆性较大，易碎裂，但当两者有规律的结合在一起时，骨组织即拥有独特的强度和韧性。在生理条件下，成骨细胞的分化和增殖受到多种细胞因子的调节，包括类胰岛素生长因子(IGF)、转化生长因子β(TGF-β)、骨形态发生蛋白(BMP)等，在骨修复过程中，细胞因子往往是通过多种因子协同作用而产生效果。其中BMP是一组具有骨诱导性的蛋白质。在组织工程化人工器官的构建中，无论从仿生学的原理，还是从功能化的角度来看，引入多糖类物质和细胞生长因子都有着积极的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的复合骨组织工程支架材料及其制备方法。本发明是模拟天然骨组织细胞外基质成分，在组织引导再生胶原膜(专利号94118836.1)专利基础上，以牛腱胶原、羟基磷灰石、硫酸软骨素、骨形态发生蛋白为原料，构建骨组织工程支架材料。应用组织工程原理，以该材料为支架材料可构建组织工程化人工骨。本发明具有良好的理化和生物学性能，是性能优良的骨组织工程支架材料。可用于治疗各种原因造成的骨缺损。
本发明包括胶原、羟基磷灰石、硫酸软骨素与骨形态发生蛋白构成，具有三维多孔的结构特征，孔径为50-150微米。
所述的胶原与羟基磷灰石的质量配比为1∶1-10，其通过冷冻干燥法成型。
所述的硫酸软骨素通过交联复合到支架材料上，交联剂中含2-吗啉乙烷磺酸、碳化二亚胺、琥珀酰亚胺与硫酸软骨素，交联剂中硫酸软骨素含量(质量比)为0.2-2％。
所述的骨形态发生蛋白为0.35-0.5mg/mL支架材料体积，其通过吸附结合到支架材料上。
复合骨组织工程支架材料的制备包括下述步骤1)以0.3％丙二酸溶液为溶胀液，配置固含量为0.5-0.7％的胶原溶胀液，按配比称取胶原溶胀液与羟基磷灰石，混合均匀，得到胶原-羟基磷灰石分散液，-20--60℃预冻至少4h，-30℃15h，-15℃18h，0℃15h，10℃7h，20C4h冷冻干燥，得到未交联胶原-羟基磷灰石支架材料；2)室温下，将制备的未交联的胶原-羟基磷灰石支架材料(按20ml/50mg胶原的量)浸泡于含50mmol/L 2-吗啉乙烷磺酸(MES)的40％乙醇中30min；然后将胶原-HA支架材料按20ml/50mg胶原的量浸泡在交联液中，交联液含50mmol/L MES，24mmol/L碳化二亚胺(EDC)，5mmol/L琥珀酰亚胺(NHS)，0.2-2％的硫酸软骨素；室温下交联4h；将支架在0.1mol/L的Na2HPO4中清洗1h，在1mol/L的NaCl中清洗2h，2mol/L的NaCl中浸泡清洗1昼夜，最后，用水清洗除去残余的交联液和NaCl，-30℃预冻至少4h，冷冻干燥机中二次冻干，-20℃8h，10℃4h，20℃4h。
3)称取人重组骨形态发生蛋白2，溶于甘氨酸缓冲液，浓度为1μg/μL，PH＝6.5，0℃下静置30min，将灭菌的支架材料浸没于上述反应液中，0℃下静置60min，取出支架材料，于超净工作台中快速风干，无菌封存。
图1本发明的扫描电镜(SEM)照片。
图2成骨细胞在本发明支架材料上体外培养三周后的SEM照片。
具体实施例方式
实施例1以0.3％丙二酸溶液为溶胀液，配置固含量为0.5％的胶原溶胀液。称取固含量0.5％胶原溶胀液60g与羟基磷灰石0.3g，混合均匀，得到胶原-HA分散液。先-30℃预冻至少4h，再以-30℃15h，-15℃18h，0℃15h，10℃7h，20℃4h冷冻干燥得到未交联胶原-HA支架材料。
