一种组织工程骨及其制备方法
【专利摘要】本发明公开的一种组织工程骨为具有三维毛细血管网的多层细胞片叠层化物，所述的多层细胞片叠层化物由n片叠置的骨髓间充质干细胞片及填充于各骨髓间充质干细胞片层间的血管内皮细胞构成，n=3~8。其制备方法为：先在细胞培养器皿表面上制备光敏半导体结构层，获得光敏的细胞培养皿；再用光敏的细胞培养皿培养骨髓间充质干细胞，并获取骨髓间充质干细胞片；最后构建由多层骨髓间充质干细胞片及血管内皮细胞构成的多层细胞片叠层化物，经培养获得组织工程骨。本发明的组织工程骨单纯由同源细胞构成，降低了免疫排斥及支架降解造成的污染，对骨缺损的修复及其早期血管化具有重要意义，且本发明的方法简单易行，便于推广。
【专利说明】
一种组织工程骨及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种组织工程骨及其制备方法，具体涉及一种由多层细胞片构成的组织工程骨及其制备方法，属于组织工程领域。
【背景技术】
[0002]由于先天畸形、外伤、肿瘤等造成的骨组织缺损和缺失是临床常见的疾病，因此对骨组织缺损的功能性重建修复一直是再生医学的重要课题。传统的治疗方法常采用自体或异体骨移植，但往往因供源有限或免疫排斥反应等而限制了其临床应用。组织工程技术作为目前人工骨替代材料中应用最为广泛的一种，通过其生物可降解性被逐渐替换。如CN103285427A公开的《一种人工骨材料及其制备方法》，即采用适宜比例羟基磷灰石、胶原和纳米纤维素合成人工骨，具有良好的强度及降解性能。CN103157138A公开的《一种组织工程骨修复材料的构建方法》，则采用可注射型壳聚糖-β -磷酸三钙复合骨髓基质干细胞作为组织工程骨，可任意塑形且完全降解吸收，诱导成骨效应明显。然而，常规组织工程技术的细胞粘附主要通过修复区周边细胞的爬行或将相应细胞悬液滴定于材料表面或缺损区，细胞粘附利用率低、修复周期长，其大小、形状及定位也很难控制；同时，滴定细胞悬液往往形成散在岛状修复区，对于大片组织缺损并不适用；另外，应用传统组织工程所构建的生物骨组织植入宿主后其内毛细血管生长缓慢，不利于骨组织的生长、改建及支架材料降解，故构建具有初期血管化的新型组织工程骨对于骨组织的修复及重建具有重要的意义。
[0003]细胞薄层培养技术(TangZ, Akiyama Y, Yamato M, Okano T.Comb-typegrafted poly(N-1sopropylacrylamide) gel modified surfaces for rapid detachmentof cell sheet.B1materials (2010) ; 31 (29):7435-43.Nagase K, KobayashiJ, Kikuchi A, Akiyama Y, Kanazawa H, Okano T.Thermally-modulated on/off-adsorpt1n materials for pharmaceutical protein purificat1n.B1materials.(2011) ;32(2):619-27.)作为一种新型组织工程方法，具有其独特的优势。其通过相应中介物质或控制贴壁细胞所生长培养皿底部疏水-亲水转换从而控制细胞成片粘附生长和剥离，此“细胞片”多层叠加或复合培养后，无需包裹材料，本身即可作为一种“生物支架”植入缺损部位。相较胰酶作用获得的细胞，其并未破坏细胞间的蛋白连接及细胞同底部基质间的连接，细胞活性更好；同时，细胞薄层培养技术还可避免降低在组织修复时因使用生物降解支架材料而造成高污染的问题。CN103097518A和CN103180437A公开的《细胞片叠层化物的制造方法、由该方法得到的具有血管网的细胞片叠层化物及其利用方法》，即通过温敏细胞培养皿获得细胞片，将多层细胞片叠加形成复层细胞片叠层化物，并将其整体培养于含流路凝胶或动静脉袢构成的血管床上，得到了含血管网的心肌组织。然而，温控的条件相对复杂，对于设备要求较高，温度的间或改变亦影响细胞的活性，加速部分细胞老化，对于温度更为敏感的人成骨类细胞并不适用(Fukumori K, Akiyama Y, Yamato M, KobayashiJ, Sakai K, Okano T.Temperatureresponsive glass coverslips with an ultrathinpoly(N-1sopropylacrylamide) layer.Acta B1mater 2009;5:470-476)。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种具有血管网状结构的由多层细胞片构成的组织工程骨及其制备方法。
