一种纳米纤维神经组织工程支架的制备方法与流程

本发明涉及一种天然柞蚕丝素蛋白/聚乳酸-聚己内酯复合纳米纤维神经组织工程支架的制备方法，属于生物医学材料涉及神经缺损修复领域。

背景技术：

在人类医疗和保健方面，器官和组织的缺损或衰竭是发生最为频繁、最具破坏性和花费最为昂贵的问题。神经的再生以及功能的恢复一直是困扰临床的一个难题，全世界每年都有很多的患者因神经组织坏死需要进行神经修复。而目前的治疗方法主要是自体神经移植来治疗神经断裂或损伤。这种方法虽然拯救或延长了不少人的生命，但采用以牺牲健康组织为代价的“以伤治伤”方法并不完美，关键问题是具有生物活性的自体神经来源非常有限。此外在目前的医疗条件下很难避免神经纤维的错向对接，从而影响神经功能的恢复。近年来，组织工程与再生医学的发展为重建或修复神经组织提供了有效的治疗手段，利用生物材料构建的神经再生导管，为临床神经缺损修复带来了曙光。

神经支架材料的设计应该最大限度仿生人体内细胞外基质(ECM)的结构与功能特点才能有效解决材料的生物相容性问题，调控生物信号的传导，诱导神经细胞和组织生长，促进神经机体的再生与修复。人体细胞外基质本质上是由蛋白质和糖胺聚糖交联而成的纳米纤维网络，纤维直径一般为50-500nm。天然的细胞外基质包含很多生物信息，能使细胞更容易附着并维持细胞功能。细胞通过细胞膜上的受体系统与细胞外基质上的配体特异性结合并对外界信号做出反应，影响细胞行为。因此从结构和功能上仿生细胞外基质的理想神经支架具有广阔的开发前景。

柞蚕丝素蛋白是丝素蛋白的一种，但在绝大部分的丝素蛋白材料的研究或报道中，所用的原料都是家蚕丝。柞蚕丝素蛋白是由柞蚕丝腺内壁上的内皮细胞分泌的高纯度蛋白质，其氨基酸组成中以甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸为主，具有良好的生物相容性，其本身及其降解产物对细胞和机体无毒，不会或较少引起炎症和免疫排斥反应。特别是其蛋白质分子中含有特殊的精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸(RGD)三肽序列。RGD序列作为细胞膜整合素受体与细胞外配体相结合的识别位点，介导细胞与细胞外基质及细胞之间的相互作用，能够促进细胞对于支架的识别及粘附。但由于天然蛋白质力学性能较差无法满足组织功能的需要，所以限制了其在生物医学领域中应用。

聚乳酸-聚己内酯(P(LLA-CL))是乳酸和己内酯的共聚物，由于其具有良好的生物可降解性和良好机械性能，被广泛用于组织工程和药物释放领域。但是聚乳酸-聚己内酯属于合成高分子材料，不能为神经组织生长提供所需的生物信号，同时亲水性较差，不利于细胞的粘附和生长。因此，将柞蚕丝素蛋白和聚乳酸-聚己内酯混纺可以结合二者的优点，既能使支架材料具有较高且符合神经组织的力学性能，又能为组织生长提供生物信号，促进神经细胞的粘附、增值和分化，从而满足神经组织的需要。

因此，将柞蚕丝素蛋白和聚乳酸-聚己内酯共混采用静电纺丝技术制备的复合纳米纤维支架能最大限度的从结构和功能上仿生人体细胞外基质，有望成为理想中的神经组织支架。公开号为101502671的中国发明专利中，公开了丝素蛋白/P(LLA-CL)复合纳米纤维组织修复支架的制备方法，其丝素蛋白采用的是家蚕丝蛋白，由于家蚕丝素蛋白氨基酸序列中不含有RGD三肽序列，因此对于细胞识别以及粘附性方面不足。而柞蚕丝素蛋白与聚乳酸-聚己内酯共混采用静电纺丝的方法制备神经导管支架至今未见报道。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种天然柞蚕丝素蛋白/聚乳酸-聚己内酯复合纳米纤维神经组织工程支架的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种纳米纤维神经组织工程支架的制备方法，其特征在于，包括：将柞蚕丝素蛋白或柞蚕丝素蛋白与聚乳酸-聚己内酯溶于溶剂中，得到静电纺丝溶液，进行静电纺丝，将所得的纳米纤维膜采用乙醇或乙醇溶液进行熏蒸处理，真空干燥，得到纳米纤维神经组织工程支架。

