促进人脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及未分化细胞的培养，具体是一种促进人脐带间充质干细胞向软骨细胞 分化的方法。
【背景技术】
[0002] 由于软骨细胞是终末分化细胞，自我修复的能力有限，因此，外伤或骨关节炎等疾 病所致的软骨缺损的治疗一直是骨科的难题。近年来，随着细胞移植或软骨组织工程技术 的发展，软骨缺损的治疗已取得了一定的进步。自体软骨细胞移植是目前公认的治疗关节 软骨缺损的较有效的方法。但自体软骨细胞移植也有很多缺点:①自体软骨细胞来源困难。 由于自体软骨细胞移植时先要从关节的非负重区取一定大小的软骨块，因此它必然导致供 区新的缺损。②操作过程较繁琐，病人一定要承受两次手术的创伤。③软骨细胞在体外扩增 缓慢，容易发生去分化，即向成纤维细胞分化，从而使新生软骨的性能不良。
[0003]间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)是目前备受关注的一类具有高度自 我更新和多向分化潜能的干细胞，可以分化为中胚层起源的多种组织细胞，比如：成骨细 胞、软骨细胞、脂肪细胞等。MSC的多潜能性和旁分泌特性使其成为再生医学理想的候选细 胞。近年来研究发现，MSC具有较低的免疫原性，还具有抑制免疫细胞的作用，在诱导移植耐 受方面发挥重要作用。MSCs具有细胞来源丰富，损伤轻，可避免体内免疫排斥反应及根据不 同需要进行调控等优点，因此，MSCs是组织工程的重要种子细胞。
[0004] 人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells， hUCMSCs)具有来源丰富、对供者无影响、易于采集和运输、无异体排斥反应、避免伦理争议 等诸多优点，因此hUCMSCs有望成为间充质干细胞的理想来源。
[0005] 牛磺酸（taurine，Tau)是一种含硫的氨基酸，化学名称为β氨基乙磺酸，与其他氨 基酸一样具有酸、碱两性电解质作用，易溶于水，化学性质比较稳定。早在1827年，牛磺酸就 已被人们发现，并成功从牛胆汁中分离获得，自此国内外对牛磺酸进行了深入的研究，发现 它具有广泛的生物学效应。在哺乳动物组织中，蛋氨酸和半胱氨酸代谢的中间产物半胱亚 磺酸经半胱亚磺酸脱羧酶(CSAD)脱羧成亚牛磺酸，再氧化成牛磺酸。
[0006] 牛磺酸广泛存在于动物体各组织器官内，是机体含量最丰富的游离氨基酸之一。 许多高等动物已失去了合成足够的牛磺酸以维持体内牛磺酸整体水平的能力，需要从膳食 中摄取。机体缺乏牛磺酸会引起许多疾病，如心肌病、肾脏机能障碍等牛磺酸对机体的发育 起着重要作用，并且牛磺酸对应激引起的神经元损伤及其他病理疾病具有防护作用，牛磺 酸具有细胞保护作用，并能抑制细胞凋亡。以往的研究发现，敲除牛磺酸转运体(TauT)基因 的小鼠出现细胞变性，并且存在先天性线粒体缺陷、先天性心肌发育缺陷和先天性骨骼肌 发育缺陷，说明牛磺酸对正常发育起着十分重要的作用。
[0007] MSCs体外转化很大程度上依赖于培养条件，寻找合适的培养条件是诱导MSCs向软 骨细胞分化的关键。目前的MSCs分化成软骨细胞的方法所需的周期都较长，并且诱导后Π 型胶原的表达效率较低。
【发明内容】
[0008] 本发明所要解决的技术问题是，提供一种促使用安全，能够提高人脐带间充质干 细胞向软骨细胞分化的能力的促进人脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的方法。
[0009] 为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种促进人脐带间充质干细 胞向软骨细胞分化的方法，包括以下步骤：
[0010] (1)人脐带间充质干细胞的培养:将废弃的人脐带组织剪碎，用质量体积比浓度 0.1 %的二型胶原酶消化成单个的细胞，离心；用间充质干细胞完全培养液重悬细胞，过筛， 收集细胞悬液，于37°c、体积分数为5%0) 2和95%空气、绝对湿度条件下进行培养，每隔1天 换培养液，得高纯度的脐带间充质干细胞；
[0011] (2)向软骨细胞诱导分化:将培养至第3代的脐带间充质干细胞收集并离心，用间 充质干细胞完全培养液重悬细胞接种到底面积为25cm 2培养瓶中，细胞完全铺满瓶底后，培 养液更换为软骨细胞诱导液进行向软骨细胞的分化，细胞分化第1天开始加入O.l-lOmM牛 磺酸，共培养16天即得分化的软骨细胞。
