用环氧乙烷进行灭菌。
[0027]本发明提供的技术方案之二是:由前述制备方法制得的具有生物活性的硬组织工程支架材料。
[0028]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0029]本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0030]本发明的积极进步效果在于:
[0031]本发明的硬组织工程支架材料具有很高的生物安全性，其保持了细胞外基质的天然三维结构，有利于细胞的生长、增殖和分化，因细胞外基质的胶原分子与沉积的磷酸钙盐为化学键合，使得产品更加接近人骨结构。本发明的材料复合了硫酸软骨素、透明质酸钠、骨骼细胞生长因子等生物活性物质，能够促进组织再生。该材料保留了原有天然胶原三维网络结构，沉积有生物活性的以羟基磷灰石(HA)为主的弱结晶类磷酸钙盐类，两者的结合使得材料具有一定的生物力学特性，很好的生物相容性及降解性，同时保留了大部分细胞外基质中的生长因子，可应用于硬组织替代材料。本发明的制备工艺相较于传统方法成本较低，可操作性强，应用前景良好。
【附图说明】
[0032]图1为实施例1制得的支架材料的SEM图。
[0033]图2为实施例1制得的支架材料与单纯去抗原后的ECM植入兔下颂骨缺损部位后的效果对比图，其中，左边为实施例1的支架材料，右侧为单纯去抗原后的ECM。
[0034]图3为实施例7制得的支架材料的EDS图。
【具体实施方式】
[0035]以下实施例用于说明本发明，但并不用来限制本发明的范围。下述各实施例中，所使用的各类设备、试剂和材料若无特别说明，均为常规市售可得。
[0036]实施例1支架材料的制备
[0037]制备猪小肠粘膜下层:将新鲜的猪小肠粘膜下层用过氧乙酸或酒精消毒，消毒处理后将猪小肠粘膜下层依次浸入氢氧化钠和Η)ΤΑ后反复用去离子水清洗，得到ECM材料。
[0038]将制得的ECM材料浸泡在PH = 8.8的Tris缓冲液中，放在37°C摇床中使其充分溶胀12小时，取出用去离子水冲洗3次，每次10分钟；然后用滤纸擦干表面水分，放入液氮中迅速冷冻2小时，-80°C进行真空冷冻干燥8小时，得到充分膨胀后的胶原支架。将胶原支架:a)浸泡在25ml 0.2M CaCl2溶液中，并在20°C摇床中以120转/分的速度摇动I小时，取出用去离子水清洗3次，每次20分钟；b)再将其浸泡在25ml0.25M(NH4)2HPO4溶液中，并在37°C摇床中以120转/分的速度摇动I小时，取出用去离子水清洗3次，每次20分钟；轮流重复a)和b)步骤10次。再将材料浸泡在0.1 %硫酸软骨素溶液中2h，最后冷冻干燥，得到的产品以Co60辐照灭菌、包装待用，得到具有生物活性的硬组织工程支架材料，其电镜SEM图如图1所示。经实验测定，本发明制得的支架材料的钙磷比在1.58?1.80之间；其无机物含量经灼烧实验测定约为70?80%，与人骨无机物含量相近，可作为骨替代材料。
[0039]将所制备的硬组织工程支架材料植入有缺损的兔下颂骨，并与简单去抗原后的ECM材料做对比，植入一个月后用X射线进行对比，参见图2。图2中，左侧(标有R侧)为本实施例制得的支架材料植入有缺损的兔下颂骨一个月后的情形，右侧为简单去抗原后的ECM材料植入一个月后的情形，从图2可以看出，试验兔植入本实施例制得的硬组织工程支架材料对于兔下颂骨缺损处的修复，明显强于单独去抗原材料的左侧下颂骨缺损的修复。可见，本发明制备的硬组织工程支架材料较简单去抗原后的ECM有更好的成骨性能。
[0040]实施例2支架材料的制备
[0041]制备牛心包基质:将新鲜的牛心包用过氧乙酸或酒精消毒，消毒处理后将牛心包依次浸入氢氧化钠和m)TA后反复用去离子水清洗。得到ECM材料。
