专利名称：一种活塞形状的组织工程化骨及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种组织工程化骨，具体地说关于一种活塞形状的组织工 程化骨及其应用。
背景技术：
人类眼眶壁骨质菲薄，其中内侧壁仅0. 2-0. 4mm，下壁0. 5-1. Omm， 眼眶上壁与颅前窝、额窦相邻；内壁、下壁分别与筛窦、上颌窦毗邻。暴 力损伤极易造成眶壁骨折，表现为眶壁的塌陷及碎裂，骨折片掉入副鼻窦 中，从而形成眶壁缺损，软组织进而病入副鼻窦中，最终对患者的外观及 功能造成很大影响①眼球生理功能的改变视力丧失或下降、复视和眼 球运动障碍等；②面部外貌的改变目艮球内陷、移位、上睑下垂等；③感 染骨缺损致眼眶和副鼻窦相通，感染可通过缺损的骨壁波及眼眶及颅内。 因此，必须及时对眶壁缺损进行精确修复。
基于眼眶解剖结构的特殊性，应用组织工程技术修复缺损时与四肢骨、 下颌骨等承重骨存在显著的不同 一是眶壁菲薄、与副鼻窦相毗邻；二是 眶壁为非承重骨，所承受应力较低，而我们知道骨改建与应力有密切关系， 骨组织会随着其所受的应力而发生相应的改建。所以，在低应力的环境下， 植入的材料逐步降解之后，新生骨组织会发生怎样的改建，是否会形成我们所期待的形态及功能还有待研究。眼眶壁结构的特殊性决定了其修复不 同于其他部位的骨骼，是一个非常复杂而且特殊的过程。眶壁骨折及缺损
的修复治疗始于20世纪50年代，Converse首先应用骨组织移植修复爆 裂性眼眶骨折。由于眶壁菲薄，发生骨折后，无法将碎裂的眶壁重新4并接 再用于修复缺损，所以目前的手术方法是将眶内软组织复位后，采用自体 骨组织或人工材料桥架于缺损的骨壁上来达到修复的目的。自体骨移植一 直以来都是临床各种骨修复手术的金标准，但是自体骨的来源有限，而且 供区存在出血、感染、慢性疼痛等并发症的风险。异体骨来源广泛，具有 良好的骨传导性，但不具有骨诱导性，而且存在传播HIV和乙型肝炎等传 染性疾病及引起免疫排斥反应的潜在危险。异种异体骨移植来源于动物， 供应丰富，但是虽然经过各种方法加以处理，去处其内部的抗原性物质， 但是仍不可完全避免发生免疫排斥反应的风险，此外异种骨移植存在传播 动物源性疾病的危险，并存在伦理方面的问题。目前应用于眼眶壁修复的 人工材料主要包括高分子多孔聚乙烯、羟基磷灰石和钬金属，这些材料 均不能降解或降解很隻，长期作为异物存在于机体内'，故存在发生排异反 应、感染、嚢肿形成和植入物移位等并发症的危险。尤其当材料填充于眶 壁时， 一面与眶内组织接触，而另一面则完全暴露于鼻窦中，既没有骨膜 覆盖，也缺乏粘膜覆盖，早期血供很差，非常容易发生并发症。
目前的修复方法存在两个主要的不足之处①材料不能降解，长期作 为异物存在于机体内，存在排异反应、感染、嚢胂形成和植入物移位等并 发症；②材料桥架于骨壁之上，无法与自体骨的断端接触吻合，妨碍了骨 的爬行替代修复。种组织工程骨及其构建与应用"， 所述的组织工程骨，包括栽体支架和种子细胞，种子细胞附着于载体支架 上，形成具有骨组织三维结构和生物活性的复合体，所述的载体支架为改 性的具有大孔径和高孔隙率并经过去酸化处理的PLGA，其上负载有细胞因 子骨形态发生蛋白，即BMP;种子细胞为骨髓基质千细胞。所述的组织工 程骨可用于构建修复大段骨缺损的功能性组织工程化骨移植物。中国专利 文献CN1973910公开了 "组织工程骨及其制造方法"。中国专利文献 CN101085374公开了 "一种组织工程化骨复合体及应用"。但是，关于活 塞形状的组织工程化骨及其应用方面未见净艮道。
