专利名称：一种用于骨组织工程的支架材料及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种组织工程支架材料及其制备方法，特别是一种猪皮胶原蛋白一羟基磷灰 石骨组织工程用天然支架材料及其制备方法，属组织工程领域。
背景技术：
由于交通事故，建筑事故及其它外伤原因引起的骨或软骨组织的缺损经常会发生，给病 人及其家庭的日常生活带来诸多不便。目前数以百万的人遭受着骨缺损带来的痛苦。据报导， 仅在美国每年就有超过450，000例骨移植手术和约250,000例膝盖关节手术(C.T. Laurencin et al.， Clin. Orthop. Relat. Res. 447 (2006) 221—236. E.B. Hunziker et al" Osteoarthr. Cartil. 10
(2002)432~463.)。目前，临床工作中常采用骨移植进行修复。但是，这些用做骨移植的材料 没有足够的成骨诱导性，不能对来自于周围环境中的骨细胞及骨间充质干细胞进行重建。由 于这些方面的缺陷，这些材料不能完全满足临床骨修复的要求。
过去的十几年里，国内外科学家根据天然骨化学组成，力图在体外建立起骨的多孔支架 结构，制备出了与人体骨成分十分相似的纳米羟基磷灰石一胶原蛋白复合支架材料。但是过 去他们应用的胶原蛋白支架大部分是从牛、马的肌腱中提取出来的，提取工艺中首先需要将 动物组织中的胶原溶解，然后通过用戊二醛等交联剂交联的办法重建胶原支架结构。这种方 法得到的支架不仅价格昂贵，而且破坏了胶原束间的天然结构，很难达到骨替代材料力学和 生物学性能的要求。同时，通过各种手段使胶原溶解过程中，其"末端肽"很可能受到破坏， 从而使胶原对组织产生高的抗原性，影响成骨细胞生长。
发明内容
针对以上胶原蛋白一羟基磷灰石材料的缺点，本发明的目的是提出一种利用猪皮胶原蛋 白本身三维网络结构制备猪皮胶原蛋白一羟基磷灰石骨组织工程支架骨修复材料。目的是利 用已经纯化的猪皮胶原蛋白的三维网络结构，与羟基磷灰石复合，形成猪皮胶原一羟基磷灰 石支架材料。本发明提供了一种制作简单，制备过程绿色环保，成本低廉且具有三维网络结 构的支架材料。
本发明提供一种用于骨组织工程的支架材料，由I型猪皮胶原蛋白和羟基磷灰石构成； 其特征在于，I型猪皮胶原蛋白为支架结构，在I型猪皮胶原蛋白三维网络结构的纤维束表 面，复合一层羟基磷灰石。
优选的，I型猪皮胶原蛋白为新鲜猪皮经脱细胞和脂肪后得到的保持夭然结构和性能的 胶原蛋白。所述复合一层羟基磷灰石，是在其胶原纤维束表面沉积矿化纳米羟基磷灰石晶体 而得到的一种具有一定强度和韧性的支架材料。
猪皮胶原蛋白一羟基磷灰石骨组织工程复合支架材料具有三维多级孔的结构特点，其特征在于，I型猪皮胶原支架，形成两种尺寸的孔，分别集中在80 120 [im和200~300nm。 本发明还提供所述的用于骨组织工程的支架材料的制备方法，包括下述步骤.-
1) 提取的纯度超过96%的猪皮胶原蛋白切成胶原支架；
2) 将步骤1)的胶原支架浸泡在pH=8.8的缓冲液中，放在37'C摇床中使其充分溶胀 24小时，取出用去离子水冲洗3次，每次20分钟；然后用滤纸擦干表面水分，放入液氮中 迅速冷冻2小时，一8(TC进行真空冷冻干燥8小时，得到充分膨胀后的胶原支架；