优选地，所述的静电纺丝溶液中柞蚕丝素蛋白与聚乳酸-聚己内酯的总浓度为4％-12％(w/v)。

优选地，所述的柞蚕丝素蛋白与聚乳酸-聚己内酯的质量比为0∶100-100∶0，不包括0∶100。

更优选地，所述的柞蚕丝素蛋白与聚乳酸-聚己内酯的质量比为100∶0、75：25、50∶50或25∶75。

最优选地，所述的柞蚕丝素蛋白与聚乳酸-聚己内酯的质量比为25∶75。

优选地，所述的柞蚕丝素蛋白的制备方法包括：将柞蚕丝进行脱胶、溶解、透析处理后得到柞蚕丝素蛋白溶液，进行冷冻干燥，得到柞蚕丝素蛋白。

优选地，所述的聚乳酸-聚己内酯的分子量Mn为25-35万。

优选地，所述的溶剂为六氟异丙醇。

优选地，所述的静电纺丝的工艺参数为：电压为10-15KV，喷丝头和接收装置之间的距离为8-15cm，纺丝速率为0.8-1.5ml/h。

优选地，所述的熏蒸处理采用体积分数为75％的乙醇进行。

优选地，所述的真空干燥时间为24-72h。

优选地，通过调节柞蚕丝素蛋白和聚乳酸-聚己内酯的质量比及静电纺丝溶液中柞蚕丝素蛋白与聚乳酸-聚己内酯的总质量浓度来调节纳米纤维神经组织工程支架的直径、力学性能、亲疏水性、降解速率和细胞粘附性中的至少一种。

本发明的纳米纤维神经组织工程支架在生物医学领域神经组织工程中应用。与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明采用含有RGD序列的柞蚕丝素蛋白和高分子共聚物聚乳酸-聚己内酯(P(LLA-CL))共混，采用静电纺技术巧妙地将二者优点结合，得到柞蚕丝素蛋白/聚乳酸-聚己内酯复合纳米纤维支架，既能使支架材料具有较高且符合神经组织的力学性能，又能为组织生长提供生物信号，促进神经细胞的粘附、增殖和分化。

(2)本发明以天然材料柞蚕丝素蛋白和生物可降解高聚物聚乳酸-聚己内酯共混采用静电纺丝技术制备得到物理化学性能优异，生物相容性好的复合纳米纤维神经组织工程支架材料。得到的复合纳米纤维直径，力学性能，亲疏水性，降解速率，细胞粘附性等可由柞蚕丝素蛋白和聚乳酸-聚己内酯的质量比及共混溶液的浓度比调节。制备的柞蚕丝素蛋白/聚乳酸-聚己内酯纳米纤维神经支架能够保持柞蚕丝素蛋白的相容性，对人体无毒无害，无免疫原性，同时，支架材料保持了柞蚕丝素蛋白的RGD序列，能够促进神经细胞对于支架材料的识别，提高了细胞的粘附性以及材料的靶向性。

(3)本发明可通过调节混纺比例及浓度来控制神经组织工程支架的物理化学性能。同时制得的纳米纤维支架能够很好地仿生天然细胞外基质的结构、组成及功能，是理想的神经组织工程支架。

(4)本发明制备方法简单，材料来源丰富，可重复性好，经济效益高，为临床中遇到的神经缺损修复提供了新的实验思路，同时适合工业化批量生产。

附图说明

图1纺丝液浓度6％-12％，柞蚕丝素蛋白和聚乳酸-聚己内酯质量比为50∶50的静电纺纳米纤维支架材料的扫描电镜照片及直径分布图：(a)6％，(b)8％，(c)10％，(d)12％.

图2纺丝液浓度为10％，不同质量比的柞蚕丝素蛋白和聚乳酸-聚己内酯静电纺纳米纤维支架材料的扫描电镜照片及直径分布图：(a)100∶0；(b)75∶25；(c)50∶50；(d)25∶75；(e)0∶100.

图3纺丝液浓度为10％，不同质量比的柞蚕丝素蛋白和聚乳酸-聚己内酯静电纺纳米纤维支架材料亲疏水性能；

图4雪旺细胞(SCs)在不同质量比的柞蚕丝素蛋白和聚乳酸-聚己内酯静电纺纳米纤维支架材料上的增殖情况

图5雪旺细胞(SCs)在不同质量比的柞蚕丝素蛋白和聚乳酸-聚己内酯静电纺纳米纤维支架材料上生长形貌观察扫描电镜图片(a)100∶0；(b)75∶25；(c)：50∶50；(d)25∶75；(e)0∶100；(f)对照组Cover slips(盖玻片)。