[0012]所述步骤⑵中细胞分化第1天开始加入O.HOmM牛磺酸，每星期换液2次，共培养 16天即得分化的软骨细胞。
[0013] 优选，细胞分化第1天开始加入5mM牛磺酸。
[0014] 本发明的有益效果是:添加的牛磺酸是人体所需的，使用安全;能够提高人脐带间 充质干细胞向软骨细胞分化的能力。
【附图说明】
[0015]图1是培养p〇代和p3代人脐带间充质干细胞光镜图（放大40倍，其中，A为原代培养 P〇代第4天的细胞生长状况，B为原代培养P〇代第8天的细胞生长状况，C为培养P3代时的细胞 生长状况）；
[0016] 图2A为传代培养MSCs的CD34、CD45、CD73和CD105表达率柱状图；
[0017] 图2B为MSCs的CD34表达率图；
[0018] 图2C为MSCs的CD45表达率图；
[0019] 图2D为MSCs的CD73表达率图；
[0020] 图2E为MSCs的CD105表达率图；
[0021]图3A是本发明实施人脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的光镜图（向软骨分化7 天h
[0022]图3B是本发明实施例人脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的光镜图（向软骨细胞 分化14天）；
[0023]图4A是本发明实施例P3代的MSCs和向软骨诱导分化16天的细胞的Real-Time PCR 检测Π 型胶原表达水平图；
[0024]图4B是本发明实施例加入不同浓度牛磺酸向软骨诱导分化16天的细胞的Real-Time PCR检测Π 型胶原表达水平图。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明：
[0026] 本发明的促进人脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的方法，包括以下步骤：
[0027] (1)人脐带间充质干细胞的培养:将废弃的人脐带组织剪碎，用质量体积比浓度 0.1 %的二型胶原酶消化成单个的细胞，离心；用间充质干细胞完全培养液重悬细胞，过筛， 收集细胞悬液，于37°C、体积分数为5%0) 2和95%空气、绝对湿度条件下进行培养，每隔1天 换培养液，得高纯度的脐带间充质干细胞；
[0028] (2)向软骨细胞诱导分化:将培养至第3代的脐带间充质干细胞收集并离心，用间 充质干细胞完全培养液重悬细胞接种到底面积为25cm 2培养瓶中，细胞完全铺满瓶底后，培 养液更换为软骨细胞诱导液进行向软骨细胞的分化，细胞分化第1天开始加入O.l-lOmM牛 磺酸，共培养16天即得分化的软骨细胞。
[0029] 所述步骤(2)中细胞分化第1天开始加入O.l-lOmM牛磺酸，每星期换液2次，共培养 16天即得分化的软骨细胞。
[0030] 优选，细胞分化第1天开始加入5mM牛磺酸。
[0031] 实施例
[0032] 一、人脐带间充质干细胞的培养，具体步骤如下：
[0033]将新获得的废弃的人脐带组织剪碎，用无菌的PBS平衡液充分洗涤残留的血液，纵 向剪开脐带，暴露出2条动脉和1条静脉，钝性分离，仔细剔除出这3条血管和脐带外膜，剥离 Wharton胶，并将其剪碎成小组织块；用质量体积比浓度0.1 %的Π 型胶原酶，37 °C消化3小 时，消化成单细胞，2000r/min离心20分钟，弃上清，用DMEM培养液重悬细胞，1500r/min离心 10分钟；用间充质干细胞完全培养液重悬细胞，过100目筛，收集细胞滤液，置75cm 2培养瓶 中，于37°C、体积分数为5^^02和95%空气、绝对湿度条件下进行培养。每隔1天换1次培养 液，得高纯度的人脐带间充质干细胞(HUC-MSCs)。
[0034]选用传代培养的细胞只需要一次原代培养，而在传代的过程中产生大量的所需要 的MSCs，从而能有效的避免对原代培养细胞来源的限制。
[0035]传代培养MSCs的获取:将上述长到80 %-90 %融合的原代培养MSCs消化并进行传 代培养，消化液组成为0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸二钠。如在37°C、体积分数为 5 % C0