Bmp-2基因修饰的组织工程骨及其制备方法
【专利摘要】本发明属于生物领域，具体涉及一种BMP-2基因修饰的组织工程骨及其制备方法。其由骨支架材料和BMP-2基因修饰的骨髓间质干细胞(bMSCs)构建而成。所述组织工程骨的制备方法为：1)腺病毒介导的BMP-2转染体外培养的骨髓间质干细胞；2)将步骤1)得到的产物、骨支架材料复合构建组织工程化骨，其中，BMP-2腺病毒载体工作浓度分别为50pfu/细胞；腺病毒介导的BMP-2以MOI＝50pfu/cell转染体外培养的骨髓间质干细胞，所述骨髓基质细胞来源鼠、兔、羊、狗、猪骨髓基质细胞，所述复合构建是指细胞密度为5×107/ml的细胞悬液与生物支架材料复合。
【专利说明】BMP-2基因修饰的组织工程骨及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物领域，具体涉及一种BMP-2基因修饰的组织工程骨及其制备方 法。
【背景技术】
[0002] 骨组织工程学的兴起为颌骨缺损修复带来了希望。骨组织工程是细胞体外扩增与 可降解材料复合，体内构建具有活力的组织和器官的新兴技术，成为现阶段研究的热点。骨 组织工程学修复骨缺损较现行诸多方法有着明显的优点，例如，其不受供体来源的限制，可 避免免疫排斥反应，需要的供体组织少（细胞在体外培养增殖），可根据修复缺损的需要， 将植入物制成精确的三维立体结构。良好的支架材料是具有一定稳定性的三维支架，例如 长方体、立方体、圆柱体等，以便于植入体内后形成一个较固定的新生组织生长空间，但临 床上很多骨缺损均为非规则性缺损，形状固定的材料难以完整修复缺损空间。同时随着医 疗科技的飞速发展，良好的骨组织工程材料应最大限度地减少材料对机体的长期影响，大 多患者希望植入物在体内只是起到暂时替代作用，随着自身骨组织的再生，植入材料逐渐 降解吸收。而不同类型和部位的骨缺损要求材料还应具有良好的机械性能，易于加工成型， 可改变成易于植入人体的各种形状，植入人体后，在人体温度下恢复成治疗需要的形状。基 于这些要求，可降解的形状记忆材料（Shape-Memory Polymers, SMP)以其灵活的可变型性， 可适应不同形状的骨缺损，为组织工程修复骨缺损提供一种新的研究方向。
[0003] 脂肪族聚酯，如聚乳酸（PLA)、聚羟基丁酸酯（PHB)及聚己内酯（PCL)等，其结构 中均含有酯键，使得它们能够被自然界中的微生物分解，因而都具有良好的生物降解性能。 其中，聚己内酯PCL因其具有优异的力学性能、加工特性及形状记忆性能，已成为近年来研 究开发的热点，其在临床上被大量应用于生物医学工程领域，如骨组织固定装置、手术缝合 线、组织工程支架及药物控释体系等，被认为是具有很大发展潜力的生物可降解形状记忆 聚合物。但PCL也有一些性能上的缺陷。其熔点约为60°C左右，耐热性能及机械加工性能 均不佳，且其形状记忆性能只有约20%，而形变回复温度则达到40°C以上（高于37°C的人 体正常体温），这些缺陷在很大程度上限制了 PCL作为临床植入材料的应用。聚己内酯是一 种结晶性聚合物，对其进行交联的方法主要有两种，即引入过氧化物或对其进行辐射交联。 但是，目前的一些研究报道指出，PCL的辐射交联效率是比较低的，在交联的同时，裂解也在 进行，且占据了主导地位。当辐射剂量较高时，还会引起PCL的拉伸强度及断裂伸长率等力 学性能的明显下降。