图6雪旺细胞(SCs)在不同质量比的柞蚕丝素蛋白和聚乳酸-聚己内酯静电纺纳米纤维支架材料上生长3天荧光染色图片(a)100∶0；(b)75∶25；(c)：50∶50；(d)25∶75；(e)0∶100；(f)对照组Cover slips(盖玻片)。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

本发明各实施例中所用的聚乳酸-聚己内酯为市售产品，其分子量Mn为30万，其中，乳酸单元和己内酯单元的摩尔比为50∶50。

实施例1

一种纳米纤维神经组织工程支架的制备方法，具体步骤为：

(1)将柞蚕丝在95～100℃环境下，置于含5g/L Na₂CO₃的溶液中脱胶3次，每次30min，浴比1∶50。脱胶后得到柞蚕丝素纤维，60℃烘干。将柞蚕丝素纤维按浴比1∶10置于饱和的LiSCN溶液中，50℃±2℃下溶解70min，获得的柞蚕丝素蛋白溶液装入截留分子质量为8-10KDa的透析袋中，用去离子水透析3d，经冷冻干燥得到柞蚕丝素蛋白。

(2)将柞蚕丝素蛋白0.3g和聚乳酸-聚己内酯0.3g溶于10ml六氟异丙醇，以200r/min的速率磁力搅拌4h至完全溶解，得到柞蚕丝素蛋白与聚乳酸-聚己内酯的总浓度为6％(w/v)的静电纺丝溶液，进行静电纺丝，用铝箔平整包缠10x10cm²接收板接收纳米纤维，纺丝条件：电压14千伏，喷丝头和接收板之间的距离为10cm，纺丝速率1.5ml/h，大约7h后铝箔上接收到一定厚度的纳米纤维膜，取下后放入密闭容器内，用体积分数75％的乙醇在温度为25℃、标准大气压的条件下进行熏蒸处理24h进行交联，处理完毕后在温度为25℃、真空度为-30KPa的条件下真空干燥48h，去除残留溶剂，得到纳米纤维神经组织工程支架。用Image J软件分析纳米纤维直径为180±57m。

实施例2

一种纳米纤维神经组织工程支架的制备方法，具体步骤为：

(1)将柞蚕丝在95～100℃环境下，置于含5g/L Na₂CO₃的溶液中脱胶3次，每次30min，浴比1∶50。脱胶后得到柞蚕丝素纤维，60℃烘干。将柞蚕丝素纤维按浴比1∶10置于饱和的LiSCN溶液中，50℃±2℃下溶解70min，获得的柞蚕丝素蛋白溶液装入截留分子质量为8-10KDa的透析袋中，用去离子水透析3d，经冷冻干燥得到柞蚕丝素蛋白。

(2)将柞蚕丝素蛋白0.4g和聚乳酸-聚己内酯0.4g溶于10ml六氟异丙醇，以200r/min的速率磁力搅拌4h至完全溶解，得到柞蚕丝素蛋白与聚乳酸-聚己内酯的总浓度为8％(w/v)的静电纺丝溶液，进行静电纺丝，用铝箔平整包缠10x10cm²接收板接收纳米纤维，纺丝条件：电压14千伏，喷丝头和接收板之间的距离为10cm，纺丝速率1.5ml/h，大约7h后铝箔上接收到一定厚度的纳米纤维膜，取下后放入密闭容器内，用体积分数75％的乙醇在温度为25℃、25℃、标准大气压的条件下进行熏蒸处理24h进行交联，处理完毕后温度为25℃、真空度为-30KPa的条件下真空干燥48h，去除残留溶剂，得到纳米纤维神经组织工程支架。用Image J软件分析纳米纤维直径为247±39nm。

实施例3

一种纳米纤维神经组织工程支架的制备方法，具体步骤为：

(1)将柞蚕丝在95～100℃环境下，置于含5g/L Na₂CO₃的溶液中脱胶3次，每次30min，浴比1∶50。脱胶后得到柞蚕丝素纤维，60℃烘干。将柞蚕丝素纤维按浴比1∶10置于饱和的LiSCN溶液中，50℃±2℃下溶解70min，获得的柞蚕丝素蛋白溶液装入截留分子质量为8-10KDa的透析袋中，用去离子水透析3d，经冷冻干燥得到柞蚕丝素蛋白。