发'明内容
本发明的目的在于
(1)提供一种活塞形状的组织工程化骨； (2 )提供一种活塞形状的组织工程化骨的应用。 本发明的目的是通过以下技术方法来实现的构建眼眶壁组织工程 骨，其核心是建立骨种子细胞与支架材料的三维空间复合体。本发听以成 骨诱导的自体骨髓基质干细胞(Bone marrow stromal cells, BMSCs )作 为种子细胞，制备活塞形状的支架材料，体外复合构建个体化的眼眶壁组 织工程骨。
本发明的技术方案如下
一种活塞形状的组织工程化骨，它由下列方法制得 (1)骨种子细胞培养及诱导；(2)制备活塞形状的骨修复支架； (3 )体外复合骨种子细胞和骨修复支架并进行培养； 其中所述的步骤(3)是将培养至第二代时的骨种子细胞和骨修复 支架复合，形成骨种子细胞和骨修复支架复合物。
所述的骨种子细胞和骨修复支架复合物在体外培养时间为5天。 所述的骨修复支架由支架顶部和支架底部组成，所述的支架顶部厚度 为0. 5丄5毫米，支架底部厚度为1-2毫米，支架底部周边比支架顶部宽 出1-3毫米。
所述的支架顶部和支架底部的形状为圓形、长方形或异形，异形是不 规则形状。
所述的骨修复支架的材料选自珊瑚、羟基磷灰石或磷酸三钓中的一
种o
所述的骨种子细胞是骨髓基质干细胞。 活塞形状的组织工程化骨在眼眶壁、颅骨缺损修复领域中应用。 本发明所公开一种活塞形状的组织工程化骨及其应用，其优点表现
在(1)从少量骨髓中获取BMSCs，在成骨培养液诱导培养下，可短期内 获得大量有成骨能力的细胞。培养液中添加P-磷酸甘油、地塞米松及抗 坏血酸可诱导体外培养的BMSCs向成骨细胞分化，显示良好的成骨活性及 增殖能力细胞生长周期以及细胞增殖不受影响；ALP、钙结节染色呈强 阳性；表达成骨标志性蛋白(0CN， 0PN, BSP， Cbfal、 I型胶原等)及成 骨相关基因(0CN， 0PN， BSP)。 (2)活塞形状的支架能与眶壁缺损部位良 好吻合，既增加了手术修复的精确性又方便了手术操作和固定，更重要的是能保证移植物与宿主骨断端充分和紧密地结合，有利于新骨再生和替
代。(3)在体外构建并培养的眶壁组织工程骨，与正常眼眶壁的组织结构 和特性相似，在体内能够在支架材料降解的同时促进自体骨再生，并发生 合理的骨改建，最终为自体骨组织所替代，达到形态与功能的双重修复。 克服了现有眶壁材料不能够降解、易发生排异反应、感染、嚢肿形成和植 入物移位等并发症的缺点，同时克服了现有眶壁材并牛难于固定、与断端不 能良好吻合的缺点。(4 )本发明选用培养至第二代时的骨种子细胞和骨修 复支架复合，形成的复合物在体外培养5天。优化了本发明，节省了实一验 时间和实验费用。
图1: 一种活塞形状的骨修复支架正面图。 图2: —种活塞形状的骨》多复支架侧面图。
图3: BMSCs与p-TCP支架在体外复合5天时，扫描电镜观察材 料表面已经完全被细胞所覆盖，细胞增殖旺盛、并分泌胶原纤维。
图4: BMSCs与p-TCP支架在体外复合5天时，扫描电镜观察细 胞在材料内部帖壁生长，并相互交联形成网状。
图5:组织工程骨植入犬皮下1月即见新生骨组织和血管形成(50X )。 图6:组织工程骨才直入犬皮下3月新生骨组织明显增多，并出现骨 髓样脂肪组织(50X)。
图7:犬眶内侧壁造成一直径为lOmm的圆形缺损，破坏骨膜和眶隔。 图8:手术植入自体诱导BMSCs和p-TCP构建的"plug"式样眶壁组织工程骨，活塞状骨修复支架的支架顶部与内侧壁缺损吻合，支架底部覆 盖于眶壁内侧，无需固定。
