一种用于组织工程的三维复合多孔支架及其制备方法与流程

本发明属于组织工程的技术领域，涉及一种用于组织工程的三维复合支架及其制备方法，尤其涉及力学框架复合天然高分子及其衍生物复合支架的制备方法。

背景技术：

组织工程三大要素之一支架材料起到细胞外基质作用。支架必须满足良好的生物相容性、一定的孔隙率和良好的力学支撑。

支架的制备方法有相分离法、气体发泡法、粒子沥滤法等传统方法和快速成型技术。相分离法是在一个多组分均相系统里，通过分离以聚合物为连续相和以溶剂为分散相。经过冷冻干燥得到多孔支架。相分离的工艺较为复杂，不能得到孔径精确控制支架。气体发泡发是浸泡在高压二氧化碳的片状聚合物降压到常态，使得气泡增大成核，在聚合物内部形成多孔结构。虽然二氧化碳气体发泡法避免了使用有机溶剂，但也难以精确控制支架的形状和空隙，孔尺寸。颗粒沥滤法是聚合物溶解后加入糖、氯化钠等造孔剂搅拌均匀，然后放入模具成型至溶剂挥发，用去离子水除去造孔剂烘干形成多孔支架。这种方法除有溶剂残留和无法精确控制空隙率外，还有可能导致闭孔、连通性差等问题。3d打印方法可以克服传统支架制备方法的不足，如孔连通性不好、孔隙率无法控制、孔尺寸大小等问题。

支架材料可以为合成材料也可以为天然材料。但是合成材料由于缺乏能够与细胞相互作用的识别位点，其生物活性也有待进一步提高。天然材料具有良好的生物相容性和可降解性，天然材料成分接近细胞外基质成分，为细胞的粘附和增殖提供了更加理想的材料环境，且材料降解之后有可能为细胞提供合成蛋白的营养成分，如胶原和纤维蛋白等，或提供碳水化合物等成分，如海藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖和透明质酸等。天然生物材料虽具有良好的生物相容性，但其机械强度差和降解速率不可控，在实际应用中受到一定程度的局限。

将天然材料的生物活性与可降解合成材料良好的力学特性结合起来，充分利用两者的优势，制备出复合支架能够为未来应用提供性能更加优良的材料支架。由于合成可降解材料与天然材料相互之间的不相容性，以及天然材料的温度敏感特性，很难用传统的材料成型加工工艺将二者进行复合。而采用表面改性的方法，可以将天然生物材料在合成材料表面进行接枝修饰，但采用表面修饰的方法，天然材料的复合量较少，降解后期生物活性将受到一定程度的影响。

采用本发明的复合方法，分别利用天然材料以及合成材料的传统成型方法，进行同一复合支架的制备，使得复合支架既具有合成材料力学性能突出的优势，又具有天然材料生物活性优良的特点，其相应的孔径孔隙率可以分别对成型方法工艺的调控进行综合控制，从而使得复合支架具有良好的力学性能及生物学性能，以及适于组织再生的孔径与孔隙率。

技术实现要素：

为了克服现有技术的缺点和不足，本发明的目的在于提供了一种用于组织工程的三维复合多孔支架的制备方法。本发明能够将力学性能优异的材料和良好生物活性的材料进行复合，使得复合后的材料具有良好的力学性能及生物活性，可用于组织工程研究。

本发明的另一目的在于提供由上述制备方法得到的用于组织工程的三维复合多孔支架。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种用于组织工程的三维复合多孔支架的制备方法，包括以下步骤：

(1)将高分子材料或高分子材料与无机粉体的混合物按照所需的结构进行三维打印，得到具有孔隙的框架即支架；所述高分子材料为聚乳酸、聚乙醇酸、聚己内酯或聚氨酯中的一种以上；

(2)将天然材料溶液或天然材料与无机粉体的混合溶液进行抽真空处理，然后灌注入步骤(1)的支架的孔隙中，得到支架与混合溶液的混合物；所述天然材料为天然高分子和/或天然高分子衍生物；

(3)将步骤(2)的混合物进行冷冻干燥，得到三维复合多孔支架；

(4)或者将步骤(2)的混合物进行冷冻干燥和交联处理，得到三维复合多孔支架；所述交联处理是指在冷冻干燥前或冷冻干燥后将混合物进行交联处理，交联处理的方式为采用交联剂进行交联或真空热交联；当采用交联剂进行交联时，交联后需除杂，冷冻干燥。