3) 配制不同浓度钙离子和磷酸根离子的矿化液，将步骤(2)中预处理后的胶原支架放 在矿化液中进行矿化反应。
4) 冷冻，干燥处理后得到本发明的猪皮胶原蛋白一羟基磷灰石骨组织工程用复合支架材
料；
5) 将冷冻干燥后得到的支架通过Co60放射消毒后，放入聚乙烯密封带中密封好，放入 干燥器中常温保存。
优选的，步骤l)所述的提取方法，是采用中国专利031390633所述的方法。
优选的，步骤l)中切成长宽高=1: 1: 0. 2的胶原支架；更优选的，切成长X宽
X高二lcmxlcmx0.2cm的胶原支架。
优选的，步骤2)所述的缓冲液为pH=8.8的Tris缓冲液，其制备方法为，在800ml水中 溶解121.lg Tris碱，加入浓HC1调节pH值至8.8，继续加水至1升。
优选的，步骤3)所述的钙离子和磷酸根离子的矿化液为0.25M的CaCl2溶液和0.25M
的(NH4)2HP04溶液各1L;步骤3)所述的在矿化液中进行矿化反应为将步骤(2)中得到
的胶原支架浸泡在25ml CaCl2溶液中，并在37'C摇床中以120转/分的速度摇动2小时， 取出用去离子水清洗3次，每次20分钟。再将其浸泡在25ml的(NH4)2HP04溶液中，并在 37'C摇床中以120转/分的速度摇动2小时，取出用去离子水清洗3次，每次20分钟；重 复该步骤10次。
优选的，步骤3)所述的钙离子和磷酸根离子的矿化液为在37r下，配制标准模拟体 液lL，用pH二8.8的Tris缓冲液和0. 1M HC1调其pH=7. 4;所述标准模拟体液中含Na+142. 0 mM， K+ 5. 0 mM， Mg2+ 1. 5 mM， Ca2+ 2. 5 raM, C1— 148. 8 mM, HC03— 4. 2 mM， HP043_ 1. 0 mM， SO/— 0. 5mM; 步骤3)所述的在矿化液中进行矿化反应为将步骤(2)中得到的胶原支架浸泡在1L上述 标准模拟体液中，并在37'C摇床中矿化沉积6天，得到充分矿化的支架材料。
优选的，步骤3)所述的配制钙离子和磷酸根离子的矿化液为配制9mM的CaCl2溶 液和4.2mM的(NH4)2HP04溶液，将它们按1: 1的体积比混合。在37°C，用pH=8.8的Tris 缓冲液和0.1M的HCL调其pH=7.4;步骤3)所述的在矿化液中进行矿化反应为将步骤(2) 中得到的胶原支架浸泡在1L上述溶液中，并在37'C摇床中矿化沉积6天，得到充分矿化的 支架材料；将得到的充分矿化的支架材料，用去离子水清洗3次，每次30分钟，用滤纸擦 干表面水分，在液氮中迅速冷冻2小时，一50'C进行冷冻干燥8小时，得到猪皮胶原蛋白一 羟基磷灰石骨组织工程用复合支架材料。优选的，步骤4)中，在液氮中迅速冷冻2小时，一50'C进行冷冻干燥8小时。 本发明克服已有胶原一羟基磷灰石支架材料的技术缺陷，通过保持猪皮胶原支架的天然 结构，在温和的生物矿化反应中将羟基磷灰石矿化沉积到支架中，构建具有规则空间结构的 猪皮胶原一羟基磷灰石天然支架(图1)。
在这种天然支架材料中，我们将获得的猪皮胶原分别浸泡在氯化钙和磷酸氢二氨的不饱 和溶液中或模拟体液(SBF)中，使羟基磷灰石在支架中矿化成核生长，制备出纳米羟基磷 灰石位于胶原纤维间或表面的骨替代支架材料，使其保存天然的空间多孔结构，同时也增加 了骨修复材料的强度和韧性；天然的胶原支架结构提高了整体的骨诱导能力，增加了其生物 相容性。从而制备出具有较高强度，规则空间结构，适当空隙率，且生物相容性好的骨替代 天然支架材料。
