专利名称：组织工程化骨-软骨复合组织移植物及其制备方法
技术领域：
本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种组织工程化骨-软骨复合组织移植物及其 制备方法。
背景技术：
组织工程技术是将少量的自体细胞经体外培养扩增后种植到支架材料上，再在生物因 子的作用下构建与病损区形状、结构和生物学特性相似的细胞支架复合体，以修复和替代 受损的组织，它具有传统治疗方法所无法比拟的优势，被认为是再生医学下一个需要挑战 的制高点。
骨关节损伤修复和重建是临床长期难以解决的问题，尤其是关节处骨，软骨的联合损
伤的修复更是比较棘手。成熟的关节软骨自身修复能力有限，直径大于4mm的缺损一般 不能自行修复。而且关节处软骨损伤是往往伴有软骨下骨的联合损伤，而传统的治疗关节 骨软骨损伤的方法是自体、同种异体骨软骨柱移植、软骨清除、软骨下钻孔甚至关节假体 置换等等。这类方法取得了一定的成功，但也出现了诸如供区继发性受损、供体不足、免 疫排斥、疾病传播及金属假体松动、磨损等不足，并且长期疗效不理想，寻找构建骨软骨 复合组织的方法就成为现代许多骨科医生研究的热点。近几年随着组织工程学的飞速发展， 骨，软骨组织工程也得到了快速的发展。所以构建组织工程骨软骨复合组织就成了现代医 学和组织工程学共同研究的热点。
应用于组织工程化骨-软骨复合体构建的种子细胞中研究最热的是骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)，骨髓间充质干细胞具有易于获取、 对供区损伤小、能在体外迅速扩增并保持多相分化能力等优点，拥有同时修复两种组织的 潜力。支架材料要能模拟关节面的自然轮廓、机械性能、负荷功能性能。所构建的组织要 与宿主软骨、骨具有较好的的融合性，故支架材料要有良好的生物可相容性，合适的生物 可降解性，可精确控制的孔隙率和孔隙结构参数等。PLGA (poly-lactide-co-glycolide， 聚乙醇酸-乳酸共聚物)是乳酸和乙醇酸聚合而成，是目前国内外常用的支架材料，其结构 及亲水、疏水性可以通过两者的不同比例进行调节，从而决定支架材料在体内的降解速率， 它在体内降解的最终代谢产物为二氧化碳和水，不在体内蓄积，几乎没有毒副作用。由于组织工程骨-软骨在构建时对种子细胞和支架材料的种类、性能均有不同的要求， 早期学者们采用的方法是先分别构建组织工程化的骨和软骨，再用缝线缝合或粘胶粘贴的
方法将两者连成一体，如Schaefer等报道(D Schaefer, I Martin, G Jundt， et al. Tissue-engineered composites for the repair of large osteochondral defects. Arthritis Rheum， 2002; 46 (9) :2524-2534; DSchaefer, I. Martin, PShastri,etal, In vitro generation of osteochondral composites [J]. Biomaterials, 2000;21: 2599^2606.):在可生物降解的聚乙醇酸(PGA)等组成 的支架上培养软骨细胞生成组织工程软骨，再将它和组织工程化骨的类似物或软骨下支撑 物，如复合胶原的羟磷灰石、磷酸三钙、天然珊瑚等用缝线缝合起来构建成骨软骨复合体。 Mahmoudifar (Nastaran Mahmoudifar， Pauline M. Doran. Tissue engineering of human cartilage and osteochondral composites using recirculation bioreactors [J]. Biomaterials, 2005; 26(34): 7012-7024.)等将软骨细胞和成骨细胞在不同的PGA支架上培养，将形成组 织缝合起来，置入可循环的反应器中继续培养形成复合体。