一种双基因稳定表达的组织工程骨及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种组织工程化骨，具体地说关于一种双基因稳定表达的组织工程化骨及其制备方法。本发明的技术方案如下：一种Ne11-1与VEGF稳定表达的脂肪来源间充质干细胞构建组织工程化骨，它由下列方法制得：(1)质粒介导的Ne11-1与VEGF基因协同转染体外培养的脂肪来源间充质干细胞，并对细胞传代检测其表达情况；(2)将步骤(1)得到的细胞系与载有硫酸软骨素的胶原基骨修复材料共同培养，即获得能够稳定表达Ne11-1与VEGF基因的组织工程骨。本发明优点表现在：Ne11-1与VEGF基因协同修饰的添加硫酸软骨素的胶原基组织工程化骨，新骨形成效果优于BMP2、Ne11-1或VEGF单独修饰的普通组织工程骨。
【专利说明】一种双基因稳定表达的组织工程骨及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种组织工程骨，具体地说关于一种双基因稳定表达的组织工程骨及其制备方法。
【背景技术】
[0002]Nel 样分子 I 型(Nel-like type I molecular, NELL-1)是一种与人颉缝早闭症相关的外分泌型蛋白，近年来一系列体外及体内研究表明NELL-1更是一种非常有效的骨生长因子。与其他骨生长因子相比，NELL-1的生物学效应相对单一，其骨诱导活性也更具有特异性，同时它无法单独诱导异位骨组织形成，因此NELL-1可具有更高的生物安全性和精准性。NELL-1作为一种全新的生长因子在治疗各类骨组织缺损与骨再生方面具有广阔而良好的应用前景。研究证实NELL-1不仅能通过骨膜化骨还能通过软骨化骨的方式诱导骨再生。
[0003]VEGF在骨愈合过程中具有重要作用，它能与血管内皮细胞表面的特异性受体结合，一方面可以促进内皮细胞增殖、迁移；另一方面增加局部毛细血管通透性，使纤维蛋白原渗出，于周边形成凝胶样基质，可支持并诱导毛细血管长入。VEGF作为促使内皮细胞增殖、趋化的特异性细胞素，对于软骨内成骨及骨折愈合过程中的血管增生发挥着重要作用。VEGF作为旁分泌因子参与骨的形成与代谢，还可通过作用于成骨细胞强表达的VEGFR-1受体增加成骨细胞移动和分化功能，参与骨折的修复、塑型和改造过程，对骨形成及修复起到正性调节作用。Spector发现VEGF能引发成骨细胞的迁移及分化，且引起成骨细胞迁移及分化所需的浓度比BMP-2还低100倍。在软骨内化骨，特别是在骨形成偶合软骨吸收的过程中，VEGF对原始成骨细胞有趋化迁移作用，对骨的形成和重建有功能性的作用。
[0004]ADSCs通过抽脂的方式获得，不仅具有很强的体外扩增能力和多向分化潜能，且来源充足、易于分离培养，多次传代后细胞的增殖速度无明显减慢。ADSCs具有多向分化潜能，可向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌细胞、心肌细胞、平滑肌细胞乃至其他胚层方向分化。该细胞还具有促进创面愈合和组织修复、促进血管新生以及免疫调节等功能。实验证明，相同条件下ADSCs比BMSCs产生更多的骨原细胞和细胞外钙化的基质成分。ADSCs促血管新能力和BMSCs没有差别，它具有分化血管内皮细胞的潜能并参与进行血管构成。在低氧环境中ADSCs上清能明显促进血管内皮细胞的生长和减少内皮细胞凋亡。干细胞向血管内皮细胞分化的诱导实验发现，ADSCs比BMSCs能够形成更多完整的管状结构。ADSCs还能够抑制对供体细胞的免疫应答作用。