这种骨组织工程用复合支架材料具有大量连通的80 12(Vm的微孔存在，且孔隙率达到 50 80%，有利于细胞及其代谢产物在支架内部的出入，有利于细胞的粘附生长；其保持的 天然三维空间网状结构，具有较大的强度和良好的韧性；其天然胶原纤维结构具有低的抗原 性，有利于细胞的存活，进而使材料整体有更优异的生物学性能；沉积在胶原支架中的羟基 磷灰石为弱结晶相(图2),而且HA均匀分布在胶原支架中，这有利于支架材料在体液环 境中均匀降解，也有利于新骨的形成。
本发明的猪皮胶原蛋白一羟基磷灰石骨组织工程复合支架材料具有良好的机械性能和 生物相容性，而且制作简单，制备过程绿色环保，成本低廉且具有三维网络结构的支架材料。
图1是羟基磷灰石矿化沉积后的胶原蛋白支架的SEM。图2是经羟基磷灰石矿化沉积 后的胶原支架的XRD分析，横坐标为2 6°。
具体实施例方式
实施例1:
将提取的纯度高达96%的猪皮胶原蛋白用不锈钢刀片切成长宽高二lcmxlcmx0.2cm 的块体支架。将支架浸泡在pH=8.8的Tris缓冲液(制备方法为，在25'C，在800ml水中溶 解121.1gTris碱，加入浓HCL调节pH值至8.8，继续加水至1升)中，放在37'C摇床中使 其充分溶胀24小时，取出用去离子水冲洗3次，每次20分钟。将块体胶原蛋白取出，用滤 纸擦去表面水分，放到液氮提筒中迅速冷冻2小时，一8(TC进行冷冻干燥8小时，得到充分 膨胀后的纯胶原支架A。分别配制0.25M的CaCl2溶液B和0.25M的,4)2^^04溶液C各 1L。将A浸泡在25ml B溶液中，并在37'C摇床中以120转/分的速度摇动2小时，取出用 去离子水清洗3次，每次20分钟。再将其浸泡在25ml C溶液中，并在37'C摇床中以120 转/分的速度摇动2小时，取出用去离子水清洗3次，每次20分钟。重复上述在B、 C溶液 中的浸泡过程10次，使羟基磷灰石在胶原支架A中充分矿化生长。取出矿化后的胶原支架， 用去离子水清洗3次，每次30分钟，用滤纸擦干表面水分，在液氮中迅速冷冻2小时，_ 5(TC进行冷冻干燥8小时，得到猪皮胶原一羟基磷灰石骨组织工程复合支架材料。其XRD图如图2所示，羟基磷灰石在纤维束表面均匀沉积，平均粒径为80 200nm。孔径分布集中 在50 —100 li m和100 — 200nm。
将冷冻干燥后得到的支架通过Co60放射消毒后，放入聚乙烯密封带中密封好，放入干 燥器中常温保存。
实施例2:
将提取的纯度高达96%的猪皮胶原蛋白用不锈钢刀片切成长宽高二lcmxlcmx0.2cm 的块体支架。将支架浸泡在pI^8.8的Tris缓冲液中，放在37'C摇床中使其充分溶胀24小 时，取出用去离子水冲洗3次，每次20分钟。将块体胶原蛋白取出，用滤纸擦去表面水分， 放到液氮提筒中迅速冷冻2小时，一8(TC进行冷冻干燥8小时，得到充分膨胀后的纯胶原支 架。在37。C下，配制标准模拟体液(其中Na+142,0,K+5.0，Mg2+1.5,Ca2+2.5,Cr 148.8,HC03-4.2，HP043- 1.0, SO, 0.5 (mM)) 1L，用pH = 8.8的Tris缓冲液和0.1M的HC1调其pH=7.4, 将胶原蛋白支架浸入模拟体液中，并在37'C摇床中以120转/分的速度摇动6天(每两天换 一次矿化液)，取出矿化后的胶原一羟基磷灰石支架，用去离子水清洗3次，每次30分钟， 用滤纸擦干表面水分。在液氮中迅速冷冻2小时，一5(TC进行冷冻干燥8小时，得到猪皮胶 原一羟基磷灰石骨组织工程复合支架材料。孔径分布集中在50—100um和100 — 200nm。