[0004] 骨形成蛋白（BMP)属于转化生长因子超家族，其中BMP 2、4、5、6、7等与骨、软骨、 肌腱、牙周组织、牙本质的形成有极为密切的关系，均有明确的诱导成骨的作用。但传统的 BMP蛋白制备，无论是从骨基质中提纯，还是用基因工程表达，程序复杂，产量低，活性不稳 定；在修复大面积骨缺损时，BMP的用量大，可能会生毒性反应；BMP作为外源性蛋白植入体 内，也可能引起免疫反应。近年有学者探索应用BMP基因治疗的方法加速骨缺损的修复。 1988年Wozney等首先克隆出hBMPl-4cDNA。随后陆续克隆获得了 BMP家族中的其它成员， 为骨缺损修复的BMP基因治疗奠定了基础。BMP基因转移的载体各有特点，反转录病毒能将 目的基因整合到靶细胞基因组中，可长期表达，腺病毒不论靶细胞增殖状况均可高效转移， 介导的基因转移是非整合型的；裸DNA直接转导方法简单，无免疫原性，安全，费用低，缺点 是转导效率低。应用BMP基因治疗结合组织工程技术促进新骨的形成已成为目前骨再生领 域的研究热点。
[0005] 现有技术研究表明，PCL和PBS制备的多孔组织工程支架材料虽然可以改善骨支 架材料的亲水性以及力学性能，但是需要将PBS的含量提高到80%，这不可避免的牺牲了 PCL的形状记忆功能，PCL和PBS具有良好的生物相容性，实际应用中虽然其对种子细胞的 生长无明显毒性作用，但是对种子细胞生长的促进作用也不明显，因此有必要对其进一步 地改进。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的是提供一种BMP-2基因修饰的组织工程骨，其由骨支架材料和 BMP-2基因修饰的骨髓间质干细胞（bMSCs)构建而成。
[0007] 在本发明中，所述骨支架材料可以由100重量份的聚己内酯（PCL)，20重量份的聚 丁二酸丁二醇酯（PBS)，20重量份的聚丙交酯乙交酯共聚物（PLGA)和50重量份的磷酸三 钙（TCP)组成；所述骨支架材料也可以由100重量份的聚己内酯（PCL)，30重量份的聚丁 二酸丁二醇酯（PBS)，25重量份的聚丙交酯乙交酯共聚物（PLGA)和40重量份的磷酸三钙 (TCP)组成。
[0008] 在本发明优选的实施方案中，所述骨支架材料还经过天然高分子修饰，所述的天 然高分子是高分子明胶（优选重均分子量为30, 000?50, 000的明胶）、胶原蛋白或壳聚 糖。
[0009] 所述骨支架材料是具有两种不同孔径的介孔，所述介孔的孔径（直径）为75? 100 μ m和450?500 μ m。现代研究一般认为PCL支架中介孔孔径为单一 350 μ m时，体内 颅骨骨修复速率最佳，而体外的种子细胞培养中孔径的影响不是十分明显，但是本发明发 现由于不同组织的微环境存在着明显不同，具有不同孔径的骨支架材料在不同部位的骨修 复中其表现也不近相同，本发明通过大量试验研究发现本发明骨支架材料的孔径在体内的 颌骨修复出表现出极高的骨修复率。
[0010] 在本发明中，所述的PBS分子量范围为4?20万，熔点为110?120°C ;
[0011] 所述的PCL的分子量范围为4?20万，熔点为55?65°C ;
[0012] 所述的PLGA的分子量范围为1?5万，熔点为45?55°C。
[0013] 本发明的另一个目的是提供一种制备所述组织工程骨的方法，具体步骤如下：
[0014] 1)腺病毒介导的BMP-2转染体外培养的骨髓间质干细胞；
[0015] 2)将步骤1)得到的产物、骨支架材料复合构建组织工程化骨；
[0016] 其中，BMP-2腺病毒载体工作浓度分别为50pfu/细胞；腺病毒介导的BMP-2以MOI =50pfu/Cell转染体外培养的骨髓间质干细胞，所述骨髓基质细胞来源鼠、兔、羊、狗、猪 骨髓基质细胞，所述复合构建是指细胞密度为5XlOVml的细胞悬液与生物支架材料复合。
[0017] 在本发明中所述骨支架材料的制备方法为：