图9:应用体外构建的眶壁组织工程骨原位修复犬眶内侧壁骨缺损， 术后CT影像随访见复合物逐渐降解变薄，至3月时已接近正常眶壁厚度 (框内区域)。
图10:应用体外构建的眶壁组织工程骨原位修复犬眶内侧壁骨缺 损，术后3月CT三维重建图像见植入物与周围眶壁融为一体、发生骨性 连接。
图11:应用体外构建的眶壁组织工程骨原位修复犬眶内侧壁骨缺 损，术后3月大体观察(正面观)眶内侧壁缺损处得到良好修复，植入物 不突出于周围眶内侧壁，与周边骨缺损断面吻合良好，结合线已模糊不清。
图12:应用体外构建的眶壁组织工程骨原位修复犬眶内侧壁骨缺 损，术后3月大体观察(侧面观)植入物与周围眶壁呈骨性连接，菲薄， 具备生理弧度。
图13A:骨》务复支架复合BMSCs后修复犬眶内侧壁缺损3月后， Micro-CT显示才直入物与周围眶壁已形成骨性连"l妄，与生理形态下的眶壁 相似。
图13B:骨修复支架复合BMSCs后修复犬眶内侧壁缺损3月后在靠 近筛窦的植入物表面可见覆盖有完整的粘膜,且可见新生的蜂窝状筛骨纸 板。
图14:眶壁组织工程骨修复犬眶内侧壁缺损3月后，硬组织切片焚 光显微镜下观察材料内部可见广泛分布的条带状荧光标记区域，相互交联呈网状。与材料表面相连的蜂窝状组织也可见条带状荧光。
图15A:骨修复支架复合BMSCs后修复犬眶内侧壁缺损3月后，硬 组织切片VAN GIESON-苦p未酸品红染色》见察示骨》务复支架与眶壁的骨 性结合(50x )。
图15B:骨修复支架复合BMSCs后修复犬眶内侧壁缺损3月后，硬 组织切片VAN GIESON-苦味酸品红染色观察示新生骨及少量未降解的 材料(50x )。
图15C:骨修复支架复合BMSCs后修复犬眶内侧壁缺损3月后，硬 组织切片VAN GIESON-苦味酸品红染色观察示新生骨表面有完整的粘 膜覆盖，并向筛窦内生长蜂窝状骨组织(50x )。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。 实施例1
体外构建犬眼眶壁组织工程骨 一、BMSCs的体外成骨诱导培养及检测
BMSCs在应用添加了 p-磷酸甘油、地塞米松及抗坏血酸的a-MEM培 养液进行体外成骨诱导培养，以未诱导BMSCs为对照，进行细胞形态学及 成骨活性检测。结果显示犬BMSCs经成骨诱导培养后细胞生长周期以及 细胞增殖不受影响，可传至10代以上，细胞形态和增殖率仍与原代基本 相似，足够数量作为种子细胞种植载体；ALP、钓结节染色呈强阳性；表 达成骨标志性蛋白(OCN， OPN， BSP, Cbfal、 I型胶原等)及成骨相关基因(0CN， 0PN， BSP)。而未诱导BMSCs的ALP染色呈弱阳性、4丐结节染 色阴性，成骨标志性蛋白及相关基因的表达量低于诱导组。
二、 犬眼眶壁P-TCP活塞形状支架材料的制造 犬眼眶内侧壁有一直径为10mm的圓形全层骨缺损。 制备骨修复支架，请参照图1，图2。
图1，图2为一种活塞形状的骨修复支架，该支架由支架顶部1和支 架底部2组成，支架顶部1和支架底部2的形状为圆形，支架顶部1直径 为10毫米，支架底部2直径为12毫米，支架顶部1厚度为1毫米，支架 底部2厚度为2毫米。所述一种活塞形状骨修复支架的制备方法如下使 用树脂模型进行硅橡胶取阴模，将P -磷酸三钙粉末搅拌成糊状后注入模 具，放入干燥箱8(TC中12小时，然后进行微波烧结一次成型。Co 60 (25kGy)消毒后，并对材料进行内部结构及力学性能的检测。结果显示 制备的P-TCP支架为多孔、较为致密，5ml注射器针尖不能轻易刺入，材 料亲水性良好。内部呈均匀的多孔三维结构，平均孔径406. 3jum，孔隙 率约为84.63°/。，力学强度〉2Mpa，达到眼眶壁组织工考呈支架的要求。
