一种具有生物活性的硬组织工程支架材料及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及医用材料技术领域，具体涉及一种具有生物活性的硬组织工程支架材料及其制备方法。
【背景技术】
[0002]生物医用材料是用于和生物系统结合、治疗或替换生物机体中的组织、器官或增进其功能的材料。作为一类人工或天然材料，它可以单独或与药品一起制成成品，用于组织或器官的治疗或替代，其最终目的是能够替代或修复人体器官和组织，并实现其生理功能。生物医用材料按材料组成和性质分为医用金属材料、医用高分子材料、生物陶瓷材料和生物医学复合材料。按用途可分为骨、牙、关节、肌键等硬组织修复和替换材料以及皮肤、乳房等软组织修复材料等。
[0003]硬组织材料是生物医用材料的重要组成部分，在人体硬组织(骨、牙等)的缺损修复及重建已丧失的生理功能方面起着重要的作用。1999年，全球生物材料及其制品销售额已达到1000亿美元，其中硬组织生物材料占1/5。根据民政部门报告，我国骨缺损患者近300万，牙缺损患者人数达总人数的1/5到1/3。
[0004]目前，对硬组织替代材料的研究已经受到广泛关注，发展了金属、高分子和陶瓷等三类硬组织替代材料，并将仿生、纳米、复合材料以及组织工程等先进的技术应用于硬组织替代材料领域的研究。
[0005]生物陶瓷是生物医用材料的重要组成部分，在人体硬组织的缺损修复及重建已丧失的生理功能方面起着重要的作用。几十年来，生物陶瓷的研究和应用取得了很大的进展，已从短期替换和填充，发展为永久性牢固填入，从生物惰性材料发展到生物活性材料、生物可降解材料及多相复合材料。生物陶瓷材料已广泛用于人工牙齿(根)、人工骨、人工关节和人工眼等。但其不足之处也是明显的。首先，其细胞粘附性差，不具有骨诱导特性；其次，其脆性大，柔韧性不够；最后，其在体内降解较慢。
[0006]就根本而言，替代材料的各方面性能应该尽量接近人体本身固有硬组织的性能指标，才能更好地满足人体的需要。人体硬组织材料(特别是骨、牙齿)，基本上是结构复杂的的陶瓷-有机物复合体。
[0007]胶原(Collagen)是细胞外最重要的水不溶性纤维蛋白，是构成细胞外基质的骨架。胶原不仅为细胞提供支持保护作用，而且与细胞的粘附、生长、表型表达均有密切关系。目前研究较多的无机物与胶原复合材料中，所用的胶原支架大部分从牛、马肌腱中提取出来，提取工艺中首先将动物组织中的胶原溶解，然后通过戊二醛等交联剂交联的办法重建胶原支架结构。
[0008]综上所述，目前虽然有一些生产硬组织材料的方法及其产品，但它们大多有一定的弊端或局限性，主要表现在:
[0009]1、单纯的陶瓷类替代材料脆性大、韧性低，不能用于负重部位骨缺损的修复。
[0010]2、目前研究主要集中在提取胶原后再交联的方式制备胶原支架，价格昂贵，且破坏了胶原的天然三维结构，很难达到骨替代材料的力学和生物学性能。同时，溶解胶原过程中，末端肽很可能受到破坏，从而使胶原产生抗原性，影响组织细胞生长。
[0011]3、无机物与有机物物理混合的方式在体内并不稳定，与人体硬组织结构差距大。
[0012]鉴于此，有必要研究开发性能更好、生物安全性更高且同时便于生产、成本较低的硬组织材料。
【发明内容】
[0013]本发明的目的是为了克服现有技术中的上述各种缺陷，而提供一种具有生物活性的硬组织工程支架材料及其制备方法。本发明的硬组织工程支架材料更加接近人骨结构，且具有良好的生物活性，制备工艺简单，成本较低，具有良好的应用前景。
[0014]本发明提供的技术方案之一是:一种具有生物活性的硬组织工程支架材料的制备方法，其包括如下步骤:
[0015](I)将经去抗原处理后的ECM在Tris或PBS缓冲液中充分溶胀，溶胀后将ECM取出以去离子水、生理盐水或PBS缓冲液冲洗，去除表面残留液体后进行冷冻干燥处理，得到充分膨胀的胶原支架；