[0005]骨基质主要由有机质和无机质组成。有机质中包括胶原纤维和无定形基质,其中胶原纤维约占有机质的95%骨组织中绝大多数细胞都粘附在胶原表面生长，同时胶原也维持着骨组织的韧性，扫描电镜下可见骨基质中的胶原纤维分支连结成网状无定形基质为中性和酸性黏多糖，其中以嗜碱性的4-硫酸软骨素和6-硫酸软骨素为主，它们可促进细胞粘附，提高骨组织的强度和韧性骨的无机盐是由磷酸钙形成的亚微沉淀物构成，与无机盐HAP [CalO (P04) 6 (OH) 2]非常相近。在骨组织中，骨胶原纤维的抗压性和弹性较差，而HAP结晶则脆性较大，易碎裂，当两者以特定的结构结合在一起时，骨组织即拥有独特的强度和韧性。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种Nell-1与VEGF协同修饰脂肪来源干细胞构建组织工程化骨及其制备方法。
[0007]本发明的目的是通过以下技术方法来实现的:选择Nell-1与VEGF基因真核表达质粒转染体外培养扩增的大鼠ADSCs，并将该细胞系复合至载有硫酸软骨素的胶原基组织工程支架。
[0008]与其他骨生长因子相比，NELL-1的生物学效应相对单一，其骨诱导活性也更具有特异性，同时它无法单独诱导异位骨组织形成，NELL-1较BMPs骨诱导作用更特异、精确。骨形态形成蛋白(BMPs)是一类强有效的骨生长因子，并已被临床应用于治疗某些类型的骨组织疾病，但BMPs的骨诱导效应除骨软骨细胞系外还可作用于多种细胞系，BMPs除能促进原位骨再生外还可单独诱导异位成骨。另一方面，BMPs参与机体包括骨组织在内的多个器官的发育过程具有多种生物学效应，因此长期大剂量使用BMPs可导致严重的副反应。
[0009]VEGF在骨愈合过程中具有重要作用，它能与血管内皮细胞表面的特异性受体结合，一方面可以促进内皮细胞增殖、迁移；另一方面增加局部毛细血管通透性，使纤维蛋白原渗出，于周边形成凝胶样基质，可支持并诱导毛细血管长入。在骨缺损的修复过程中，VEGF对其他因子来说是一个调节因子，阻断bFGF和BMP的血管生成作用，并且，还可阻断0PG-1 (BMP-7)所引起的骨细胞的分化诱导作用，反之大多数骨诱导因子可以促进VEGF产生。因此，VEGF可以修复骨缺损部位的血运，并促进或阻断其他生长因子的表达，从而达到控制骨修复相关生长因子的作用。
[0010]脂肪来源的间充质干细胞获得方式简单，痛苦较小，具有调节固有免疫系统的能力，比其他细胞免疫原性低，具有抑制对供体细胞的免疫应答作用。比骨髓来源的间充质干细胞更适合用于组织工程的种子细胞。
[0011]本发明的技术方案如下:(1)选择构建Nell-1与VEGF基因的真核表达质粒，通过转染体外培养扩增的大鼠ADSCs，获得稳定表达Nell-1与VEGF基因的ADSCs细胞系。(2)构建胶原蛋白与Ca2+的白组装体系，并在反应体系中添加硫酸软骨素，获得载有硫酸软骨素的胶原基组织工程支架(3)将(I)中的细胞系与(2)中得到的支架共同培养，最终获得Nell-1与VEGF协同修饰脂肪来源干细胞构建组织工程化骨。
【具体实施方式】
[0012]实施例1、
[0013]体外扩增人源Nell-1与VEGF基因，通过酶连接转化，构建表达人源Nell-1与VEGF基因pcDNA3.1载体，经SDS-PAGE和western-blot检测2种蛋白的表达量达到3mg/ml后备用。
[0014]无菌状态下取SPF级6-8周龄雄性大鼠脂肪组织，用PBS冲洗5次。用0.1 % I型胶原酶37°C消化60min，间或搅拌。1500r/min离心5min，吸弃上层脂肪后，混匀用200目筛网过滤。所获得的细胞悬液1200r/min，离心8min，细胞沉淀用PBS洗涤后，调细胞浓度为IX 109/L，用含体积分数10%胎牛血清的a -MEM培养液悬浮，种于25cm2的培养瓶中，置于37°C、体积分数5% CO2培养箱中培养。48h后，吸出悬浮细胞液体，更换新培养基。3d换液I次。