步骤(1)中所述高分子材料的数均分子量为30000～100000。

步骤(1)中所述无机粉体为羟基磷灰石或磷酸三钙中一种以上。

步骤(1)中所述无机粉体的粒径为20～100nm。

步骤(1)中所述高分子材料与无机粉体的重量比为(3～9):1。

步骤(2)中所述天然高分子为胶原、透明质酸、壳聚糖或海藻酸钠中一种以上；所述天然高分子衍生物是指上述所述天然高分的衍生物，如：接枝多肽的胶原。

步骤(2)中所述无机粉体为羟基磷灰石或磷酸三钙中一种以上。

步骤(2)中所述无机粉体的粒径为20～100nm。

步骤(2)中所述天然材料溶液的浓度为0.1-10mg/ml；所述混合溶液的浓度为0.1-10mg/ml，天然材料与无机粉体的质量比为1:1。

步骤(1)中所述三维打印的温度高于高分子材料的热熔温度，但低于高分子材料分解温度。

步骤(3)中所述冷冻干燥的温度为-80～-20℃，冷冻干燥的时间为36～48h。

步骤(4)中所述交联剂为edc/nhs体系，戊二醛溶液或氯化钙溶液，交联剂的质量浓度为0.1％～1％。

步骤(4)中所述交联剂进行交联时，交联的温度为-8℃～常温，当交联剂为edc/nhs体系或戊二醛溶液时，交联的温度优选为-8℃～4℃；当交联剂为氯化钙溶液时，交联的温度为常温。

步骤(4)中所述交联剂进行交联时，交联的时间为4～24h。

步骤(4)中所述真空交联的温度为90℃～160℃；真空交联的时间为24～48h。

步骤(1)中所述支架的平均孔尺寸为0.1mm-1.5mm，孔隙率为20％-90％。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：

本发明通过三维打印的方式制备支架，孔结构和孔隙率可控，便于实现；本发明提供三维复合多孔支架的制备方法，工艺简单、操作方便；三维复合多孔支架具有良好的力学性能和生物活性。

附图说明

图1为实施例1中聚氨酯支架即未填充胶原的支架的光学显微镜照片；

图2为实施例2中聚氨酯支架即未填充胶原的支架的光学显微镜照片；

图3为实施例1中三维复合多孔支架即三维打印聚氨酯填充胶原之后的sem图；

图4为实施例2中三维复合多孔支架即三维打印聚氨酯填充胶原之后的sem图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步地详细描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

聚氨酯/胶原三维复合多孔支架的制备：

(1)将聚氨酯(数均分子量mn＝61148)进行三维打印(打印框架时的条件：温度为t＝205℃，压力p＝3.5bar)，得到聚氨酯框架即聚氨酯支架，平均孔尺寸为200μm；该聚氨酯支架即未填充胶原的支架的光学显微镜照片如图1所示；

(2)将0.4mg/ml的胶原水溶液真空脱气泡后，灌注到聚氨酯支架内部，冷冻干燥(-40℃干燥48h)获得未交联的复合支架；

(3)将未交联的复合支架浸没在碳化二亚胺(edc)和琥珀酰胺(nhs)的交联水溶液(交联水溶液的总质量的浓度为0.3％，edc/nhs的摩尔比＝1:1)中进行交联，交联的温度为4℃，交联时间为4h，交联完毕后，用甘氨酸中和未反应的edc，超清洗10次后，-40℃冷冻干燥48h，得到聚氨酯支架/胶原一体化支架即三维复合多孔支架。所述三维复合多孔支架即三维打印聚氨酯填充胶原之后的sem图如图3所示。本实施例所制备的三维复合多孔支架压缩模量为6.3±0.5mpa，孔隙率为62.3％。

实施例2

聚氨酯/胶原三维复合多孔支架的制备：

(1)将聚氨酯(数均分子量mn＝61148)进行三维打印(打印框架时的条件：温度为t＝205℃，压力p＝3.5bar)，得到聚氨酯框架即聚氨酯支架，平均孔尺寸为400μm；聚氨酯支架即未填充胶原的支架的光学显微镜照片如图2所示；

(2)将0.4mg/ml的胶原水溶液真空脱气泡后，灌注到聚氨酯支架内部，采用冷冻干燥(-40℃冷冻干燥48h)获得未交联的复合支架；

(3)将未交联的复合支架浸没在碳化二亚胺(edc)和琥珀酰胺(nhs)的交联溶液(交联水溶液的总质量的浓度为0.3％，edc/nhs的摩尔比＝1:1)中进行交联，交联的温度为4℃，交联时间为4h，交联完毕后，用甘氨酸中和未反应的edc，超清洗10次后，-40℃冷冻干燥48h，得到聚氨酯支架/胶原一体化支架即三维复合多孔支架。本实施例的三维复合多孔支架即三维打印聚氨酯填充胶原之后的sem图如图4所示。本实施例所制备的三维复合多孔支架的压缩模量为6.,2±0.5mpa，孔隙率为81.2％。

实施例3

聚氨酯/海藻酸钠三维复合多孔支架的制备：

(1)将聚氨酯(数均分子量mn＝61148)进行三维打印(打印框架时的条件：温度为t＝205℃，压力p＝3.5bar)，得到聚氨酯框架即聚氨酯支架，平均孔尺寸为1500μm；

(2)将0.2mg/ml的海藻酸钠水溶液真空脱气泡后，灌注到聚氨酯支架内部，然后浸泡在质量浓度为1％的氯化钙溶液中交联12h，用去离子水洗涤5次，在-20℃冷冻干燥48h，得到三维复合多孔支架。本实施例所制备的三维复合多孔支架的压缩模量为6.3±0.5mpa,孔隙率为62.1％。

