专利名称：一种生物活性骨组织工程材料的制备方法
技术领域：
本发明属于生物材料领域，涉及骨组织修复材料，特别涉及一种生物活性骨组织工程材料及其制备方法。
背景技术：
自20世纪80年代Robert Langer和Joseph P Vacanti首次提出“组织工程学”概念后，为众多的组织缺损、器官功能衰竭病人带来希望，引起了国内外学者广泛关注。骨组织工程材料的发展，从机体对材料的反应性来看，经历了 20世纪60 70年代的生物惰性材料、上个世纪末的生物反应性材料、以及促进组织再生性的生物活性材料三个阶段。对于骨组织工程材料的研究，目前主要集中在生物反应性材料以及其制备方法学的研究，而对于促进组织再生的生物活性材料的研究较少。生物活性材料是指具有可降解和高度生物活性，能够激活预修复组织细胞基因的表达，提高细胞的增殖和分化；主动诱导、激发组织 器官再生，实现人体缺损组织器官的再生和重现的生物材料。骨组织工程材料由无机和有机材料两部分组成，本发明无机材料采用生物陶瓷类，有机材料采用修饰后的天然高分子类材料。丝素蛋白由蚕茧或蚕丝经脱胶、溶解、透析及冷冻干燥获得，具有较好的组织相容性、可控的生物降解性、优良的机械性能、较少的免疫原性以及特定的化学组成，被广泛应用于眼角膜、血管、人造皮肤、韧带及骨等组织工程领域。研究发现，通过磺酸化丝素蛋白有高度的生物学活性，能够激活预修复组织细胞的基因表达，提高细胞的增值和分化。羟基磷灰石是一种生物活性陶瓷，与人体骨的Ca/P比与其极为相似，具有良好的骨传导性和生物活性，并且相态比较稳定，无毒副作用，而非晶态的羟基磷灰石具有一定的溶解性，可以提高材料及组织周围钙、磷的含量，促进骨细胞及组织生成。根据以上研究结果，本发明采用磺酸化丝素蛋白和非晶态的羟基磷灰石为原料，制备骨修复多孔支架材料。目前，2009年我国专利CN101502672A公开了羟基磷灰石/丝素蛋白多孔支架的制备方法，采用的是戊二醛交联丝素蛋白和羟基磷灰石，然后冻融两次并干燥获得多孔支架材料，对骨组织修复材料的性能有所改善。2011年专利CN102302804A公开了羟基磷灰石基生物复合支架及组织工程骨，采用粒子浙滤结合冷冻干燥制备了生物反应性骨修复材料，制备出可降解的骨修复材料。然而，骨修复材料的研究主要集中在第二代骨修复材料中制备方法学的研究，生物活性材料的研究报道甚少。因此，以具有生物活性的磺酸化丝素蛋白为基材制备组织工程多孔支架材料，提高软骨修复材料的生物活性，对骨组织工程材料的开发具有十分重要的意义。
发明内容
解解决的技术问题针对上述现有技术不足，为了提高骨组织工程材料自身的生物活性，本发明拟采用添加少量羟基磷灰石作为晶核，与磺酸化丝素蛋白进行混合，通过冷冻干燥方法制备多孔骨修复材料，进一步促进骨组织的再生，主动诱导、激发组织器官再生，实现人体缺损组织器官的再生和重现的生物材料。技术方案一种生物活性骨组织工程材料的制备方法，制备步骤为移取10 100mg/mL的非晶形纳米轻基磷灰石溶液，超声波分散30min Ih,将丝素蛋白和磺酸化丝素蛋白溶解在羟基磷灰石溶液中，混匀，使溶液中总蛋白的质量百分比浓度为I 20%，无机非结晶羟基磷灰石的质量百分比浓度为O. 01 5% ;0 4°C预冷I 5h，混匀；-20 -70°C预冻6h 24h，-40 -80°C冷冻干燥，获得生物活性骨组织工程材料。所述丝素蛋白和磺酸化丝素蛋白的质量比为I : (7 O. 25)。有益效果(I)本发明制备生物活性软骨组织修复多孔复合支架，以无晶形的羟基磷灰石为核可以更好促进新骨细胞及组织的再生。·(2)本发明制备生物活性软骨组织修复多孔复合支架过程简单，无毒害物质残留，易于操作，孔与孔之间连接性较好，孔隙率较高，满足骨修复材料的要求。(3)本发明制备生物活性软骨组织修复多孔复合支架，通过磺酸化丝素蛋白的引入，获得具有可降解和高度生物活性，能够激活预修复组织细胞的基因表达，提高细胞的增殖和分化；主动诱导、激发组织器官再生，实现人体缺损组织器官的再生和重现的生物材料，引入生物活性骨修复材料的概念。
