专利名称：一种组织工程骨修复材料的构建方法
技术领域：
本发明属于组织工程学技术领域，具体涉及一种组织工程骨修复材料的构建方法。
背景技术：
组织工程是二十一世纪生命科学一大热点。它的核心内容是体外细胞三维培养，它的基本方法是将种子细胞与可降解生物材料组成复合体，替代受损组织器官。可注射型组织工程骨是利用初始状态为液态的可降解生物材料，与种子细胞有机复合，制备成液态可注射的组织工程骨，并且在完全填充骨缺损的过程中，逐步固化形成凝胶或固态的组织工程骨修复骨缺损。可注射骨易于塑形，与种子细胞、生长因子复合便捷，且具有组织损伤小、不破坏修复区血供、操作简便易行等优点，适应了微创外科技术发展的要求，因此正逐步引起国内外诸多学者的髙度关注。目前，用于可注射骨的材料多为凝胶类，主要包括纤维蛋白凝胶，聚氧化乙烯水凝胶，藻酸盐凝胶等，这些生物材料注入体内后为凝胶状，并不具备生物力学强度，虽然复合种子细胞植入体内后都有一定的成骨效果，但距理想的可注射骨支架材料还有相当的距离。
发明内容
本发明的目的在于提供一种组织工程骨修复材料的构建方法，该骨修复材料为可注射性材料复合骨髓基质干细胞构成，可任意塑形且复合细胞简便，在一定时间内可完全降解吸收，诱导成骨效应明显，成本较低廉。本发明所采用的技术方案是:
一种组织工程骨修复材料的构建方法的制备方法，包括如下步骤:
1)种子细胞的培养:抽取骨髓，以全骨髓培养法分离培养骨髓基质干细胞，所用的培养基为含10%胎牛血清的DMEM培养基，细胞经传代增殖培养至第三代IO7数量级；
2)可注射性支架材料的制备:将壳聚糖与β-磷酸三钙按Iml:0.5g的比例于体外复合形成壳聚糖-β -磷酸三钙复合物；
3)种子细胞的处理:将培养至第三代IO7数量级的骨髓基质干细胞用0.3ml的DMEM混
匀；
4)种子细胞与壳聚糖-β-磷酸三钙的复合:壳聚糖-磷酸三钙复合8分钟后立即加入步骤(3)处理后的种子细胞，加入量比例为壳聚糖、β-磷酸三钙、DMEM按3ml: 1.5g:
0.3ml充分混匀，即获得所述的组织工程骨修复材料的构建方法。本发明所釆用的壳聚糖是甲壳素部分脱乙酰基后的衍生物，为天然髙分子聚合物，具有良好的生物降解性，降解产物无毒副作用。本发明所釆用的β_磷酸三钙属于钙磷陶瓷类，具有和自然骨相似的化学成份、良好的生物相容性和生物降解性。本发明将两者复合而成为较理想的组织工程骨可注射性支架材料。以往对壳聚糖交联所釆用的交联剂为戊二醛，但戊二醛被证实有细胞毒性，故本发明中釆用柠檬酸作为壳聚糖的交联剂。柠檬酸是人骨有机质的重要组成部分，占到全身的70%，其对糖、脂肪、蛋白质的氧化代谢过程有重要作用。由于柠檬酸中含有羧基，可以与壳聚糖中的羟基发生酯化反应，未反应的羧基将与壳聚糖中的氨基作用形成盐键。通过此键，使壳聚糖交联形成有机网络结构。本发明选用壳聚糖为有机相，β -磷酸三钙为无机相，β -磷酸三钙与壳聚糖复合后，分散在有机网络结构中，复合物最初为液态，逐惭固化形成固态、多孔网状结构且具有一定的生物力学强度，从而制备了一种新型有机/无机复合的可注射材料。本发明技术方案带来的有益效果是:
I)本发明骨修复材料为可注射性材料复合骨髓基质干细胞构成，可任意塑形且复合细胞简便，在一定时间内可完全降解吸收，诱导成骨效应明显，成本较低廉。2)本发明通过实验结果证实了壳聚糖-磷酸三钙复合支架材料与BMSCs的相容性良好，是一种可行的可注射型组织 工程骨支架材料。以这种复合材料构建的可注射组织工程骨具有广阔的临床应用前景。
具体实施方式
:
下面通过实施例进一步描述本发明，但本发明并不仅限于此。实施例1
组织工程骨修复材料的构建方法的制备 包括如下步骤:
1)种子细胞的培养:抽取骨髓，以全骨髓培养法分离培养骨髓基质干细胞，所用的培养基为含10%胎牛血清的DMEM培养基，细胞经传代增殖培养至第三代IO7数量级；
2)可注射性支架材料的制备:将壳聚糖与β-磷酸三钙按Iml:0.5g的比例于体外复合形成壳聚糖-β -磷酸三钙复合物；
3)种子细胞的处理:将培养至第三代IO7数量级的骨髓基质干细胞用0.3ml的DMEM混
匀；
4)种子细胞与壳聚糖-β-磷酸三钙的复合:壳聚糖-磷酸三钙复合8分钟后立即加入步骤(3)处理后的种子细胞，加入量比例为壳聚糖、β-磷酸三钙、DMEM按3ml: 1.5g:
0.3ml充分混匀，即获得所述的组织工程骨修复材料的构建方法。实施例2
MTT法分析BMSCs与壳聚糖-β -磷酸三钙复合材料复合培养后的成活和增殖能力接种细胞后，于第2、4、6、8天弃原培养基，加入无血清DMEMlml和MTT (5mg/mol) 10 μ 1，在37°C的CO2孵箱内孵育4小时，小心吸去MTT后，加入二甲基亚砜0.5ml振荡15分钟，酶标仪上选择波长570nm，测定光吸收值。随培养时间的延长，各组D570逐渐增加，到第8天最髙，壳聚糖-β -磷酸三钙组在各时间点与对照组均无显著性差异(> 0.05)(表I)。表I两组MTT法测定吸光度值
权利要求
1.一种组织工程骨修复材料的构建方法，包括如下步骤: 1)种子细胞的培养:抽取骨髓，以全骨髓培养法分离培养骨髓基质干细胞，所用的培养基为含10%胎牛血清的DMEM培养基，细胞经传代增殖培养至第三代IO7数量级； 2)可注射性支架材料的制备:将壳聚糖与β-磷酸三钙按Iml:0.5g的比例于体外复合形成壳聚糖-β -磷酸三钙复合物； 3)种子细胞的处理:将培养至第三代IO7数量级的骨髓基质干细胞用0.3ml的DMEM混匀； 4)种子细胞与壳聚糖-β-磷酸三钙的复合:壳聚糖-磷酸三钙复合8分钟后立即加入步骤(3)处理后的种子细胞，按比例加入壳聚糖、β-磷酸三钙、DMEM，充分混匀，即获得所述的组织工程骨修复材料的构建方法。
2.根据权利要求1所述的组织工程骨修复材料的构建方法，其特征在于:所述步骤(4)中壳聚糖、β -磷酸三钙、 DMEM的比例为3ml: 1.5g:0.3ml。
全文摘要
本发明公布了一种组织工程骨修复材料的构建方法，包括1)种子细胞的培养；2)可注射性支架材料的制备；3)种子细胞的处理；4)种子细胞与壳聚糖-β-磷酸三钙的复合等步骤。本发明骨修复材料为可注射性材料复合骨髓基质干细胞构成，可任意塑形且复合细胞简便，在一定时间内可完全降解吸收，诱导成骨效应明显，成本较低廉。
文档编号A61L27/38GK103157138SQ201110417699
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月14日 优先权日2011年12月14日
发明者孙叶芳 申请人:西安瑞捷生物科技有限公司