Kreklau等采用纤维蛋白胶将上 层种植有软骨细胞的多聚体和下层的天然珊瑚或人工合成的碳酸钙粘贴固定。依此类方法 构建的骨软骨复合体，其软骨部分质量较差，多为纤维软骨，透明软骨较少，同时，复合 体的一体化程度有赖于各部件的成熟度，无论体内或体外的实验，构建的骨软骨界面结合 均欠佳。为克服这些不足，人们又开始在单一双相支架上同时构建骨软骨复合体。Sherwood 等 (JK Sherwood, Sl_ Riley, RPalazzolo， etal. Athree-dimensional osteochondral composite scaffold for articular cartilage repair [J]. Biomaterials, 2002; 23(24): 4739-4751.)报道，使用TheriForm三维打印程序构建了一个异质骨软骨双相支架。支架上 层是软骨层，由聚丙交酯-聚乙交酯共聚物(D， L-PLGA) /聚乳酸成(L-PLA)构成，孔 径106 Mm -150 |jm，孔隙率90%;底层四叶状的骨部分孔径125 -150 |jm，孔隙率55%， 由L-PLGA/TCP (磷酸三!丐)构成。Schek R M等(RM Schek， JM Taboas, SJ Segvich， et al. Engineered osteochondral grafts using biphasic composite solid free-form fabricated scaffolds [J.Tissue Eng, 2004; 10: 1376-1385.)用联合影像辅助设计技术(Image-based design,旧D)和固体自由形成工艺(Solid free-form, SFF)构建了左旋聚丙交酯(PLLA) 和羟磷灰石(HA)的双相支架，并在多聚体相种植完全分化的软骨细胞，在陶瓷相种植转 导表达骨形态发生蛋白7 (BMP-7)腺病毒的成纤维细胞，再植入小鼠皮下培养.最后发现 同时有骨、软骨及牢固的矿化界面形成，并在羟磷灰石部分发现有血管及脂肪组织形成， 这类制备方法对支架的生产工艺要求较高
发明内容
针对临床上处理关节处骨、软骨联合损伤修复的方法有限，且传统的治疗效果均不甚 理想的现状，本发明提供组织工程化骨-软骨复合组织移植物，该移植物可用于异位构建组 织工程化骨-软骨复合组织，以更好的修复关节处的骨、软骨联合缺损。
本发明应用骨软骨组织工程的原理，通过将骨髓间充质干细胞体外扩增后种植在孔径
和孔隙率均不同且复合不同生长因子和不同胶原的的PLGA生物支架上制备得到组织工程
化骨-软骨复合组织移植物，将该移植物移植到受损组织处，能更好的修复关节处的骨软骨
联合缺损。PLGA复合I和II型胶原制作的生物材料可以增加细胞的粘附能力；复合上不
同的生长因子可使材料具有定向诱导能力。
本发明的的技术方案具体为是将种子细胞种植在支架材料上，在体外培养形成骨-软 骨复合组织移植物；
所述种子细胞为成骨干细胞；
所述支架材料包括成骨部分和成软骨部分，在支架材料的制备过程中，成骨部分用I 型胶原修饰并加入成骨细胞诱导因子，来构建成新型组织工程骨；而成软骨部分用n型胶 原修饰并添加成软骨细胞诱导因子。
为更好的实现本发明，发明人提供以下优选方案
所述成骨细胞诱导因子和成软骨细胞诱导因子是研成粉末混入胶原后再加入支架材料 的。成骨细胞诱导因子和成软骨细胞诱导因子的加入量可参考现有文献公开的数值确定。 所述成骨细胞诱导因子为任何已知的诱导干细胞向成骨细胞分化的生长因子，优选骨
开;态发生蛋白2 (BMP-2 ， bone morphogenetic protein-2)。
所述成软骨细胞诱导因子为为任何已知的诱导干细胞向成软骨细胞分化的生长因子， 优选碱性成纤维细胞生长因子(bFGF， basic fibroblast growth factor)和转化生长因子1 (TGF-P1 ， transforming growth factor-|31 )。