[0018] 1)将PCUPBS和PLGA搅拌溶解于二氧六环中，在40°C下高速搅拌使其溶解充分， 得到澄清溶液；PCL、PBS和PLGA在溶液中的总浓度为0. 2g/ml ;
[0019] 2)将磷酸三钙粉体、粒径（直径）为450?500 μ m的NaCl粒子和粒径（直径） 为75?100 μ m的NaHCO3粒子加入到步骤1的溶液中，超声使无机物分散均匀，-20°C冷冻 过夜得固形物；PCUPBS和PLGA的重量为致孔剂重量的1/4,所述致孔剂为NaCl和NaHCO 3, 两者的重量比为1:1 ;
[0020] 3)将固形物依次置于-20°C的无水乙醇溶液中12h和pH值为5的盐酸溶液中24h， 最后将固形物浸没与双蒸水中，每12h换水一次，6天后取出，冷冻干燥即得；
[0021] 4)在负压条件下，以京尼平（Genipin)为交联剂、水为分散介质，由步骤3)获得的 骨支架材料与天然高分子交联获后获得。
[0022] 本发明的另一个目的是所述组织工程骨在制备治疗颌骨损伤中的应用。
【具体实施方式】
[0023] 下面将进一步的详细说明本发明。
[0024] 实施例1
[0025] 骨支架材料制备
[0026] 1)将PCUPBS和PLGA搅拌溶解于二氧六环中，在40°C下高速搅拌使其溶解充分， 得到澄清溶液；PCL、PBS和PLGA的总浓度为0. 2g/ml ;
[0027] 2)将TCP粉体、粒径（直径）为450?500 μ m的NaCl粒子和粒径（直径）为 75?100 μ m的NaHCO3粒子加入到步骤1的溶液中，超声使无机物分散均匀，-20°C冷冻过 夜得固形物；致孔剂为NaCl和NaHCO 3，重量比为1: 1，PCL、PBS和PLGA的总重量为致孔剂 的 1/4 ;
[0028] 3)将固形物依次置于-20°C的无水乙醇溶液中12h和pH值为5的盐酸溶液中24h， 最后将固形物浸没与双蒸水中，每12h换水一次，6天后取出，冷冻干燥即得。所述骨支架材 料中PCL为100重量份，PBS为20重量份，PLGA为20重量份，TCP为50重量份；
[0029] 4)将壳聚糖溶于水中，浓度为4% (重量），向壳聚糖溶液中加入京尼平，浓度为 0. 2 % (重量），将步骤3获得骨支架材料浸入壳聚糖-京尼平溶液中，在0. 04?0. OlMPa 条件下，水浴15min，温度为40°C，从溶液中取出骨支架材料，置于37°C培养箱中10h，冷冻 干燥后即得。
[0030] 实施例2
[0031] 骨支架材料制备
[0032] 1)将PCUPBS和PLGA搅拌溶解于二氧六环中，在40°C下高速搅拌使其溶解充分， 得到澄清溶液；PCL、PBS和PLGA的总浓度为0. 2g/ml ;
[0033] 2)将TCP粉体、粒径（直径）为450?500 μ m的NaCl粒子和粒径（直径）为 75?100 μ m的NaHCO3粒子加入到步骤1的溶液中，超声使无机物分散均匀，-20°C冷冻过 夜得固形物；致孔剂为NaCl和NaHCO 3，重量比为1: 1，PCL、PBS和PLGA的总重量为致孔剂 的 1/4 ;
[0034] 3)将固形物依次置于-20°C的无水乙醇溶液中12h和pH值为5的盐酸溶液中24h， 最后将固形物浸没与双蒸水中，每12h换水一次，6天后取出，冷冻干燥即得。所述骨支架材 料中PCL为100重量份，PBS为30重量份，PLGA为25重量份，TCP为40重量份；
[0035] 4)将壳聚糖溶于水中，浓度为4% (重量），向壳聚糖溶液中加入京尼平，浓度为 0. 2 % (重量），将步骤3获得骨支架材料浸入壳聚糖-京尼平溶液中，在0. 04?0. OlMPa 条件下，水浴15min，温度为40°C，从溶液中取出骨支架材料，置于37°C培养箱中10h，冷冻 干燥后即得。