[0005]本发明的组织工程骨为具有三维毛细血管网的多层细胞片叠层化物，所述的多层细胞片叠层化物由η片叠置的骨髓间充质干细胞片及填充于各骨髓间充质干细胞片间的血管内皮细胞构成，η=3?8。
[0006]制备上述组织工程骨的方法，包括如下步骤:
1)制备光敏的细胞培养皿
将光响应纳米颗粒分散于去离子水中配成质量浓度为1(Γ20%的分散液，再将分散液与醇和有机溶剂按摩尔比为0.02、.06:6^9:Γ3的比例配制成前驱体溶液，将前驱体溶液滴至聚苯乙烯培养皿至其铺满，烘干并消毒，得到光敏的细胞培养皿；所述的光响应纳米颗粒为纳米氧化钛、纳米氧化锌或纳米氧化铁，醇为甲醇或乙醇，有机溶剂为四氢呋喃、三氯甲烷或二氯甲烷；
2)培养骨髓间充质干细胞片
取骨髓间充质干细胞，以5X 14IX 15个/cm2的密度植入步骤I)的光敏的细胞培养皿中，加入骨髓间充质干细胞专用培养基培养4?10天后，采用波长32(T450nm、强度f 4mW/cm2的光从培养皿底部射入，照射至光敏的细胞培养皿中骨髓间充质干细胞成片脱落，获得骨髓间充质干细胞片；
3)构建组织工程骨
将步骤2)得到的骨髓间充质干细胞片转移至细胞培养皿中，待其贴壁后，加入骨髓间充质干细胞专用培养基，在37°C、5%C02及饱和湿度条件下培养2?48h后，以5X 10，2X 15个/cm2的密度在其上植入血管内皮细胞，再在37°C、5%C02及饱和湿度条件下培养2?48h，吸除骨髓间充质干细胞专用培养基后，在上述结构上再转移一片骨髓间充质干细胞片，力口入骨髓间充质干细胞专用培养基，在37°C、5%C02及饱和湿度条件下培养2?48h ；
在上述结构上再以5 X 10^2 X 15个/cm2的密度在其上植入血管内皮细胞，在37°C、5%C02及饱和湿度条件下培养2?48h，吸除骨髓间充质干细胞专用培养基后，再次转移骨髓间充质干细胞片，并加入骨髓间充质干细胞专用培养基，在37°C、5%C02及饱和湿度条件下培养2?48h，重复上述的过程直至该结构具有η层骨髓间充质干细胞片，η=3^8,获得多层细胞片叠层化物，向细胞培养皿内的骨髓间充质干细胞专用培养基中添加成骨细胞诱导因子及成血管细胞诱导因子，在37°C、5%C02及饱和湿度条件下再培养Γ10天，得到组织工程骨。
所述的成骨细胞诱导因子为抗坏血酸、β_甘油磷酸钠和地塞米松中的一种或多种，其添加量分别可以为抗坏血酸5(Tl00Ug/ml、β -甘油磷酸钠5?1mM及地塞米松
IX ΙΟΛΓ?ιιΜ ;所述的成血管细胞诱导因子为血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子中的一种或两种，其添加量分别可以为碱性成纤维细胞生长因子5?10ng/ml及血管内皮生长因子l(T20ng/ml。
[0007]本发明中所涉及的骨髓间充质干细胞可由胚胎干细胞定向诱导分化或提取于骨髓、脂肪组织、外周血、胎儿血液或肝脏，血管内皮细胞可由胚胎干细胞定向诱导分化或提取于骨髓、外周血或脐带血。由于骨髓间充质干细胞来源不同，其所需的基础培养基也不相同，因此本发明中所述的骨髓间充质干细胞专用培养基是指与骨髓间充质干细胞的来源相对应的培养基，具体可参考如下文献:Small diameter vascular graft engineered usinghuman embryonic stem cell-derived mesenchymal cells (Tissue Eng Part A.2014Feb;20(3-4):740-50)^Differentiat1n of human embryonic stem cells into bipotentmesenchymal stem cells (Olivier E, et al., Stem Cells 2006 24: 1914-1922)及人骨髓间质干细胞的优化培养(庞永刚陈文弦崔鹏程，《中国修复重建外科杂志》2004 (3)220-224)。