室温下，将制备的未交联的胶原-HA支架材料浸泡于含120ml50mmol/L2-吗啉乙烷磺酸(MES)的40％乙醇中30min，然后将胶原-HA支架材料浸泡在120ml交联液中(含50mmol/L的MES，24mmol/L的碳化二亚胺(EDC)，5mmol/L的琥珀酰亚胺(NHS)，0.2％的硫酸软骨素)室温下交联4h。将支架在0.1mol/L的Na2HPO4中清洗1h，在1mol/L的NaCl中清洗2h，2mol/L的NaCl中浸泡清洗1昼夜，最后，用水清洗除去残余的交联液和NaCl，-30℃预冻至少4h，冷冻干燥机中二次冻干，-20℃8h，10℃4h，20℃4h。
将交联后的支架材料裁成直径16mm，厚3mm的圆片，称取rhBMP-2(人重组骨形态发生蛋白2)，溶于甘氨酸缓冲液，浓度为1μg/μL，0℃下静置30min，将灭菌的支架材料浸没于223μL rhBMP-2溶液中，0℃下静置60min。取出支架材料，于超净工作台中快速风干，无菌封存。
扫描电镜观察(SEM)支架材料表面镀金后，用HITACHI S-3500N扫描电镜进行SEM观察。SEM观察可知，支架材料为多孔三维结构，孔径平均约为100um。(见图1)成骨细胞于支架材料上的种植取处于指数生长期的3-4代骨髓基质干来源的成骨细胞，用0.25％的胰蛋白酶溶液消化，吹打，离心，重新悬浮于DMEM培养液中，细胞计数板计数，台盼蓝染色法测细胞活性率，然后调整细胞浓度至1.0×107个细胞/毫升。
将支架材料置于24孔培养板中，分别加入成骨细胞悬液各0.1ml，再加入含10％胎牛血清的DMEM培养液1毫升，37℃，5％CO2下培养，每2天更换一次培养液。
在第三周，取培养中的组织工程化人工骨样品，于戊二醛中固定2小时，锇酸中固定1小时，临界干燥；离子度膜；HITACHI S-3500N扫描电镜行SEM观察。
成骨细胞在支架材料中生长良好。分泌细胞外基质沉淀于细胞周围，大量细胞已被细胞外基质包埋，细胞与支架间、细胞与细胞间形成细胞桥。(见图2)实施例2以0.3％丙二酸溶液为溶胀液，配置固含量为0.5％的胶原溶胀液。称取固含量0.5％胶原溶胀液60克与羟基磷灰石1.2克，混合均匀，得到胶原-HA分散液。先预冻，再以冷冻干燥得到未交联胶原-HA支架材料。
室温下，将制备的未交联的胶原-HA支架材料浸泡于含120ml50mmol/L2-吗啉乙烷磺酸(MES)的40％乙醇中30min，然后将胶原-HA支架材料浸泡在120ml交联液中(含50mmol/L的MES，24mmol/L的碳化二亚胺(EDC)，5mmol/L的琥珀酰亚胺(NHS)，0.5％硫酸软骨素)室温下交联4h。将支架在0.1mol/L的Na2HPO4中清洗1h，在1mol/L的NaCl中清洗2h，2mol/L的NaCl中清洗1昼夜，最后，用水清洗除去残余的交联液和NaCl，冷冻干燥机中二次冻干。
将交联后的支架材料裁成直径16mm，厚3mm的圆片，称取rhBMP-2，溶于甘氨酸缓冲液，浓度为1μg/μL，0℃下静置30min，将灭菌的支架材料浸没于223μL rhBMP-2溶液中，0℃下静置60min。取出支架材料，于超净工作台中快速风干，无菌封存。
实施例3以0.3％丙二酸溶液为溶胀液，配置固含量为0.7％的胶原溶胀液。称取固含量为0.7％胶原溶胀液60克与羟基磷灰石0.84克，混合均匀，得到胶原-HA分散液。先预冻，再以冷冻干燥得到未交联胶原-HA支架材料。
室温下，将制备的未交联的胶原-HA支架材料浸泡于含168ml50mmol/L2-吗啉乙烷磺酸(MES)的40％乙醇中30min，然后将胶原-HA支架材料浸泡在168ml交联液中(含50mmol/L的MES，24mmol/L的碳化二亚胺(EDC)，5mmol/L的琥珀酰亚胺(NHS)，0.2％硫酸软骨素)室温下交联4h。将支架在0.1mol/L的Na2HPO4中清洗1h，在1mol/L的NaCl中清洗2h，2mol/L的NaCl中清洗1昼夜，最后，用水清洗除去残余的交联液和NaCl，冷冻干燥机中二次冻干。