观察生长情况。培养1d左右细胞达80%以上融合后，进行传代培养。在养至第2至3代时，更换培养液为DMEM成骨诱导培养液备用。细胞生长至70?80%融合时，予以传代，24小时后细胞全部附着于底壁，此时吸去DMEM诱导分化培养液，无血清DMEM成骨诱导培养液洗涤2次，加入1/2体积包含Nell-1与VEGF各25pfu/细胞工作浓度pcDNA3.1载体的无血清DMEM成骨诱导培养液，在培养箱中培养一小时，期间每隔15分钟均匀轻摇晃，使病毒充分接触细胞。一小时后加入另外1/2体积的含20%血清的培养液。置培养箱培养24小时后，吸去培养液，PBS液洗涤两次，加入全量成骨诱导分化培养液，继续培养。通过western-blot分别检测Nell-1与VEGF基因的表达，确定两蛋白的有效表达，成功构建细胞系。将该细胞系加入DMSO冻存至液氮中备用。
[0015]取在氮气保护下溶剂的Ca(OH)2悬浊液、胶原/磷酸溶液同时滴加到自组装反应器中不管搅拌，钙磷摩尔比达到1.67左右，滴加过程中PH值控制在8?11之间，反应温度在2?8摄氏度之间恒温进行，以上2种溶液滴加完毕后，再加入硫酸软骨素溶液至终浓度为0.05%。全部滴加完成后继续搅拌12小时，再置于2?8°C静置12小时，抽滤并洗涤沉淀。在模具中板压成型，进行冷冻干燥处理，切割成2 X 2 X 4cm的长方体，并辐照灭菌，得到载有硫酸软骨素的胶原基仿生骨基质。
[0016]常规方法复苏稳定表达Nel 1-1与VEGF基因的ACSCs细胞系，胰蛋白酶消化，制成细胞密度为5X107/ml的细胞悬液，缓慢滴加到载有硫酸软骨素的胶原基仿生骨基质材料至饱和状态，使得材料湿润，而液体不流出。将该支架放入DMEM培养基中，置于培养条件为37°C恒温混合气体(5% CO2) 100%饱和湿度的培养箱中培养3天，最终获得Nell-1与VEGF协同修饰的组织工程化骨。
[0017]实施例2、
[0018]体外扩增人源Nell-1与VEGF基因，通过酶连接转化，构建表达人源Nell-1与VEGF基因pcDNA3.1载体，经SDS-PAGE和western-blot检测2种蛋白的表达量达到3mg/ml后备用。
[0019]无菌状态下取SPF级6-8周龄雄性大鼠脂肪组织，用PBS冲洗5次。用0.1 % I型胶原酶37°C消化60min，间或搅拌。1500r/min离心5min，吸弃上层脂肪后，混匀用200目筛网过滤。所获得的细胞悬液1200r/min，离心8min，细胞沉淀用PBS洗涤后，调细胞浓度为1X109/L，用含体积分数10%胎牛血清的a-MEM培养液悬浮，种于25cm2的培养瓶中，置于37°C、体积分数5% CO2培养箱中培养。48h后，吸出悬浮细胞液体，更换新培养基。3d换液I次。观察生长情况。培养1d左右细胞达80%以上融合后，进行传代培养。在养至第2至3代时，更换培养液为DMEM成骨诱导培养液备用。细胞生长至70?80%融合时，予以传代，24小时后细胞全部附着于底壁，此时吸去DMEM诱导分化培养液，无血清DMEM成骨诱导培养液洗涤2次，加入1/2体积包含Nell-1与VEGF各50pfu/细胞工作浓度pcDNA3.1载体的无血清DMEM成骨诱导培养液，在培养箱中培养一小时，期间每隔15分钟均匀轻摇晃，使病毒充分接触细胞。一小时后加入另外1/2体积的含20%血清的培养液。置培养箱培养24小时后，吸去培养液，PBS液洗涤两次，加入全量成骨诱导分化培养液，继续培养。通过western-blot分别检测Nell-1与VEGF基因的表达，确定两蛋白的有效表达，成功构建细胞系。将该细胞系加入DMSO冻存至液氮中备用。