图I磺酸化丝素蛋白的分子结构特征；图2多孔复合支架材料照片；图3多孔复合支架材料SEM分析；图4多孔复合支架材料FTIR分析。
具体实施例方式以下具体实施方式
不以任何形式限制本发明的技术方案，凡是采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案均落在本发明的保护范围。本发明所述实施例中涉及孔隙率，采用排液法进行测量，孔径及孔与孔之间的连接性通过SEM进行表征。(I)孔隙率的测定方法采用正己烷作为替代液体(正己烷的渗透力强，且在渗透过程中对支架无膨胀和收缩作用)。恒温条件下，将三个比重瓶中装满正己烷，并抽真空脱气，至无气泡溢出，分别称重M0，样品剪成大致相等的三块分别称重为Ms，将样品放入比重瓶内抽真空脱气，充分浸泡并装满正己烷，称重M1，迅速取出样品，并称剩余正己烷及比重瓶重M2,计算得孔隙率，求平均值即得到多孔支架的孔隙率。复合支架孔障率的计算公式
M _ Μ _ Μ^(%) = 1 V * 100%
Ma-M2(2)表征的条件分别为FTIR测试条件为称取样品与KBr混合研磨，压片得透明薄片，压力为15 20MPa，TENS0R27型FTIR红外光谱仪，扫描次数32次，分辨率4cm—1，扫描速度ΙΟΚΗζ，扫描范围4000 ^OcnT1 ;SEM条件为将干燥后的多孔复合支架，用锋利刀片切取获得横截面的切片，用离子溅射仪(MSP1S，Japan)将横截面切片进行喷金处理，于15KV条件下，观察支架的形态结构和孔径大小。以下实施例中Ca(NO3)2、(NH4)2ΗΡ04和氨水均为分析纯AR，由国药集团化学试剂有限公司提供。丝素蛋白的提取将分拣好的蚕苗壳剪成Imm2的小块,料液比l:50(w/v, g/ml)浸入98±2°C，O. 5wt%Na2C0jK溶液中，浸提30min，2次，蒸馏水充分洗涤、漂洗，除去丝胶蛋白后室温干燥。获得的丝素蛋白浸入60°C,9. 3M LiBr水溶液，溶解4h。丝素蛋白溶液利用截留分子量为3500透析袋透析2-3d,8000rpm离心除去沉淀。10wt%聚乙二醇(分子量为20000)浓缩至10%左右，4°C保存待用。磺酸化丝素蛋白的制备将68mg对氨基苯磺酸溶解在2mL水中与ImLl. 6M对甲·苯磺酸水溶液混合冰浴冷却，向混合液中添加ImLO. SM冰浴的亚硝酸钠水溶液，混匀，冰浴15min得到偶氮盐反应液，储存待用。向4mL (约10%)的丝素硼酸盐缓溶液(O. 2M pH9. O)添加ImL的偶氮盐反应液，反应20min，透析2 3d，冷冻干燥，获得磺酸化丝素蛋白。纳米羟基磷灰石制备过程如下0. IM等浓度的Ca (NO3) 2和(NH4) 2ΗΡ04溶液体积比5:3,采用流加方式将反应液进行混合(流加速度100ml/h),并机械搅拌300rad/min,以氨水调节pH为10 11，反应温度为70°C。流加结束后继续搅拌3h，将悬浊液加热至沸腾，除去大量氨气。将反应液在50°C恒温静置48h，每静置6h倒掉上清液加水到原体积继续静置陈化。然后抽滤，用蒸馏水清洗4次，冷冻干燥得到纳米羟基磷灰石。实施例I准确移取O. 268mL40mg/mL轻基磷灰石衆料,超声波分散30min,加入140mg质量比I : I的丝素蛋白和磺酸化丝素蛋白，溶解，补水至2mL,混合均勻,超声波分散30min分散。2°C预冷5h，混匀；-20°C预冻12h，_40°C冷冻干燥3天，获得生物活性骨组织工程材料，测得孔隙率为90. 