三、 BMSCs与TCP支架复合体外构建眶壁组织工程骨 成骨诱导BMSCs细胞培养至第二代时，胰蛋白酶消化后计数离心，制
备细胞悬液并调整密度为2 x l07cells/ml。以单细胞悬液滴渗法接种到 无菌培^jni中的预制P-TCP支架上，得到细胞/支架复合体。将该复合体 在37。C培养箱(5%C02， 95%02， 100%饱和湿度)中静置4小时，以利于细 胞贴壁。之后緩慢加入成骨诱导培养液，充分浸没材料，于上述条件继续 培养，每天更换培养液。分别于复合4小时、1天、3天、5天和7天，。以锐利刀片将其中一个标本切 为两个半圆部分，以了解细胞在支架内部的分布增殖情况。结果显示P -TCP具有良好的多孔三维结构，与BMSCs在体外复合4小时就完成了黏 附，较适宜的体外复合培养时间为5天(图3,图4 )。 实施例2
眼眶壁组织工程骨异位成骨能力的实验
按实施例l的方法体外复合自体诱导BMSCs和P -TCP支架材料构建组 织工程骨。
每只犬背部皮下植入3块材料自体诱导BMSCs复合TCP l块，自体未 诱导BMSCs复合TCP l块，单纯TCP材料1块。手术方法实验动物犬麻醉后， 于其背部3个独立分开区域各切开1. 5cm的小口 ，充分游离周围的皮下组织 后将材料植入，用l号线间断缝合切口。
分别于材料才l/v后l月、2月、3月取出标本，每个时间点取3只犬 的背部皮下标本9块(即自体诱导BMSCs复合TCP、自体无诱导BMSCs复 合TCP、单纯TCP材料各3块)。标本经4%多聚曱醛固定后用1(T/。EDTA溶 液脱钙，行HE染色后于光学显微镜下观察新骨形成和血管化情况。
结果显示自体诱导BMSCs复合TCP支架材料构建的组织工程骨植入 犬皮下1月即见新生骨组织和血管形成，3月时新生骨明显增多，并可见 丰富的新生血管和骨髓脂肪组织(图5，图6 )。未诱导BMSCs/ P -TCP复 合物仅见少量成骨，而单纯P-TCP不具备异位成骨能力。
实施例3眼眶壁组织工程骨原位修复犬眶内侧壁骨缺损的实验
按实施例l的方法体外复合自体诱导BMSCs和p -TCP支架材料构建组 织工程骨。
犬眶内側壁骨缺损模型的建立作下眼睑皮肤切口，顿性分离皮下组 织及肌肉，剥离骨膜，充分暴露眶内侧壁，使用直径10mm的骨科环钻在眶 内侧壁筛骨纸板处造成一直径为10mm的圓形缺损，破坏骨膜和眶隔(图7 )。 植入自体诱导BMSCs和P-TCP构建的"plug"式样眶壁组织工程骨，活塞 状骨修复支架的支架顶部与内侧壁缺损吻合，支架底部覆盖于眶壁内侧， 无需固定(图8 )。随后逐层关闭创口 。以自体无诱导BMSCs/ P -TCP复合物、 单纯P-TCP材料作为对照。术后第一天起青霉素80万单位肌注(每天2次 x3天)，预防感染。在处死动物取材前2天采用四环素静脉滴注，对新生 骨进行荧光标记。
术后1周、4周、8周、12周分别进行螺旋CT检查和三维重建观察。术 后12周取材，进行大体观察、骨密度检测、Micro-CT检查及组织学观察， 对结果进行统计分析，评价修复效果。