(2)将柞蚕丝素蛋白0.5g和聚乳酸-聚己内酯0.5g溶于10ml六氟异丙醇，以200r/min的速率磁力搅拌4h至完全溶解，得到柞蚕丝素蛋白与聚乳酸-聚己内酯的总浓度为10％(w/v)的静电纺丝溶液，进行静电纺丝，用铝箔平整包缠10x10cm²接收板接收纳米纤维，纺丝条件：电压14千伏，喷丝头和接收板之间的距离为10cm，纺丝速率1.5ml/h，大约7h后铝箔上接收到一定厚度的纳米纤维膜，取下后放入密闭容器内，用体积分数75％的乙醇在温度为25℃、标准大气压的条件下的条件下进行熏蒸处理24h进行交联，处理完毕后温度为25℃、真空度为-30KPa的条件下真空干燥48h，去除残留溶剂，得到纳米纤维神经组织工程支架。用Image J软件分析纳米纤维直径为539±90nm。

实施例4

一种纳米纤维神经组织工程支架的制备方法，具体步骤为：

(1)将柞蚕丝在95～100℃环境下，置于含5g/L Na₂CO₃的溶液中脱胶3次，每次30min，浴比1∶50。脱胶后得到柞蚕丝素纤维，60℃烘干。将柞蚕丝素纤维按浴比1∶10置于饱和的LiSCN溶液中，50℃±2℃下溶解70min，获得的柞蚕丝素蛋白溶液装入截留分子质量为8-10KDa的透析袋中，用去离子水透析3d，经冷冻干燥得到柞蚕丝素蛋白。

(2)将柞蚕丝素蛋白0.6g和聚乳酸-聚己内酯0.6g溶于10ml六氟异丙醇，以200r/min的速率磁力搅拌4h至完全溶解，得到柞蚕丝素蛋白与聚乳酸-聚己内酯的总浓度为12％(w/v)的静电纺丝溶液，进行静电纺丝，用铝箔平整包缠10x10cm²接收板接收纳米纤维，纺丝条件：电压14千伏，喷丝头和接收板之间的距离为10cm，纺丝速率1.5ml/h，大约7h后铝箔上接收到一定厚度的纳米纤维膜，取下后放入密闭容器内，用体积分数75％的乙醇在在温度为25℃、标准大气压的条件下的条件下进行熏蒸处理24h进行交联，处理完毕后温度为25℃、真空度为-30KPa的条件下真空干燥48h，去除残留溶剂，得到纳米纤维神经组织工程支架。用Image J软件分析纳米纤维直径为838±147nm。

实施例5

一种纳米纤维神经组织工程支架的制备方法，具体步骤为：

(1)将柞蚕丝在95～100℃环境下，置于含5g/L Na₂CO₃的溶液中脱胶3次，每次30min，浴比1∶50。脱胶后得到柞蚕丝素纤维，60℃烘干。将柞蚕丝素纤维按浴比1∶10置于饱和的LiSCN溶液中，50℃±2℃下溶解70min，获得的柞蚕丝素蛋白溶液装入截留分子质量为8-10KDa的透析袋中，用去离子水透析3d，经冷冻干燥得到柞蚕丝素蛋白。

(2)将柞蚕丝素蛋白0.25g和聚乳酸-聚己内酯0.75g溶于10ml六氟异丙醇，以200r/min的速率磁力搅拌4h至完全溶解，得到柞蚕丝素蛋白与聚乳酸-聚己内酯的总浓度为10％(w/v)的静电纺丝溶液，进行静电纺丝，用铝箔平整包缠10x10cm²接收板接收纳米纤维，纺丝条件：电压14千伏，喷丝头和接收板之间的距离10cm，纺丝速率1.5ml/h，大约7h后铝箔上接收到一定厚度的纳米纤维膜。取下后放入密闭容器内，用体积分数75％的乙醇在温度为25℃、标准大气压的条件下的条件下进行熏蒸处理24h进行交联，处理完毕后温度为25℃、真空度为-30KPa的条件下真空干燥48h，去除残留溶剂，得到纳米纤维神经组织工程支架。用Image J软件分析纳米纤维直径为399±83nm。

实施例6

一种纳米纤维神经组织工程支架的制备方法，具体步骤为：

(1)将柞蚕丝在95～100℃环境下，置于含5g/L Na₂CO₃的溶液中脱胶3次，每次30min，浴比1∶50。脱胶后得到柞蚕丝素纤维，60℃烘干。将柞蚕丝素纤维按浴比1∶10置于饱和的LiSCN溶液中，50℃±2℃下溶解70min，获得的柞蚕丝素蛋白溶液装入截留分子质量为8-10KDa的透析袋中，用去离子水透析3d，经冷冻干燥得到柞蚕丝素蛋白。