[0020]取在氮气保护下溶剂的Ca(OH)2悬浊液、胶原/磷酸溶液同时滴加到自组装反应器中不管搅拌，钙磷摩尔比达到1.67左右，滴加过程中PH值控制在8?11之间，反应温度在2?8摄氏度之间恒温进行，以上2种溶液滴加完毕后，再加入硫酸软骨素溶液至终浓度为0.05%。全部滴加完成后继续搅拌12小时，再置于2?8°C静置12小时，抽滤并洗涤沉淀。在模具中板压成型，进行冷冻干燥处理，切割成2 X 2 X 4cm的长方体，并辐照灭菌，得到载有硫酸软骨素的胶原基仿生骨基质。
[0021]常规方法复苏稳定表达Nel 1-1与VEGF基因的ACSCs细胞系，胰蛋白酶消化，制成细胞密度为5X107/ml的细胞悬液，缓慢滴加到载有硫酸软骨素的胶原基仿生骨基质材料至饱和状态，使得材料湿润，而液体不流出。将该支架放入DMEM培养基中，置于培养条件为37°C恒温混合气体(5% CO2) 100%饱和湿度的培养箱中培养3天，最终获得Nell-1与VEGF协同修饰的组织工程化骨。
[0022]实施例3、
[0023]体外扩增人源Nell-1与VEGF基因，通过酶连接转化，构建表达人源Nell-1与VEGF基因pcDNA3.1载体，经SDS-PAGE和western-blot检测2种蛋白的表达量达到3mg/ml后备用。
[0024]无菌状态下取SPF级6-8周龄雄性大鼠脂肪组织，用PBS冲洗5次。用0.1 % I型胶原酶37°C消化60min，间或搅拌。1500r/min离心5min，吸弃上层脂肪后，混匀用200目筛网过滤。所获得的细胞悬液1200r/min，离心8min，细胞沉淀用PBS洗涤后，调细胞浓度为1X109/L，用含体积分数10%胎牛血清的a-MEM培养液悬浮，种于25cm2的培养瓶中，置于37°C、体积分数5% CO2培养箱中培养。48h后，吸出悬浮细胞液体，更换新培养基。3d换液I次。观察生长情况。培养1d左右细胞达80%以上融合后，进行传代培养。在养至第2至3代时，更换培养液为DMEM成骨诱导培养液备用。细胞生长至70?80%融合时，予以传代，24小时后细胞全部附着于底壁，此时吸去DMEM诱导分化培养液，无血清DMEM成骨诱导培养液洗涤2次，加入1/2体积包含Nell-1与VEGF各25pfu/细胞工作浓度pcDNA3.1载体的无血清DMEM成骨诱导培养液，在培养箱中培养一小时，期间每隔15分钟均匀轻摇晃，使病毒充分接触细胞。一小时后加入另外1/2体积的含20%血清的培养液。置培养箱培养24小时后，吸去培养液，PBS液洗涤两次，加入全量成骨诱导分化培养液，继续培养。通过western-blot分别检测Nell-1与VEGF基因的表达，确定两蛋白的有效表达，成功构建细胞系。将该细胞系加入DMSO冻存至液氮中备用。
[0025]取在氮气保护下溶剂的Ca(OH)2悬浊液、胶原/磷酸溶液同时滴加到白组装反应器中不管搅拌，钙磷摩尔比达到1.67左右，滴加过程中PH值控制在8?11之间，反应温度在2?8摄氏度之间恒温进行，以上2种溶液滴加完毕后，再加入硫酸软骨素溶液至终浓度为0.05%。全部滴加完成后继续搅拌12小时，再置于2?8°C静置12小时，抽滤并洗涤沉淀。在模具中板压成型，进行冷冻干燥处理，切割成2 X 2 X 4cm的长方体，并辐照灭菌，得到载有硫酸软骨素的胶原基仿生骨基质。
[0026]常规方法复苏稳定表达Nel 1-1与VEGF基因的ACSCs细胞系，胰蛋白酶消化，制成细胞密度为5X 108/ml的细胞悬液，缓慢滴加到载有硫酸软骨素的胶原基仿生骨基质材料至饱和状态，使得材料湿润，而液体不流出。将该支架放入DMEM培养基中，置于培养条件为37°C恒温混合气体(5% CO2) 100%饱和湿度的培养箱中培养3天，最终获得Nell-1与VEGF协同修饰的组织工程化骨。
[0027]实施例4、