当优选使用BMP-2、 bFGF和TGF-P1的条件下，所述支架材料的制备过程包括将 支架材料的一部分放入溶解有bFGF和II型胶原的PBS溶液1中振荡混合后冷冻真空干 燥，再放入溶解有TGF-(31和n型胶原的PBS溶液2中振荡混合后冷冻真空干燥，制得成 软骨部分；将支架材料的另一部分放入溶解有BMP-2和II型胶原的PBS溶液3中振荡混 合后冷冻真空干燥，制得成骨部分；然后将成骨部分与成软骨部分用生物胶粘结起来。
所述PBS溶液1中，II型胶原的浓度为1-3mg/ml，有碱性成纤维细胞生长因子的浓 度为1-3yg/ml;所述PBS溶液2中，II型胶原的浓度为1-3mg/ml，转化生长因子1的浓 度为1-3jjg/ml;所述PBS溶液3中，I型胶原的浓度为1-3mg/ml，骨形态发生蛋白2的浓度为1-3mg/ml。
所述成骨干细胞优选骨髓间充质干细胞。
所述支架材料可以为组织工程学领域常用的可降解材料，优选聚乙醇酸-乳酸共聚物。
所述支架材料的成骨部分的孔径优选50|jm 200|jm、空隙率优选85%-95%;所述 支架材料的成软骨部分的孔径优选50pm 200|jm、空隙率优选85%-95%。
本发明还提供了利用上述方法得到的组织工程化骨-软骨复合组织移植物，可用于体内 移植以修复相关的骨-软骨组织损伤。
相对于现有技术，本发明的具有如下的有益效果
本发明的移植物在移植后，成功地将BMSCs诱导成为了骨细胞及软骨细胞，体内诱导 后并有骨组织和软骨组织形成。本发明的移植物中的胶原同时起到了细胞因子控释载体作 用，且由于成骨及成软骨是研成粉末混入胶原后再加入该移植物的，在体内降解并发生促 进成骨和成软骨的作用之前有一个缓慢溶解的过程，从而达到了控制释放成骨诱导因子和 成软骨诱导因子的目的。
图1是本发明骨-软骨复合组织移植物移植动物体内3个月形成骨软骨复合体的大体观察。 图2是本发明骨-软骨复合组织移植物移植动物体内3个月形成骨软骨复合体的HE染色结 果。
图3是本发明骨-软骨复合组织移植物移植动物体内3个月形成骨软骨复合体软骨区甲苯胺 蓝染色结果。
图4是本发明骨-软骨复合组织移植物移植动物体内3个月形成骨软骨复合体成骨区ALP染 色结果。
图5是本发明骨-软骨复合组织移植物移植动物体内3个月形成骨软骨复合体成骨区扫描电 镜结果。
图6是本发明骨-软骨复合组织移植物移植动物体内3个月形成骨软骨复合体软骨区透视电 镜结果。
具体实施例方式
下面结合实施例，对本发明做进一步地详细说明，但本发明的实现方式并不局限于此。 实施例1
1、 BMSCs的体外培养
1月龄SD大鼠，脱颈处死，取双侧股骨，剔净软组织，75c/。酒精浸泡消毒5min， PBS洗2次，剪断股骨一端后，用带5号针头的注射器将体积分数为10%胎牛血清的DMEM (含100U/m 1青霉素、100[jg/m 1链霉素和20U/m 1肝素)冲洗股骨骨髓腔，取混合 骨髓液4 ml缓慢注入事先准备好的含6 ml的淋巴细胞分离液的离心管内，800 G离心20 min，取出中间层的单核细胞接种于25 0112培养瓶，37°C、 5% C02培养箱静置培养。5d 后首次换液，以后每隔3d换液，长满后传代，取第3代细胞进行实验。
2、 复合不同胶原和不同生长因子的PLGA制备合成
70: 25的PLGA溶解于二氧六环匀速搅拌3 h ，溶液浇铸平皿上，-2(TC放置过夜，放 入质量比为30: 70的酒精溶液中-20。C萃取8 h，连续3次，将结块样品放入真空机冷冻 干燥。制备成10mmx10mmx5mm大小的样品，70: 25的PLGA溶解于二氧六环匀速搅 拌3h，溶液浇铸平皿上，-2(TC放置过夜，放入质量比为30: 70的酒精溶液中-2(TC萃 取8 h，连续3次，将结块样品放入真空机冷冻干燥。制备成10mmxl0mmx5 mm大小的 样品，将上述得到的样品10个放入溶解10Mg的bFGF、 5mglI型胶原的5mlPBS溶液 中振荡混合1 h后冷冻真空干燥，在放入溶解10 yg的TGF-P1 ， 5 mg II型胶原的5 ml PBS 溶液中振荡混合1 h冷冻真空干燥；另放10个样品入含溶解5 mg的BMP-2、 5 mg I型 胶原的5 ml PBS溶液中振荡混合1 h后冷冻真空机干燥。将以上得到的含不同胶原和不同 生长因子的PLGA用生物胶粘合在一起，利用公知质量法测定其孔隙率，支架材料的成骨 部分的孔径选取80iJm、空隙率选取85%;支架材料的成软骨部分的孔径选取10(Hjm、空 隙率选取90%。