将冷冻干燥后得到的支架通过Co60放射消毒后，放入聚乙烯密封带中密封好，放入干 燥器中常温保存。 实施例3:
将提取的纯度高达96%的猪皮胶原蛋白用不锈钢刀片切成长宽高二lcmxlcmx0.2cm 的块体支架。将支架浸泡在pH=8.8的Tris缓冲液中，放在37'C摇床中使其充分溶胀24小 时，取出用去离子水冲洗3次，每次20分钟。将块体胶原蛋白取出，用滤纸擦去表面水分， 放到液氮提筒中迅速冷冻2小时，一8(TC进行冷冻干燥80小时，得到充分膨胀后的纯胶原 支架A。分别配制9mM的CaCl2溶液B和4.2mM的(NH4)2HP04溶液C，将B和C按1: 1 的体积比混合。在37°C ，用pH=8.8的Tris缓冲液和0.1M的HCL调其pH=7.4。将A浸泡 在B和C的混合溶液中，并在37'C摇床中以120转/分的速度摇动6天(每两天换一次矿化 液)，取出用去离子水清洗3次，每次30分钟，用滤纸擦除表面水分，在液氮中迅速冷冻2 小时，一5(TC进行冷冻干燥8小时，得到猪皮胶原一羟基磷灰石骨组织工程复合支架材料。 孔径分布集中在50—100y m和100—200nm。
将冷冻干燥后得到的支架通过Co60放射消毒后，放入聚乙烯密封带中密封好，放入干 燥器中常温保存。
权利要求
1. 一种用于骨组织工程的支架材料，由I型猪皮胶原蛋白和羟基磷灰石构成；其特征在于，以I型猪皮胶原蛋白为支架结构，在I型猪皮胶原蛋白三维网络结构的纤维束表面，复合一层羟基磷灰石。
2. 如权利要求1所述的用于骨组织工程的支架材料，其特征在于，I型猪皮胶原蛋白 为新鲜猪皮经脱细胞和脂肪后得到的保持天然结构和性能的胶原蛋白；所述复合一层羟基磷 灰石，是在其胶原纤维束表面沉积矿化纳米羟基磷灰石晶体而得到的一种具有一定强度和韧 性的支架材料。
3. 根据权利要求1所述的一种用于骨组织工程的支架材料，其特征在于，具有空间三 维多级孔的结构特点，I型猪皮胶原支架，形成两种尺寸的孔，分别集中在80 120,和 200~300nm。
4. 如权利要求1至3任一项所述的一种用于骨组织工程的支架材料的制备方法，包括 下述步骤1) 提取的纯度超过96%的猪皮胶原蛋白切成胶原支架；2) 将步骤1)的块体胶原浸泡在pH=8.8的缓冲液中，放在37'C摇床中使其充分溶胀24 小时，取出用去离子水冲洗3次，每次20分钟；然后用滤纸擦千表面水分，放入液 氮中迅速冷冻2小时，一8(TC进行真空冷冻干燥8小时，得到充分膨胀后的胶原支架；3) 配制不同浓度钙离子和磷酸根离子的矿化液，将步骤2)中预处理后的胶原支架放在 矿化液中进行矿化反应；4) 冷冻，干燥处理后得到本发明的猪皮胶原蛋白一羟基磷灰石骨组织工程用复合支架 材料；5) 将冷冻干燥后得到的支架通过Co60放射消毒后，放入聚乙烯密封带中密封好，放入 干燥器中常温保存。
5. 如权利要求4所述的一种用于骨组织工程的支架材料的制备方法，其特征在于，步 骤2)所述的缓冲液为pH=8.8Tris缓冲液，其制备方法为，在25°C，在800ml水中溶解121.lg Tris碱，加入浓HCL调节pH值至8.8，继续加水至1升。