[0042]将制得的ECM材料浸泡在PH = 8.8的Tris缓冲液(制备方法为在800ml纯化水中加入121.1g Tris，加入浓HCL调节PH值至8.8，继续加水至I升)中，放在37°C摇床中使其充分溶胀24小时，取出用去离子水冲洗3次，每次10分钟；然后用滤纸擦干表面水分，放入液氮中迅速冷冻2小时，_80°C进行真空冷冻干燥8小时，得到充分膨胀后的胶原支架。将胶原支架:a)浸泡在25ml 0.1M CaCl2溶液中，并在37°C摇床中以120转/分的速度摇动2小时，取出用去离子水清洗3次，每次20分钟；b)将其浸泡在25ml 0.1M(NH4)2HPO4S液中，并在37°C摇床中以120转/分的速度摇动2小时，取出用去离子水清洗3次，每次20分钟；轮流重复a)和b)步骤4次。再将材料浸泡在0.1 %硫酸软骨素溶液中lh，最后冷冻干燥，得到的产品以Co60辐照灭菌、包装待用，得到牛心包-生物活性磷酸钙复合材料，其无机物含量经灼烧实验测定约为2?5%，与人软骨无机物含量相近，可作为软骨替代材料。
[0043]实施例3支架材料的制备
[0044]制备牛真皮基质:将新鲜的牛真皮用过氧乙酸或酒精消毒，消毒处理后将牛真皮依次浸入石油醚和氢氧化钠后反复用去离子水清洗。得到ECM材料。
[0045]将制得的ECM材料浸泡在PH = 8.8的PBS缓冲液，放在37 °C摇床中使其充分溶胀36小时，取出用生理盐水冲洗10次，每次10分钟；然后用滤纸擦干表面水分，放入-40°C中迅速冷冻12小时，-80°C进行真空冷冻干燥8小时，得到充分膨胀后的胶原支架。将胶原支架:a)浸泡在25ml 0.3M CaCl2溶液中，并在25°C摇床中以120转/分的速度摇动4小时，取出用生理盐水清洗5次，每次5分钟；b)再将其浸泡在25ml0.5M(NH4)2HPO4溶液中，并在37°C摇床中以120转/分的速度摇动4小时，取出用生理盐水清洗5次，每次5分钟；轮流重复a)和b)步骤10次。再将材料浸泡在I %壳聚糖溶液中0.5h，最后冷冻干燥，得到的产品以Co60辐照灭菌、包装待用，得到牛真皮基质-生物活性磷酸钙复合材料。
[0046]实施例4支架材料的制备
[0047]制备牛跟腱基质:将新鲜的牛跟腱用过氧乙酸或酒精消毒，消毒处理后将牛心包依次浸入氢氧化钠和蛋白酶后反复用去离子水清洗。得到ECM材料。
[0048]将制得的ECM材料浸泡在PH = 8.8的Tris缓冲液，放在37°C摇床中使其充分溶胀36小时，取出用PBS冲洗10次，每次10分钟；然后用滤纸擦干表面水分，放入-40°C中迅速冷冻12小时，-80°C进行真空冷冻干燥8小时，得到充分膨胀后的胶原支架。将胶原支架:
a)浸泡在25ml0.3M Ca (NO3) 2溶液中，并在25°C摇床中以120转/分的速度摇动2小时，取出用PBS清洗10次，每次5分钟；b)再将其浸泡在25ml 0.3M K2HPO4溶液中，并在37°C摇床中以120转/分的速度摇动2小时，取出用PBS清洗10次，每次5分钟；轮流重复a)和
b)步骤10次。再将材料浸泡在0.01%骨骼生长因子溶液中0.5h，最后冷冻干燥后得到牛跟腱基质-生物活性磷酸钙复合材料。
[0049]实施例5支架材料的制备
[0050]制备牛腹膜基质:将新鲜的牛腹膜用过氧乙酸或酒精消毒，消毒处理后将牛腹膜依次浸入氢氧化钠和m)TA后反复用去离子水清洗。得到ECM材料。
[0051 ] 将制得的ECM材料浸泡在PH = 8.8的Tris缓冲液，放在37°C摇床中使其充分溶胀24小时，取出用PBS冲洗3次，每次10分钟；然后用滤纸擦干表面水分，放入_80°C中迅速冷冻2小时，-80°C进行真空冷冻干燥8小时，得到充分膨胀后的胶原支架。将胶原支架:
a)浸泡在25ml0.2M Ca (NO3) 2溶液中，并在37°C摇床中以120转/分的速度摇动2小时，取出用PBS清洗10次，每次5分钟；b)再将其浸泡在25ml 0.2M Na2HPO4S液中，并在37°C摇床中以120转/分的速度摇动2小时，取