[0036] 实施例3
[0037] PCL/PBS/PLGA/TCP不同重量比对骨支架材料的影响
[0038] 采用不同的重量配比的PCL/PBS/PLGA/TCP，按照实施例1的方法分别制备骨支架 材料，具体配比如下：
[0039]
【权利要求】
1. BMP-2基因修饰的组织工程骨，其特征在于，其是由骨支架材料和BMP-2基因修饰的 骨髓间质干细胞（bMSCs)构建而成。
2. 根据权利要求1所述的BMP-2基因修饰的组织工程骨，其特征在于，所述骨支架材 料是由100重量份的聚己内酯（PCL)，20重量份的聚丁二酸丁二醇酯（PBS)，20重量份的聚 丙交酯乙交酯共聚物（PLGA)和50重量份的磷酸三钙（TCP)组成；或者是由100重量份的 聚己内酯（PCL)，30重量份的聚丁二酸丁二醇酯（PBS)，25重量份的聚丙交酯乙交酯共聚物 (PLGA)和40重量份的磷酸三钙（TCP)组成。
3. 根据权利要求2所述的BMP-2基因修饰的组织工程骨，其特征在于，所述骨支架材 料还经过天然高分子修饰，所述的天然高分子是高分子明胶，优选重均分子量为30, 000? 50, 000的明胶、胶原蛋白或壳聚糖。
4. 根据权利要求2所述的BMP-2基因修饰的组织工程骨，其特征在于，所述骨支架材料 是具有两种不同孔径的介孔，所述介孔的孔径（直径）为75?100 iim和450?500 iim。
5. -种制备权利要求1所述的BMP-2基因修饰的组织工程骨的方法，其特征在于，具体 步骤如下： 1) 腺病毒介导的BMP-2转染体外培养的骨髓间质干细胞； 2) 将步骤1)得到的产物、骨支架材料复合构建组织工程化骨，其中，BMP-2腺病毒载体 工作浓度分别为50pfu/细胞；腺病毒介导的BMP-2以MOI = 50pfu/cell转染体外培养的 骨髓间质干细胞，所述骨髓基质细胞来源鼠、兔、羊、狗、猪骨髓基质细胞，所述复合构建是 指细胞密度为5X107/ml的细胞悬液与生物支架材料复合。
6. 根据权利要求5所述的制备BMP-2基因修饰的组织工程骨的方法，其特征在于，所述 骨支架材料的制备方法为： 1) 将PCL、PBS和PLGA搅拌溶解于二氧六环中，在40°C下高速搅拌使其溶解充分，得到 澄清溶液；PCL、PBS和PLGA在溶液中的总浓度为0. 2g/ml ; 2) 将磷酸三钙粉体、粒径（直径）为450?500 ii m的NaCl粒子和粒径（直径）为 75?100 ii m的NaHC03粒子加入到步骤1的溶液中，超声使无机物分散均匀，-20°C冷冻过 夜得固形物；PCL、PBS和PLGA的重量为致孔剂重量的1/4,所述致孔剂为NaCl和NaHC03， 两者的重量比为1:1 ; 3) 将固形物依次置于_20°C的无水乙醇溶液中12h和pH值为5的盐酸溶液中24h，最 后将固形物浸没与双蒸水中，每12h换水一次，6天后取出，冷冻干燥即得； 4) 在负压条件下，以京尼平（Genipin)为交联剂、水为分散介质，由步骤3)获得的骨支 架材料与天然高分子交联获后获得。
7. 根据权利要求1-4所述的BMP-2基因修饰的组织工程骨，其特征在于，任一项所述组 织工程骨在制备治疗颌骨损伤中的应用。
【文档编号】A61L27/24GK104353116SQ201410513420
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年9月29日 优先权日:2014年9月29日
【发明者】张静莹 申请人:大连大学