6. 如权利要求4所述的一种用于骨组织工程的支架材料的制备方法，其特征在于，歩 骤3)所述的钙离子和磷酸根离子的矿化液为0.25M的CaCl2溶液和0.25M的(NH4)2HP04 溶液各1L;步骤3)所述的在矿化液中进行矿化反应为将步骤(2)中得到的胶原支架浸 泡在25ml步骤(3) CaCb溶液中，并在37"摇床中以120转/分的速度摇动2小时，取出 用去离子水清洗3次，每次20分钟。再将其浸泡在25ml步骤(3) (NH4)2HP04溶液中，并 在37。C摇床中以120转/分的速度摇动2小时，取出用去离子水清洗3次，每次20分钟； 重复该步骤10次。
7. 如权利要求4所述的一种用于骨组织工程的支架材料的其制备方法，其特征在于，歩骤3)所述的配制钙离子和磷酸根离子的矿化液为在37'C下，配制标准模拟体液1L， 用pH二8. 8的Tris缓冲液和0. 1M HC1调其pH=7. 4;所述标准模拟体液中含Na+142. 0 mM， K+ 5. 0 mM' Mg2+ 1.5 mM, Ca2+ 2. 5 mM' CI— 148. 8 mM， HC0:「 4. 2 mM， HP04!— 1. 0 mM， SO/— 0. 5mM;步 骤3)所述的在矿化液中进行矿化反应为将胶原支架浸泡在1L上述标准模拟体液中，并 在37'C摇床中矿化沉积6天，得到充分矿化的支架材料。
8. 如权利要求4所述的一种用于骨组织工程的支架材料的制备方法，其特征在于，步 骤3)所述的配制钙离子和磷酸根离子的矿化液为配制9mM的CaCh溶液和4.2mM的 (NH4)2HP(V溶液，将它们按h 1的体积比混合；在37t:，用pH-8.8的Tris缓冲液和0.1M 的HCL调其pH=7.4;步骤3)所述的在矿化液中进行矿化反应为将胶原支架浸泡在1L上 述溶液中，并在37'C摇床中矿化沉积6天，得到充分矿化的支架材料；将得到的充分矿化 的支架材料，用去离子水清洗3次，每次30分钟。
9. 如权利要求4所述的一种用于骨组织工程的支架材料的制备方法，其特征在于，步 骤4)中，在液氮中迅速冷冻2小时，一5(TC进行冷冻干燥8小时。
全文摘要
本发明涉及一种用于骨组织工程的支架材料及其制备方法。首先通过成熟的提取工艺从新鲜小猪皮中提取I型胶原蛋白支架。然后将该支架在pH＝8.8的Tris缓冲液中进一步溶胀，通过冷冻干燥处理得到天然的多孔胶原支架。将该支架分别在CaCl<sub>2</sub>和(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>的溶液中反复矿化或在模拟体液中长时间矿化，使弱结晶的HA均匀沉积到胶原支架中，再通过冷冻干燥处理得到猪皮胶原蛋白—羟基磷灰石骨替代天然支架材料。该发明不仅保存了胶原蛋白在生物体内的天然支架结构，而且原料成本低，设备简单，周期短，易于操作。得到的猪皮胶原蛋白—羟基磷灰石骨组织工程用复合支架材料具有强度高，韧性大，无抗原性，且具有更高的生物活性和控制降解释放的特点。
文档编号A61L27/24GK101417145SQ200810237969
公开日2009年4月29日 申请日期2008年12月4日 优先权日2008年12月4日
发明者娜 任, 宏 刘, 铎 刘, 王冠聪, 王继扬, 蒋民华, 赵洪石, 陶绪堂 申请人:山东大学