将交联后的支架材料裁成直径16mm，厚3mm的圆片，称取rhBMP-2，溶于甘氨酸缓冲液，浓度为1μg/μL，0℃下静置30min，将灭菌的支架材料浸没于223μL rhBMP-2溶液中，0℃下静置60min。取出支架材料，于超净工作台中快速风干，无菌封存。
权利要求
1.一种复合骨组织工程支架材料，其特征在于它包括胶原、羟基磷灰石、硫酸软骨素与骨形态发生蛋白构成，具有三维多孔的结构特征，孔径为50-150微米。
2.根据权利要求1所述的复合骨组织工程支架材料，其特征在于所述的胶原与羟基磷灰石的质量配比为1∶1-10。
3.根据权利要求1所述的复合骨组织工程支架材料，其特征在于所述的硫酸软骨素通过交联复合到胶原-羟基磷灰石复合材料上，交联剂中含2-吗啉乙烷磺酸、碳化二亚胺、琥珀酰亚胺与硫酸软骨素，交联剂中硫酸软骨素质量含量为0.2-2％。
4.根据权利要求1所述的复合骨组织工程支架材料，其特征在于所述的骨形态发生蛋白为0.35-0.5mg/mL支架材料体积，其通过吸附结合到支架材料上。
5.权利要求1所述的复合骨组织工程支架材料的制备方法，其特征在于它是包括下述步骤1)以0.3％丙二酸溶液为溶胀液，配置固含量为0.5-0.7％的胶原溶胀液，按配比称取胶原溶胀液与羟基磷灰石，混合均匀，得到胶原-羟基磷灰石分散液，先-20-60℃预冻，再以冷冻干燥，-30℃15h，-15℃18h，0℃15h，10℃7h，20℃4h，得到未交联胶原—羟基磷灰石支架材料；2)室温下，将制备的未交联的胶原—羟基磷灰石支架材料按20ml/50mg胶原的量浸泡于含50mmol/L2-吗啉乙烷磺酸(MES)的40％乙醇中30min；然后将胶原-HA支架材料按20ml/50mg胶原的量浸泡在交联液中，室温下交联4h；将支架在0.1mol/L的Na2HPO4中清洗1h，在1mol/L的NaCl中清洗2h，2mol/L的NaCl中浸泡清洗1昼夜，最后，用水清洗除去残余的交联液和NaCl，先-20-60℃预冻，冷冻干燥机中二次冻干，-20℃8h，10℃4h，20℃4h。3)称取人重组骨形态发生蛋白2，溶于甘氨酸缓冲液，浓度为1μg/μL，PH＝6.5，0℃下静置30min，将灭菌的胶原-羟基磷灰石复合材料浸没于反应液中，0℃下静置60min，取出支架材料，于超净工作台中快速风干，无菌封存。
6.根据权利要求1所述的复合骨组织工程支架材料的制备方法，其特征在于所述的交联液含50mmol/L2-吗啉乙烷磺酸(MES)，24mmol/L的碳化二亚胺(EDC)，5mmol/L的琥珀酰亚胺(NHS)，0.2-2％的硫酸软骨素。
全文摘要
本发明是涉及复合骨组织工程支架材料及其制备方法。它包括胶原、羟基磷灰石、硫酸软骨素与骨形态发生蛋白构成，具有三维多孔的结构特征，孔径为50－150微米。所述的胶原与羟基磷灰石的质量配比为1∶1－10。所述的硫酸软骨素通过交联与材料复合。应用组织工程原理，以该材料为支架材料可构建组织工程化人工骨。本发明具有良好的理化和生物学性能，是性能优良的骨组织工程支架材料，可用于临床上因各种原因造成的骨缺损的修复。
文档编号C08L89/00GK1526765SQ03144308
公开日2004年9月8日 申请日期2003年9月23日 优先权日2003年9月23日
发明者张其清, 刘玲蓉, 李学敏 申请人:中国医学科学院生物医学工程研究所