3、 BMSCs与复合不同胶原和不同生长因子的PLGA复合
取P3代细胞，调整浓度为106个细胞/1711。已制作好复合生物支架材料经6QC0消毒后 用无菌DMEM培养基反复冲洗，培养箱内晾干，把PLGA放置于24孔板的孔底，滴加100pl 的细胞悬液，培养3h后翻转，再在另一面滴加100jjl细胞悬液培养3h，即得到本发明骨-软骨复合组织移植物。
实施例2
作为另一个优选实施例，本是实施例与实施例1的不同在于 PLGA制备合成步骤中，PBS溶液1中，bFGF的浓度为1|jg/ml ; PBS溶液2中，
TGF-(31的浓度为1|jg/ml ; PBS溶液3中BMP-2的浓度为1Mg/ml 。
支架材料的成骨部分的孔径选取50Mm、空隙率选取85%;支架材料的成软骨部分的
孔径选取20(Hjm、空隙率选取95%。实施例3
作为另一个优选实施例，本是实施例与实施例1的不同在于
PLGA制备合成歩骤中，PBS溶液1中，bFGF的浓度为3Mg/ml ; PBS溶液2中， TGF-卩1的浓度为3pg/ml ; PBS溶液3中BMP-2的浓度为3pg/ml 。
支架材料的成骨部分的孔径选取8(Hjm、空隙率选取88%;支架材料的成软骨部分的
孔径选取18(Hjm、空隙率选取92%。 实验结果分析
以上三个实施例得到的骨-软骨复合组织移植物植入SD大鼠臀部肌袋内(臀大肌内)，
均得到在体内正常生长的复合组织(如图1所示)，现以实施例1为例，做具体说明本发
明所得骨-软骨复合组织移植物的构建过程及其移植至体内的效果。
实施例1在PLGA支架不同部位制备过程中分别添加已研成粉末状的BMP-2、 bFGF和
TGF-^等生长因子，制备成每块PLGA的一部分用I型胶原修饰并加入成骨细胞诱导因子 BMP-2，来构建成新型组织工程骨；而PLGA的另一部分用II型胶原修饰并加入成软骨细 胞诱导因子bFGF和TGF-Po来构建组织工程软骨组织。BMSCs与复合不同胶原和不 同生长因子的PLGA支架复合后形成骨-软骨复合组织移植物，植入SD大鼠股部肌袋内3个 月后取出，组织块呈现白色，表面光滑而有光泽，触之有弹性，与正常关节处的骨软骨复 合组织的形态很相似(图1)。复合组织块切片后HE染色，发现PLGA己降解成网状，成骨 部分和成软骨部分分别可见大量呈梭形的干细胞，已可见许多圆形，椭圆形等多边形的成 骨细胞和成软骨细胞生入PLGA孔隙内，并可见少量多核的破骨细胞，许多骨基质和软骨基 质形成(见图2)。复合组织软骨区甲苯胺蓝染色可见大量圆形或椭圆形的形状规则的细胞 着色，有些细胞含2个核仁，并见软骨陷凹，细胞核外有许多类软骨基质样物质，生成少量 类成熟的编织软骨，甲苯胺蓝染色强阳性(见图3);复合组织成成骨区ALP染色，显微镜 下见视野内大片黑色着色区，局部已呈黑团，成骨区已完全形成为成熟的骨组织，见大量 骨细胞外基质(见图4)。复合组织成骨区扫描电镜可见少量梭形的干细胞样细胞存在，并 见在梭形细胞周围中有许多细胞较大的圆形、方形等多边形的细胞存在，似成骨细胞，大 量多边形细胞聚集在一起，在大量的多边行细胞中间可见少量的多核的较大的细胞存在， 似破骨细胞(见图5);复合组织成软骨区透视电镜观察，可见少量梭形细胞，在梭形细胞 的周围可见许多细胞的细胞核分化为椭圆形和圆星，边缘较规则，似软骨细胞，可见细胞 浆内大量的线粒体和内织网，并见大量胶原分泌(见图6)。
通过对实验组骨软骨复合组织各时相标本横切面和纵切面的组织学切片，各种染色及电镜观察，自体BMSCs与BMP-2作用后分化为成骨细胞，与bFGF, TGF-p，作用后分化 为软骨细胞。BMP-2、 bFGF和TGF-(^等生长因子在BMSCs分化形成骨和软骨组织中起