[0008]与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果:
1.本发明通过光敏细胞培养皿获取骨髓间充质干细胞片，即通过紫外光或可见光照射引起光响应薄膜表面带电性及基团发生变化，从而使生长于其上的细胞从相应器皿表面整体脱附得到细胞片，相较于现有的细胞薄层技术，本发明的方法更为便捷，效率更高，同时，避免了对温度更为敏感的人成骨类细胞因温度改变而产生的老化、坏死等现象。
[0009]2.本发明的具有血管网状结构由多层骨髓间充质干细胞片叠层化物构成的组织工程骨，相较于现有的人工骨材料，无需生物材料作为支架承载，单纯由同源细胞构成，降低了免疫排斥及支架降解造成的污染，并于体外形成了具有三维血管网状结构的新型组织工程骨，对骨缺损的修复及其早期血管化具有重要意义。
[0010]
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1是多层骨髓间充质干细胞片叠层化物的宏观图
图2是多层骨髓间充质干细胞片叠层化物的倒置显微镜下图其中a:多片细胞片周边区域b:多片细胞片中间区域图3是组织工程骨中血管内皮细胞的特异性荧光标记图其中a:血管内皮细胞表面特异性标志物CD31 b:血管内皮细胞特异标志物UEA-1 c:细胞核标记物。
【具体实施方式】
[0012]下面结合具体实施例对本发明做进一步地说明，但本发明的实现方式并不局限于此。
[0013]实施例一
1)制备光敏细胞培养皿
将氧化钛纳米颗粒均匀分散于水中形成质量浓度为20%的分散液，将分散液与甲醇和四氢呋喃按0.06:9:3的比例配成前驱体溶液；再将上述前驱体溶液按48 μ L/cm2均匀滴加到聚苯乙烯培养皿上，放入65°C烘箱中干燥，干燥后即可获得包含晶粒尺寸为2(T30nm，厚度为60nm?10nm的光响应纳米氧化钛薄膜的细胞培养皿；
2)培养骨髓间充质干细胞片
取3飞代人骨髓间充质干细胞，以2X 15个/cm2的密度植入直径为5cm的含纳米氧化钛的培养皿中，培养10天后，采用波长450nm、强度4mW/cm2的紫外照射5min，即得成片脱落的人骨髓间充质干细胞片；
3)构建组织工程骨
采用新型细胞片转移联动仪将步骤2)制得的单层人骨髓间充质干细胞片转移至常规细胞培养皿中，待其贴壁后，加入干细胞专用培养基(含10%胎牛血清，L-谷氨酰胺2mmol/L，青霉素100U/ml，链霉素100mg/ml)，置于37°C、5%C02饱和湿度条件下培养48h后，以
2X 15个/cm2的密度在其上植入人脐静脉血管内皮细胞，在上述培养条件下放置2h，吸除培养基后，用新型细胞片转移联动仪将第二层人骨髓间充质干细胞片转移至其上，相同条件下静置培养2h。随后，再以2X 15个/cm2的密度在其上植入一层人脐静脉血管内皮细胞，并相同条件下培养2h，最后将第三层人骨髓间充质干细胞片转移至其上，即得包含三层人骨髓间充质干细胞片及双层夹心人脐静脉血管内皮细胞的多层细胞片叠层化物，图一即为多层细胞片叠层化物的宏观图，图二则为相应多层细胞片叠层化物的倒置显微镜图(a、b分别表示多层细胞片的周边及中间区域)，显示多层细胞间粘附良好，未见明显漂浮死细胞。于上述干细胞专用培养基中额外添加碱性成纤维细胞生长因子10ng/ml及血管内皮生长因子20ng/ml,并添加成骨细胞诱导因子抗坏血酸100ug/ml、β-甘油磷酸钠1mM及地塞米松luM，体外培养4天后即得具有血管网状结构的组织工程骨，图三即为组织工程骨中血管内皮细胞特异性荧光标记图(a、b分别表示血管内皮细胞表面特异性标志物CD31及UEA-1染色)，显示叠层化物间血管内皮细胞已逐渐形成血管网状结构。
[0014]对本例中使用的人骨髓间充质干细胞的具体来源说明:
征得年轻植骨患者同意，髂骨取骨，用注射器吸取1ml骨髓液，注射器内含稀释的肝素钠2500U/ml约0.5ml，将细胞悬液贴壁缓慢注入到预置有等体积密度为1.077kg/L的人淋巴细胞分离液的试管内，使两者间形成清晰的界面。以2500r/min离心20min，吸取中间的乳白色云雾状单核细胞层，PBS漂洗，1500r/min离心lOmin，弃上清，加入含10%小牛血清的人骨髓间充质干细胞专用培养液(江苏赛扬生物)10ml，制成单细胞悬液，以适当密度接种于底面积为25cm2培养瓶内，置入37°C、5%C02饱和湿度条件下培养，4天后首次半量换液，将未贴壁的细胞全部弃掉，以后每2?3天全量换液一次。待细胞汇合成单层后，以0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化，即得到原代骨髓间充质干细胞悬液。待细胞融合达80%以上，按1: 3或1: 4传代培养，取第3代生长达80%融合的贴壁细胞，用胰蛋白酶消化，计数后取2 X 16个细胞，分装6管，每管加入10 μ I荧光标记抗体CD45-FITC、CD34-PE、CD73-PE、CD105-FITC、CD166-PE，另设I管为空白对照，室温避光30min，用PBS反复洗2_3次，加入200 μ I PBS混匀细胞，并以1%多聚甲醛固定，4°C保存，24h内上流式细胞仪检测，正常人骨髓间充质干细胞高表达⑶73、⑶105及⑶166，⑶34及⑶45则呈阴性。
[0015]对本例中使用的人脐静脉血管内皮细胞的具体来源说明:
无菌获取新生J L脐带,立即用生理盐水冲洗血迹,剪去钳痕和血肿部位,找出脐静脉(2根管腔较小的是脐动脉，I根管腔较粗的是脐静脉)，用带平针头的注射器从一段插入脐静脉，用血管钳固定，再用PBS液冲净脐静脉内血迹，为防止脐动脉残留的血液混入，可将动脉分离少许用消毒线结扎，用血管钳钳夹另一端，从冲洗的针头中注入0.1%的胶原酶液使其充盈，放入37°C水浴锅内孵育15min。取出脐带松开血管钳释放酶细胞混合液于离心管中，再用PBS液冲洗脐静脉后一并收集于离心管中，1000r/min,离心5min，弃上清，加DMEM培养液(含10%胎牛血清，L-谷氨酰胺2mmol/L，青霉素100U/ml，链霉素100mg/ml，碱性成纤维细胞生长因子10ng/ml，血管内皮生长因子20ng/ml)，置于37°C、5%C02饱和湿度条件下培养，24h后首次换液，以后每2?3天换液一次。待细胞融合达80%以上，按1: 3或I: 4传代培养，取第3代生长达80%融合的贴壁细胞，用0.25%胰蛋白酶(含0.0296EDTA)消化，经PBS清洗数次后，加入20 μ I荧光标记抗体⑶31-ΡΕ，另设空白对照，室温避光30min后行流式细胞仪鉴定，正常人脐静脉血管内皮细胞高表达CD31。
[0016]实施例二
I)制备光敏细胞培养皿的
将氧化锌纳米颗粒均匀分散于水中形成质量浓度为10%的分散液，将分散液与乙醇和三氯甲烷按0.02:6:1的比例配成前驱体溶液，再将上述前驱体溶液按25 μ L/cm2均匀滴加到聚苯乙烯培养皿上，放入65°C烘箱中干燥，干燥后即可获得包含晶粒尺寸为l(T20nm，厚度为40nm?80nm的光响应纳米氧化锌薄膜的细胞培养皿。
[0017]2)培养骨髓间充质干细胞
取培养数代后的同源人骨髓间充质干细胞，以5X 14个/cm2的密度植入直径为5cm的含纳米氧化锌的培养皿中，培养4天后，采用波长320nm、强度lmW/cm2的紫外照射30min，即得成片脱落的人骨髓间充质干细胞片。
[0018]3)构建组织工程骨
采用新型细胞片转移联动仪将单层同源人骨髓间充质干细胞片转移至常规细胞培养皿中，待其贴壁后，加入干细胞专用培养基(含10%胎牛血清，L-谷氨酰胺2mmol/L，青霉素100U/ml，链霉素100mg/ml)，置于37°C、5%C02饱和湿度条件下培养2h后，以5 X 14个/cm2的密度在其上植入同源人血管内皮细胞，在上述培养条件下放置48h，吸除培养基后，用新型细胞片转移联动仪将第二层同源人骨髓间充质干细胞片转移至其上，相同条件下静置培养48h。随后，重复依次植入同源人血管内皮细胞并培养及转移人骨髓间充质干细胞片并培养，直至该结构具有8层骨髓间充质干细胞片，获得多层细胞片叠层化物，在上述培养基中额外添加5ng/ml碱性成纤维细胞生长因子及10ng/ml血管内皮生长因子，并添加成骨细胞诱导因子抗坏血酸50ug/ml、β -甘油磷酸钠5mM及地塞米松I X 10_8M,体外培养10天后即得组织工程骨。
[0019]对本例中使用的骨髓间充质干细胞的具体来源说明:
将人胚胎干细胞定植培养于失活鼠成纤维细胞饲养层之上，加DMEM/F12培养液(含20%血清替代物，ImM L-谷氨酰胺，1%非必需氨基酸，10mM^-巯基乙醇，4ng/ml碱性成纤维细胞生长因子)，待其周边出现呈碎屑状的自分化细胞团，取此零碎细胞片于含10%小牛血清的人骨髓间充质干细胞专用培养液(江苏赛扬生物)中培养数周，用包含胰酶、IV型胶原酶及中性蛋白酶的混合液解离、再培养,并通过流式细胞仪分选出CD45、CD34阴性，而SH2、SH3、SH4呈阳性的同源人骨髓间充质干细胞。(人胚胎干细胞受赠于新加坡国立大学)对本例中使用的血管内皮细胞的具体来源说明:
将人胚胎干细胞定植培养于失活鼠成纤维细胞饲养层之上，加DMEM/F12培养液(含20%血清替代物，ImM L-谷氨酰胺，1%非必需氨基酸，10mM β -巯基乙醇，4ng/ml碱性成纤维细胞生长因子)，并通过20ng/ml BMP-4促分化作用2天后，形成拟胚体。随后，将其定植于基质胶表面，加DMEM培养液(含10%胎牛血清，L-谷氨酰胺2mmol/L，青霉素100U/ml，链霉素100mg/ml,碱性成纤维细胞生长因子5ng/ml,血管内皮生长因子10ng/ml)另促分化10余日后，以CD31为标志物筛选出人胚干细胞来源的血管内皮细胞。(人胚胎干细胞受赠于新加坡国立大学)
【权利要求】
1.一种组织工程骨，其特征在于所述的组织工程骨为具有三维毛细血管网的多层细胞片叠层化物，所述的多层细胞片叠层化物由η片叠置的骨髓间充质干细胞片及填充于各骨髓间充质干细胞片间的血管内皮细胞构成，η=3?8。
2.制备如权利要求1所述的组织工程骨的方法，其特征在于包括如下步骤: 1)制备光敏的细胞培养皿 将光响应纳米颗粒分散于去离子水中配成质量浓度为1(Γ20%的分散液，再将分散液与醇和有机溶剂按摩尔比为0.02、.06:6^9:Γ3的比例配制成前驱体溶液，将前驱体溶液滴至聚苯乙烯培养皿至其铺满，烘干并消毒，得到光敏的细胞培养皿；所述的光响应纳米颗粒为纳米氧化钛、纳米氧化锌或纳米氧化铁，醇为甲醇或乙醇，有机溶剂为四氢呋喃、三氯甲烷或二氯甲烷； 2)培养骨髓间充质干细胞片 取骨髓间充质干细胞，以5X 14IX 15个/cm2的密度植入步骤I)的光敏的细胞培养皿中，加入骨髓间充质干细胞专用培养基培养4?10天后，采用波长32(T450nm、强度f 4mW/cm2的光从培养皿底部射入，照射至光敏的细胞培养皿中骨髓间充质干细胞成片脱落，获得骨髓间充质干细胞片； 3)构建组织工程骨 将步骤2)得到的骨髓间充质干细胞片转移至细胞培养皿中，待其贴壁后，加入骨髓间充质干细胞专用培养基，在37°C、5%C02及饱和湿度条件下培养2?48h后，以5X 10，2X 15个/cm2的密度在其上植入血管内皮细胞，再在37°C、5%C02及饱和湿度条件下培养2?48h，吸除骨髓间充质干细胞专用培养基后，在上述结构上再转移一片骨髓间充质干细胞片，力口入骨髓间充质干细胞专用培养基，在37°C、5%C02及饱和湿度条件下培养2?48h ； 在上述结构上再以5 X 10^2 X 15个/cm2的密度在其上植入血管内皮细胞，在37°C、5%C02及饱和湿度条件下培养2?48h，吸除骨髓间充质干细胞专用培养基后，再次转移骨髓间充质干细胞片，并加入骨髓间充质干细胞专用培养基，在37°C、5%C02及饱和湿度条件下培养2?48h，重复上述的过程直至该结构具有η层骨髓间充质干细胞片，η=3^8,获得多层细胞片叠层化物，向细胞培养皿内的骨髓间充质干细胞专用培养基中添加成骨细胞诱导因子及成血管细胞诱导因子，在37°C、5%C02及饱和湿度条件下再培养Γ10天，得到组织工程骨。
3.根据权利要求2所述的组织工程骨的制备方法，其特征在于所述的成骨细胞诱导因子为抗坏血酸、β-甘油磷酸钠和地塞米松中的一种或多种，所述的成血管细胞诱导因子为血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子中的一种或两种。
【文档编号】A61L27/58GK104225681SQ201410480554
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月19日 优先权日:2014年9月19日
【发明者】王慧明, 俞梦飞, 洪逸, 董灵庆 申请人:浙江大学