结果显示成骨诱导BMSCs和TCP复合构建的眶壁组织工程骨寸务 复犬眶内侧壁缺损，术后CT影像随访见复合物逐渐降解变薄，至3月时 已接近正常眶壁厚度(图9,图10);大体观察眶内侧壁缺损处得到良好 修复，才1^物不突出于周围眶内侧壁，与周边骨缺损断面吻合良好，结合 线已才莫糊不清(图11，图12); Micro-CT和组织学^r查显示植入物与周 围眶壁已形成骨性连接，在靠近筛窦的材一牛表面可见^隻盖有完整的粘膜， 且可见新生的蜂窝状筛骨纸板(图13A，图13B，图14,图15A，图15 B,图15 C );其骨密度为0. 16 ± 0. 03g/cm2,与正常骨密度(0. 11 ± 0. 01g/cm2) 无显著差别(P 〉 0. 05 )。而未诱导BMSCs/TCP复合物及单纯材料植入后降 解緩慢，3月后仍然明显凸出于正常眶壁；组织学检测表明大部分材料未 降解，仅在材料表面可见新生骨组织；骨密度与正常组有显著差异(P<
0. 05 )。
实施例4
BMSCs与P -TCP支架体外复合的合适时间实验
一、 复合方法
BMSCs细胞培养至第二代时，胰蛋白酶消化后计数离心，制备细胞悬 液并调整密度为2 x 10'cells/ml。以单细胞悬液滴渗法接种到无菌培养皿 中的圆片状P-TCP支架上，细胞/支架复合体在37。C培养箱(5y。C02, 95%02, 100%饱和湿度)中静置4小时，以利于细胞贴壁。之后将细胞/支架复合体 转移至6孔板中，每孔緩慢加入成骨诱导培养液约4ml，充分浸没材料，于 上述条件继续培养，隔天换液。
BMSCs与TCP体外复合后，分别于复合4小时、1天、3天、5天 和7天，分别取2个细胞材料复合体进行电镜观察。以锐利刀片将其中一 个标本切为两个半圆部分，以了解细^<在支架内部的分布增殖情况。
二、 电镜观察细胞-材料复合体的体外培养情况
1. 细胞在材料表面的生长情况
BMSCs接种于P -TCP上4小时后可见细胞单层复着于材料表面，分布均匀，大部分细胞向周围伸展而成多角形；小部分细胞呈圓形，尚未伸展。 接种l天后细胞基本均已向外伸展呈多角形，细胞紧密贴附于材料表面， 可见多个细胞相互形成网状或团块状，细胞进入孔与孔的孔内连接中。接 种3天后，细胞增殖迅速、重叠生长，呈规则排列的长梭状，材料表面的 孔隙基本被细胞覆盖填充。接种5天后，可见细胞继续快速增殖，呈多层 重叠生长，材料的表面及孔隙已被完全覆盖，细胞之间可见分泌的胶原纤 维。接种7天后，材料表面的细胞形态与接种5天时相似，也完全覆盖材料 表面。
2.细胞在材料内部的生长情况
BMSCs接种于P-TCP上4小时后可见细胞单层复着于材料内部的孔隙 表面，细胞呈圆形，尚未向周围伸展；靠近材料表面的孔隙内细胞较多， 而越靠近材料中心部，细胞的数量越少。接种l天后细胞开始向外伸展呈 多角形，细胞紧密贴附于材坤牛表面，并开始增殖。接种3天后，细胞增殖 迅速，可见多个细胞相互形成网状或团块状，细胞通过孔内连接相互沟通。 接种5天后，可见细胞继续增殖，细胞形态和分布于第3天相似，更多的细 胞间相互形成网状或团块状。接种7天后，材料表面的细胞形态出现老化， 细胞数量较前反而减少，考虑为随着培养时间的增加，材料表面被增生的 细胞所覆盖，影响了材料中间细胞与外界的气体和营养交换，所以细胞的 生长受到影响。4艮据观察结果显示，BMSCs与P-TCP复合后体外培养的适 宜时间为5天。
三、讨论组织工程的核心是构建细胞与生物支架复合物。在形成细胞-材料复 合物的过程中，细胞与材料的粘附A^出，细胞必须与材料发生适当的粘 附才能进行迁移、分化和增殖，而接种密度与细胞在材料上的粘附生长密
切相关。Goshima等发现磷酸三钙和羟基磷灰石复合物BMSCs接种密度为 5 x 107ml时，仅1/12标本有皮下成骨现象。Haynesworth等以磷酸三钓 和羟基磷灰石复合物为支架进行研究，认为0. 7-20 x 107ml是较佳的初 始接种细胞浓度范围。Bruder认为过高的接种浓度(大于50 x l06/ml ) 不利于骨髓基质干细胞粘附生长，并造成细胞营养供应不足。为此我们在 本实验中选择20 x 107ml作为初始接种细胞密度。