(2)将柞蚕丝素蛋白0.75g和聚乳酸-聚己内酯0.25g溶于10ml六氟异丙醇，以200r/min的速率磁力搅拌4h至完全溶解，得到柞蚕丝素蛋白与聚乳酸-聚己内酯的总浓度为10％(w/v)的静电纺丝溶液，进行静电纺丝，用铝箔平整包缠10x10cm²接收板接收纳米纤维，纺丝条件：电压14千伏；喷丝头和接收板之间的距离10cm，纺丝速率1.5ml/h，大约7h后铝箔上接收到一定厚度的纳米纤维膜。取下后放入密闭容器内，用体积分数75％的乙醇在温度为25℃、标准大气压的条件下的条件下进行熏蒸处理24h进行交联，处理完毕后温度为25℃、真空度为-30KPa的条件下真空干燥48h，去除残留溶剂，得到纳米纤维神经组织工程支架。用Image J软件分析纳米纤维直径为514±102nm。

实施例7

类似于实施例6，区别在于：所述步骤(2)中，柞蚕丝素蛋白的用量为1g，聚乳酸-聚己内酯的用量为0g。

对比例1

类似于实施例6，区别在于：所述步骤(2)中，柞蚕丝素蛋白的用量为0g，聚乳酸-聚己内酯的用量为1g。

实施例1-4中的纳米纤维神经组织工程支架的扫描电镜照片及直径分布如图1所示。实施例3，5-7和对比例1中的纳米纤维神经组织工程支架的扫描电镜照片及直径分布如图2所示。

实施例3，5-7和对比例1中的纳米纤维神经组织工程支架的亲疏水性如图3所示，采用接触角测试仪进行测试，其结果表明，实施例3，5-7和对比例1相比亲水性降低，疏水性增加，且亲水性随着P(LLA-CL)含量的增加而降低。

神经雪旺细胞接种于实施例3，5-7和对比例1中的纳米纤维神经组织工程支架及盖玻片上，即利用24孔打孔器进行各样品的准备，每种样品在特定时间点准备3个平行样，将各样品置于24孔培养板中，以盖玻片作为对照样，将各板置于体积分数为75％的酒精蒸汽缸中进行灭菌处理2h后置于超净工作台备用，利用PBS依次清洗支架以及空白培养板3次，以此除去未挥发的酒精蒸汽。雪旺细胞的种植密度为每孔1×10⁴个，再将配好的DMEM培养基(89％DMEM，10％胎牛血清，1％双抗)依次加入各孔中，放入37℃和5％CO₂的培养箱内孵育，以上操作步骤均在超净台内完成。在培养基中培养1，3，5和7天后的细胞活力如图4所示。细胞活力采用MTT测试法表征，其结果表明相比于盖玻片和对比例，实施例3，5-7中的样品更有利于细胞的增殖，且实施例5增殖更显著。

神经雪旺细胞接种于实施例3，5-7和对比例1中的纳米纤维神经组织工程支架及盖玻片上，利用24孔打孔器进行各样品的准备，将各样品置于24孔培养板中，以盖玻片作为对照样，将各板置于体积分数为75％的酒精蒸汽缸中进行灭菌处理2h后置于超净工作台备用，利用PBS依次清洗支架以及空白培养板3次，以此除去未挥发的酒精蒸汽。雪旺细胞的种植密度为每孔8×10³个，再将配好的DMEM培养基(89％DMEM，10％胎牛血清，1％双抗)依次加入各孔中，放入37℃和5％CO₂的培养箱内孵育，以上操作步骤均在超净台内完成。培养3天后，进行酒精脱水处理，干燥后用于电镜的拍摄，在培养基中培养3天后细胞的生长状态如图5所示。

神经雪旺细胞接种于实施例3，5-7和对比例1中的纳米纤维神经组织工程支架及盖玻片上，利用24孔打孔器进行各样品的准备，将各样品置于24孔培养板中，以盖玻片作为对照样，将各板置于体积分数为75％的酒精蒸汽缸中进行灭菌处理2h后置于超净工作台备用，利用PBS依次清洗支架以及空白培养板3次，以此除去未挥发的酒精蒸汽。雪旺细胞的种植密度为每孔8×10³个，再将配好的DMEM培养基(89％DMEM，10％胎牛血清，1％双抗)依次加入各孔中，放入37℃和5％CO₂的培养箱内孵育，以上操作步骤均在超净台内完成。培养3天后进行罗丹和4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染料染色，其结果如图6所示，表明相比于盖玻片和对比例，实施例3，5-7中的样品更有利于细胞粘附铺展，细胞形貌较好，且实施例5所述样品更显著。