3%。实施例2准确移取O. 02mL10mg/mL羟基磷灰石浆料，超声波分散30min，加入20mg质量比I : I的丝素蛋白和磺酸化丝素蛋白，溶解，补水至2mL混合均勻,超声波分散30min分散。4°C预冷5h，混匀；_40°C预冻6h，_45°C冷冻干燥2. 5天，获得孔隙率为95. I %生物活性骨组织工程材料。实施例3准确移取O. 055mL100mg/mL轻基磷灰石衆料,超声波分散30min,加入IOOmg质量比4 I的丝素蛋白和磺酸化丝素蛋白，溶解,补水至2mL混合均勻,超声波分散30min分散。(TC预冷lh，混匀；-20°C预冻12h，_50°C冷冻干燥2天，获得孔隙率为91. 2%生物活性骨组织工程材料。实施例4准确移取I. OmLlOOmg/mL轻基磷灰石衆料,超声波分散30min,加入400mg质量比I : 7的丝素蛋白和磺酸化丝素蛋白溶解,补水至2mL混合均勻,超声波分散30min分散。
4°C预冷5h，混匀；-20°C预冻24h，_45°C冷冻干燥2天，获得孔隙率为79. 3%生物活性骨组织工程材料。实施例5准确移取O. 5mL20mg/mL羟基磷灰石浆料，超声波分散30min，加入400mg质量比I : 3的丝素蛋白和磺酸化丝素蛋白溶解,补水至2mL混合均勻,超声波分散30min分散。4°C预冷4h，混匀；-20°C预冻12h，_60°C冷冻干燥2天，获得孔隙率为75. 6%生物活性骨组织工程材料。实施例6
准确移取O. 04mL75mg/mL羟基磷灰石浆料，超声波分散30min，加入240mg质量比I : 7的丝素蛋白和磺酸化丝素蛋白溶解,补水至2mL混合均勻,超声波分散30min分散。4°C预冷24h，混匀；-70°C预冻12h，_80°C冷冻干燥2天，获得孔隙率为85. 6%生物活性骨组织工程材料。实施例2制备的生物活性骨组织工程材料基本性质所制备的骨组织工程材料如附图2 ;骨组织工程材料的孔与孔之间连接性较好，如附图3 ;红外表征结果如图4，从谱图可以看出复合材料中包含羟基磷灰石及丝素蛋白的特征吸收峰。
权利要求
1.一种生物活性骨组织工程材料的制备方法，其特征在于制备步骤为移取10 100mg/mL的非晶形纳米轻基磷灰石溶液，超声波分散30min Ih,将丝素蛋白和磺酸化丝素蛋白溶解在羟基磷灰石溶液中，混匀，使溶液中总蛋白的质量百分比浓度为I 20%，无机非结晶羟基磷灰石的质量百分比浓度为O. 01 5% ;0 4°C预冷I 5h，混匀；-20 -70°C预冻6h 24h，-40 _80°C冷冻干燥，获得生物活性骨组织工程材料。
2.根据权利要求I所述的生物活性骨组织工程材料的制备方法，其特征在于所述丝素蛋白和磺酸化丝素蛋白的质量比为I :(7 O. 25)。
全文摘要
一种生物活性骨组织工程材料的制备方法，制备步骤为移取非晶形纳米羟基磷灰石溶液，超声波分散，将丝素蛋白和磺酸化丝素蛋白溶解在羟基磷灰石溶液中，混匀；0～4℃预冷1～5h，混匀；-20～-70℃预冻6h～24h，-40～-80℃冷冻干燥，获得生物活性骨组织工程材料。本发明制备生物活性软骨组织修复多孔复合支架，通过磺酸化丝素蛋白的引入，获得具有可降解和高度生物活性，能够激活预修复组织细胞的基因表达，提高细胞的增殖和分化；主动诱导、激发组织器官再生，实现人体缺损组织器官的再生和重现的生物材料，引入生物活性骨修复材料的概念。
文档编号A61L27/22GK102940906SQ20121055130
公开日2013年2月27日 申请日期2012年12月17日 优先权日2012年12月17日
发明者颜辉, 李绍群, 唐玉斌, 贾俊强, 吴琼英, 江明珠 申请人:江苏科技大学