体外构建组织工程骨的另外一个重要因素是复合时间。目前对于细 胞和材料在体外需复合多少时间再回才直尚无定i仑，不同的细胞和不同的材 料所需的复合时间不尽相同。目前主要有两种观点， 一种意见提倡较长的 体外培养时间，其优点是体外的恒定环境能为细胞在材料表面附着和生 长提供一个稳定的营养环境并利于观察，尤其当利用生物反应器时，既能 模拟体内的血液动力学、物理机械环境，又能保持稳定的适合细胞生长的 环境。Mauney将BMSCs和支架材料在生物反应器中培养16天，并给予一 定的才几械刺激和一定浓度的地塞米+>进^^秀导，发现0PN及矿化基质都有 较高的分泌表达。另一种观点是尽可能的缩短体外培养时间，尽早回植， 其依据为体内的各种营养、动力学和物理^/L械环境对细胞的生长非常重 要，尤其是成骨细胞在骨形成的过程中需要一定的力学刺激，而体外无法 完全模拟体内的复杂环境。本实验通过扫描电镜观察了细胞-材料体外复 合后的在不同时间点，细胞的黏附、生长、增殖情况，以期为细胞-材料体外构建的培养时间选择提供参考。扫描电镜照片显示BMSCs与P-TCP 复合4小时时就完成了黏附，有部分细胞伸展为多角形，在材料表面和内 部均有细胞分布；l天后，细胞与材料表面完全贴附、伸展，开始分化和 增殖，材料内部的细胞也开始增殖；至第5天，细胞进一步分化和增殖， 形成复合细胞层完全覆盖TCP材料的表面，材料内部的细胞也进一步连成 网状或团块状，可见分泌细胞外基质及胶原纤维；但是第7天时，材料内 部的细胞开始老化，形态发生改变，数量也较前减少。由于静态培养条件 下支架表面的细胞优势生长，在培养5天后，细胞-支架复合体的表面均 形成了复合细胞层，加剧了支架内部由弥散限制导致的营养供应不足。因 此，在静态培养条件下BMSCs与0-TCP体外复合培养的时间不宜过长， 根据本实验的结果，体外培养5天较为合适。 实施例5
BMSCs体外诱导培养代数实验 在a -MEM培养液中添加10mM |3 -磷酸甘油、10nM地塞米;)^及50 u M抗 坏血酸作为成骨诱导剂，能够诱导体外培养的犬BMSCs向成骨细胞分化， 并显示良好的成骨活性及增殖能力。犬BMSCs体外诱导培养至第二代即可 表达成骨细胞表型(ALP，钧结节，0CN， 0PN， BSP, Cbfal和I型胶原的 表达等)，可作为理想的骨种子细胞。 一、BMSCs成骨功能的生化;^测 1、碱性磷酸酶(ALP)染色
ALP定性染色结果表明，成骨诱导培养7天的第二代BMSCs AKP染色 为强阳性，阳性反应细胞胞浆呈紫蓝色，局部细胞染色较深；而未诱导BMSCs则显色弱，提示AKP无明显表达。
2、 茜素红(ARS)染色
第二代BMSCs成骨诱导培养28天，茜素红染色在大体及镜下观察均见 红色的结节，而未诱导培养条件下BMSCs萏素红染色为阴性，说明BMSCs 在成骨诱导条件下可形成矿化结节。
3、 Von Kossa染色
第二代BMSCs成骨诱导培养28天，形成的白色结节经Von Kossa染色 呈棕褐色至棕黑色，未诱导的细胞因成骨分化较弱显淡褐色。
二、 免疫细胞化学检测BMSCs成骨相关蛋白的表达情况
诱导培养的BMSCs能表达OCN、 0PN、 BSP、 I型胶原和Cbfal:免疫 细胞化学染色可见大部分细胞胞浆中有椋色颗粒，免疫荧光观察大部分细 胞胞浆见绿色焚光。未诱导培养BMSCs可表达0CN、 BSP, OPN和I型月交原 染色见部分细胞胞浆内有棕色颗粒，免疫荧光见部分细胞胞浆呈绿色荧 光，但表达较诱导培养的BMSCs弱，且未见有Cbfal的阳性表达。人成纤 维细胞的染色除I型胶原阳性外其余均为阴性，空白对照均为阴性。