[0016](2)将充分膨胀的胶原支架分别在含有Ca2+的溶液和含有(P04) 3的溶液中反复轮流浸泡进行矿化反应，矿化反应完成后用去离子水、生理盐水或PBS缓冲液冲洗，后进行冷冻干燥处理，得到天然细胞外基质-生物活性磷酸钙硬组织工程用复合支架材料；
[0017](3)将得到的天然细胞外基质-生物活性磷酸钙硬组织工程用复合支架材料在壳聚糖溶液、硫酸软骨素溶液、透明质酸钠溶液和骨骼生长因子溶液中的一种或一种以上的复合溶液中浸泡，后进行冷冻干燥处理，即得具有生物活性的支架材料。
[0018]步骤(I)中，所述的ECM为本领域常规的含义，其是指细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)，是由动物细胞合成并分泌到胞外、分布在细胞表面或细胞之间的大分子，主要是一些多糖和蛋白，或蛋白聚糖。这些物质构成复杂的网架结构，支持并连接组织结构、调节组织的发生和细胞的生理活动。在本发明中，所述的ECM优选牛真皮基质、牛心包基质、牛跟腱基质、牛腹膜基质、猪腹膜基质、猪膀胱粘膜下层基质、猪小肠粘膜下层基质等保持天然结构和性能的主要由胶原蛋白组成的材料。
[0019]步骤(I)中，所述的去抗原处理为本领域常规的操作，如可以将牛真皮基质、牛心包基质、牛跟腱基质、牛腹膜基质、猪腹膜基质、猪膀胱粘膜下层基质、猪小肠粘膜下层基质等ECM基质进行脱脂、脱细胞等处理即可，使其免疫原性降到最低。
[0020]步骤⑴中，所述的溶胀优选溶胀的时间为12?36小时。
[0021]步骤(I)中，所述的冲洗优选以去离子水、生理盐水或PBS缓冲液冲洗3?10次。
[0022]步骤⑵中，所述的含有Ca2+的溶液为常规的可溶性钙盐溶液，优选0.1M?0.3M的CaCl2溶液或Ca (NO 3)2溶液，最优选0.2M的CaCl 2溶液。所述的含有(P04) 3的溶液为常规的含有(P04)3的可溶性盐溶液，优选0.1M?0.5M的(NH4)2HPO4溶液、K2HPO4溶液或Na2HPO4溶液，最优选0.25M的(NH 4) 2ΗΡ04溶液。
[0023]步骤(2)中，所述的反复轮流浸泡是指在含有Ca2+的溶液和含有(P04) 3的溶液中轮流浸泡多次，对于先在哪一种溶液中浸泡并没有特别限制。其具体操作优选如下:(a)将充分膨胀的胶原支架浸泡在含有Ca2+的溶液中，并在25?37°C摇床中摇动I?4小时，取出用去离子水、生理盐水或PBS缓冲液清洗3?10次，每次5?20分钟；(b)将胶原支架浸泡在含有(P04)3的溶液中，并在20?37°C摇床中摇动I?4小时，取出用去离子水、生理盐水或PBS缓冲液清洗3?10次，每次5?20分钟；轮流进行(a)和(b)的操作重复4?12次。在(a)和(b)的操作中，优选每次在37°C摇床中摇动2小时，所述摇床的转速优选120转/分。所述清洗优选使用PBS缓冲液清洗3次，每次20分钟。所述轮流进行(a)和(b)的操作重复的次数优选10次。
[0024]在步骤(I)、⑵和(3)中，所述冷冻干燥优选真空冷冻干燥，所述真空冷冻干燥的过程为:将上一步得到的材料进行2?12小时的预冻，而后对产品进行真空低温干燥，所述预冻的温度为-80°C?-40°C，在所述真空低温干燥的过程中温度由预冻温度上升到4°C以上，所述真空低温干燥的时间优选8小时。所述预冻的时间优选4小时，所述预冻的温度优选-80。。。
[0025]步骤(3)中，所述壳聚糖溶液、硫酸软骨素溶液、透明质酸钠溶液和骨骼生长因子溶液中的一种或一种以上的复合溶液的浓度优选0.0I %?I %，所述百分比为质量体积百分比，如I %的壳聚糖溶液，即指10mL溶液中溶解有Ig壳聚糖；所述浸泡的时间优选0.5?2h。步骤(3)更优选在0.01%的骨骼生长因子溶液中浸泡Ih。
[0026]较佳地，本发明的制备方法还包括步骤(4):将具有生物活性的支架材料进行灭菌处理，以方便包装保存。所述灭菌处理较佳地为使用Co60辐照灭菌或使