[0028]体外扩增人源Nell-1与VEGF基因，通过酶连接转化，构建表达人源Nell-1与VEGF基因pcDNA3.1载体，经SDS-PAGE和western-blot检测2种蛋白的表达量达到3mg/ml后备用。
[0029]无菌状态下取SPF级6-8周龄雄性大鼠脂肪组织，用PBS冲洗5次。用0.1 % I型胶原酶37°C消化60min，间或搅拌。1500r/min离心5min，吸弃上层脂肪后，混匀用200目筛网过滤。所获得的细胞悬液1200r/min，离心8min，细胞沉淀用PBS洗涤后，调细胞浓度为1X109/L，用含体积分数10%胎牛血清的a-MEM培养液悬浮，种于25cm2的培养瓶中，置于37°C、体积分数5% CO2培养箱中培养。48h后，吸出悬浮细胞液体，更换新培养基。3d换液I次。观察生长情况。培养1d左右细胞达80%以上融合后，进行传代培养。在养至第2至3代时，更换培养液为DMEM成骨诱导培养液备用。细胞生长至70?80%融合时，予以传代，24小时后细胞全部附着于底壁，此时吸去DMEM诱导分化培养液，无血清DMEM成骨诱导培养液洗涤2次，加入1/2体积包含Nell-1与VEGF各50pfu/细胞工作浓度pcDNA3.1载体的无血清DMEM成骨诱导培养液，在培养箱中培养一小时，期间每隔15分钟均匀轻摇晃，使病毒充分接触细胞。一小时后加入另外1/2体积的含20%血清的培养液。置培养箱培养24小时后，吸去培养液，PBS液洗涤两次，加入全量成骨诱导分化培养液，继续培养。通过western-blot分别检测Nell-1与VEGF基因的表达，确定两蛋白的有效表达，成功构建细胞系。将该细胞系加入DMSO冻存至液氮中备用。
[0030]取在氮气保护下溶剂的Ca(OH)2悬浊液、胶原/磷酸溶液同时滴加到自组装反应器中不管搅拌，钙磷摩尔比达到1.67左右，滴加过程中PH值控制在8?11之间，反应温度在2?8摄氏度之间恒温进行，以上2种溶液滴加完毕后，再加入硫酸软骨素溶液至终浓度为0.05%。全部滴加完成后继续搅拌12小时，再置于2?8°C静置12小时，抽滤并洗涤沉淀。在模具中板压成型，进行冷冻干燥处理，切割成2 X 2 X 4cm的长方体，并辐照灭菌，得到载有硫酸软骨素的胶原基仿生骨基质。
[0031]常规方法复苏稳定表达Nel 1-1与VEGF基因的ACSCs细胞系，胰蛋白酶消化，制成细胞密度为5X 108/ml的细胞悬液，缓慢滴加到载有硫酸软骨素的胶原基仿生骨基质材料至饱和状态，使得材料湿润，而液体不流出。将该支架放入DMEM培养基中，置于培养条件为37°C恒温混合气体(5% CO2) 100%饱和湿度的培养箱中培养3天，最终获得Nell-1与VEGF协同修饰的组织工程化骨。
【权利要求】
1.一种双基因稳定表达的组织工程骨，它由下列方法制得: (1)构建Nell-Ι与VEGF基因的真核表达质粒，通过转染体外培养扩增的大鼠ADSCs，载体工作浓度为10?lOOpfu/细胞，获得稳定表达Nell-Ι与VEGF基因的ADSCs细胞系，Nell-Ι与VEGF蛋白表达浓度在3mg/ml以上； (2)构建胶原蛋白与Ca2+的自组装体系，并在反应体系中添加终浓度为0.01%?0.1%的硫酸软骨素，获得载有硫酸软骨素的胶原基组织工程支架； (3)将⑴中的构建的细胞密度为lX107/ml?lX109/ml的稳定表达Nell-1与VEGF基因的ACSCs细胞系与(2)中得到的体积为2?20cm3的胶原基骨修复材料共同培养，最终获得Nell-Ι与VEGF协同修饰脂肪来源干细胞构建组织工程化骨。
【文档编号】A61L27/20GK104399124SQ201410662543
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月5日 优先权日:2014年11月5日
【发明者】张舒, 毕宏伟 申请人:天津市赛宁生物工程技术有限公司