了重要的诱导作用。综上所述，实验组骨软骨复合组织的成骨质量和成软骨质量是非常明 显的，显著高于对照组和空白组。因此可证明，以BMSCs作为组织工程骨和软骨的种子 细胞；以胶原作为BMP-2、 bFGF和TGF-p!的载体；以BMP-2、 bFGF和TGF-卩，作为组
织工程骨和软骨的诱导因子；以PLGA作为组织工程骨和软骨的支架，利用将几者有机地 复合在一起构建得到的骨-软骨移植物来构建新型组织工程骨软骨复合组织是可行的。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限 制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1、一种组织工程化骨-软骨复合组织移植物的制备方法，其特征在于是将种子细胞种植在支架材料上，在体外培养形成骨-软骨复合组织移植物；所述种子细胞为成骨干细胞；所述支架材料包括成骨部分和成软骨部分，在支架材料的制备过程中，成骨部分用I型胶原修饰并加入成骨细胞诱导因子，来构建成新型组织工程骨；而成软骨部分用II型胶原修饰并添加成软骨细胞诱导因子。
2、 根据权利要求1所述的组织工程化骨-软骨复合组织移植物的制备方法，其特征在于 所述成骨细胞诱导因子和成软骨细胞诱导因子是研成粉末混入胶原后再加入支架材料的。
3、 根据权利要求1或2任一项所述的组织工程化骨-软骨复合组织移植物的制备方法， 其特征在于所述成骨细胞诱导因子是骨形态发生蛋白2，所述成软骨细胞诱导因子为碱性 成纤维细胞生长因子和转化生长因子1。
4、 根据权利要求3所述的组织工程化骨-软骨复合组织移植物的制备方法，其特征在于所述支架材料的制备过程包括将支架材料的一部分放入溶解有碱性成纤维细胞生长因了和II型胶原的PBS溶液1中振荡混合后冷冻真空干燥，再放入溶解有转化生长因子1和II型胶原的PBS溶液2中振荡混合后冷冻真空千燥，制得成软骨部分；将支架材料的另一部分放入溶解有骨形态发生蛋白2和II型胶原的PBS溶液3中振荡混合后冷冻真空干燥，制得成骨部 分；然后将成骨部分与成软骨部分用生物胶粘结起来。
5、 根据权利要求4所述的组织工程化骨-软骨复合组织移植物的制备方法，其特征在于 所述PBS溶液1中，II型胶原的浓度为1-3mg/ml，有碱性成纤维细胞生长因子的浓度为 1-3pg/ml;所述PBS溶液2中，II型胶原的浓度为1-3mg/ml，转化生长因子1的浓度为 1-3|jg/ml;所述PBS溶液3中，I型胶原的浓度为1-3mg/ml，骨形态发生蛋白2的浓度为 1隱3mg/mL
6、 根据权利要求1所述的组织工程化骨-软骨复合组织移植物的制备方法，其特征在于 所述成骨十细胞为骨髓间充质干细胞。
7、 根据权利要求1所述的组织工程化骨-软骨复合组织移植物的制备方法，其特征在于 所述支架材料是聚乙醇酸-乳酸共聚物。
8、 根据权利要求1所述的组织工程化骨-软骨复合组织移植物的制备方法，其特征在于所述支架材料的成骨部分的孔径优选50(jm 200pm、空隙率优选85%-95%;所述支架材料的成软骨部分的孔径优选50|jm 200|jm、空隙率优选85%-95%。
9、权利要求1-8任一项所述的方法得到组织工程化骨-软骨复合组织移植物。
全文摘要
本发明提供了一种组织工程化骨-软骨复合组织移植物及其制备方法，属于组织工程学领域。该方法是将种子细胞种植在支架材料上，在体外稍作培养形成组织工程化骨-软骨复合组织移植物；所述种子细胞为成骨干细胞；所述支架材料包括成骨部分和成软骨部分，在制备过程中，成骨部分添加成骨细胞诱导因子，并用I型胶原修饰；成软骨部分添加成软骨细胞诱导因子，并用用II型胶原修饰。本方法得到的移植物移植到体内后成功地将骨髓间充质干细胞诱导成为了骨细胞及软骨细胞，并有骨组织和软骨组织形成，利用本发明的移植物来构建的组组织工程骨软骨复合组织取得了满意的效果。
文档编号A61L27/38GK101439204SQ20081022053
公开日2009年5月27日 申请日期2008年12月29日 优先权日2008年12月29日
发明者昊 吴, 林宏生, 查振刚 申请人:暨南大学