三、 Western-blot半定量检测BMSCs细胞0CN、 OPN蛋白表达情况 检测结果显示诱导培养的BMSCs和未i秀导培养的BMSCs组在1 5 KD
和3 6KD处均有条带形成，i兌明两组细月包中均有0CN、 0PN蛋白的分泌 表达。但是诱导培养的BMSCs的0CN和OPN蛋白条带比未诱导组深，提示 BMSCs经诱导后的骨基质蛋白的分泌增加。
四、 RT-PCR检测细胞中OCN、 OPN和BSP的mRNA表达情况
检测结果显示诱导培养的第二代BMSCs和未诱导培养的第二代BMSCs组均有0CN、 0PN和BSP的mRNA表达。提示BMSCs中存在确定性骨祖细胞 要，并能自动分化为成骨细胞)。
五、荧光定量PCR检测细胞中OCN、 OPN和BSP的mRNA表达差异
由SYBR Green法进行的Rea卜time PCR结果表明在进行成骨诱导培 养后的BMSCs的OCN表达量为未i秀导时的3. 32倍，OPN的表达为未诱导时 的2. 68倍。
无需进一步详细阐述，相信阅读了本发明上述公开的内容后，本领域 技术人员可最大限度地应用本发明，可作各种改动或修改，因此，前面的 实施方案应理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
权利要求
1、一种活塞形状的组织工程化骨，它由下列方法制得(1)骨种子细胞培养及诱导；(2)制备活塞形状的骨修复支架；(3)体外复合骨种子细胞和骨修复支架并进行培养；其特征在于所述的步骤(3)是将培养至第二代时的骨种子细胞和骨修复支架复合，形成骨种子细胞和骨修复支架复合物。
2、 根据权利要求1所述的组织工程化骨，其特征在于所述的骨种子细 胞和骨修复支架复合物在体外培养时间为5天。
3、 根据权利要求1所述的组织工程化骨，其特征在于所述的骨修复支 架由支架顶部和支架底部组成，所述的支架顶部厚度为0. 5-1. 5毫米，支架底 部厚度为1-2毫米，支架底部周边比支架顶部宽出1-3毫米。
4、 根据权利要求3所述的组织工程化骨，其特征在于支架顶部和支架 底部的形状为圆形、长方形或异形。
5、 根据权利要求l所述的组织工程化骨，其特征在于所述的骨修复支 架的材料选自珊瑚、羟基磷灰石或磷酸三钙中的一种。
6、 根据权利要求l所述的组织工程化骨，其特征在于所述的骨种子细 胞是骨髓基质干细胞。
7、 权利要求l-6任一所述的组织工程化骨在眼眶壁、颅骨缺损修复领域 中应用。
全文摘要
本发明涉及一种活塞形状的组织工程化骨及其应用。一种活塞形状的组织工程化骨由下列方法制得(1)骨种子细胞培养及诱导；(2)制备活塞形状的骨修复支架；(3)体外复合骨种子细胞和骨修复支架并进行培养；其中所述的步骤(3)是将培养至第二代时的骨种子细胞和骨修复支架复合，形成骨种子细胞和骨修复支架复合物。在体外构建并培养的眶壁组织工程骨，与正常眼眶壁的组织结构和特性相似，在体内能够在支架材料降解的同时促进自体骨再生，并发生合理的骨改建，最终为自体骨组织所替代，达到形态与功能的双重修复。活塞形状的组织工程化骨应用于眼眶壁、颅骨缺损修复领域中。
文档编号A61L27/38GK101628128SQ200810040540
公开日2010年1月20日 申请日期2008年7月14日 优先权日2008年7月14日
发明者周慧芳, 范先群 申请人:上海交通大学医学院附属第九人民医院