实施例4

聚己内酯/胶原三维复合多孔支架的制备

(1)将聚己内酯(聚己内酯的数均分子量mn＝90000)进行三维打印(打印框架时的条件：温度为t＝160℃，压力p＝3.5bar)，得到聚己内酯框架即聚己内酯支架，平均孔尺寸为200μm；

(2)将0.4mg/ml的胶原水溶液真空脱气泡后，灌注到聚己内酯支架内部，冷冻干燥(-40℃干燥48h)，得到未交联的复合体；

(3)将未交联的复合体(即聚己内酯支架/胶原复合体)浸没在碳化二亚胺(edc)和琥珀酰胺(nhs)的交联溶液(交联水溶液的总质量的浓度为0.3％，edc/nhs的摩尔比＝1:1)进行交联，交联的温度为4℃，交联时间为4h，交联完毕后，用甘氨酸中和未反应的edc，超清洗10次后冷冻干燥(-40℃冷冻干燥48h)，得到聚己内酯支架/胶原一体化支架即三维复合多孔支架。本实施例所制备的三维复合多孔支架的压缩模量为12.5±0.5mpa,孔隙率为62.1％。

实施例5

聚己内酯/磷酸三钙三维复合多孔支架制备：

(1)将聚己内酯(数均分子量mn＝90000)与磷酸三钙(粒径为20～100nm)进行挤出共混，得到聚己内酯/磷酸三钙复合材料(聚己内酯与磷酸三钙的质量比为90:10)；将聚己内酯/磷酸三钙复合材料进行三维打印(打印框架时的条件：温度为t＝180℃，压力p＝3.5bar)，得到三维聚己内酯/磷酸三钙支架，平均孔尺寸为100μm；

(2)将3mg/ml壳聚糖的乙酸溶液(采用0.1wt％的醋酸水溶液配制成壳聚糖的浓度为3mg/ml)真空脱气泡后，灌注到聚己内酯/磷酸三钙多孔支架内部，然后在-20℃冷冻干燥48h获得聚己内酯/磷酸三钙/壳聚糖三维复合支架即三维复合多孔支架。本实施例所制备的三维复合多孔支架的压缩模量为6.3±0.5mpa,孔隙率为62.1％。

实施例6

聚氨酯/胶原/羟基磷灰石三维复合多孔支架制备：

(1)将聚氨酯(数均分子量mn＝61148)进行三维打印(打印框架时的条件：温度为t＝205℃，压力p＝3.5bar)，得到聚氨酯框架即聚氨酯支架，平均孔尺寸为200μm；

(2)采用水将胶原和羟基磷灰石(粒径为20～100nm)配制成浆料(胶原：羟基磷灰石质量比为1:1，浆料中胶原和羟基磷灰石总的浓度为1mg/ml)，得到胶原/羟基磷灰石浆料；

(3)将胶原/羟基磷灰石浆料真空脱气泡后，灌注到聚氨酯框架中，得到未交联的复合体；

(4)将未交联的复合体浸没在质量浓度为0.2％戊二醛的乙酸水溶液(溶液中乙酸的浓度为0.05mol/l)中，4℃下，交联24h，然后在-20℃冷冻干燥48h，获得聚氨酯/胶原/羟基磷灰石复合支架即三维复合多孔支架。本实施例所制备的三维复合多孔支架的压缩模量为6.3±0.5mpa,孔隙率为62.1％。

实施例7

(1)将聚乳酸(分子量为70000)进行三维打印(打印框架时的条件：温度为t＝150℃，压力p＝3.5bar)，得到三维聚乳酸框架即聚乳酸支架，平均孔尺寸为200μm；

(2)将胶原溶液真空脱气泡后，灌注到三维聚乳酸框架内部，采用冷冻干燥(-40℃冷冻干燥48h)，得到未交联的复合体；

(3)将未交联的复合体于110℃真空热交联48h，保持真空降温得到热交联的聚乳酸支架/胶原一体化支架即三维复合多孔支架。本实施例所制备的三维复合多孔支架的压缩模量为7.6±0.4mpa，孔隙率为80.3％。

实施例8

聚氨酯支架/胶原三维复合多孔支架制备：

(1)将聚氨酯(数均分子量mn＝61148)进行三维打印(打印框架时的条件：温度为t＝205℃，压力p＝3.5bar)，得到聚氨酯框架即聚氨酯支架，平均孔尺寸为200μm；

(2)将胶原溶液真空脱气泡后，灌注到聚氨酯支架内部，冷冻干燥(-40℃冷冻干燥48h)，得到未交联的复合体；

(3)将未交联的复合体即聚氨酯支架/胶原复合体浸没在质量浓度为0.2％戊二醛的乙酸水溶液(溶液中乙酸的浓度为0.05mol/l)中，4℃下，交联24h，交联完毕后，用pbs缓冲液和去离子水超清洗10次，然后冷冻干燥(-40℃冷冻干燥48h)，得到聚氨酯支架/胶原一体化支架即三维复合多孔支架。本实施例所制备的三维复合多孔支架的压缩模量为6.3±0.5mpa,孔隙率为62.1％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但是本发明的实施方式不受上述实例限制，其他的任何未背离本发明精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化均为等效。