专利名称：一种组织工程骨组织及其制备方法
技术领域：
本发明属于组织工程学技术领域，具体涉及一种组织工程骨组织及其制备方法。
背景技术：
组织工程是二十一世纪生命科学一大热点。它的核心内容是体外细胞三维培养，它的基本方法是将种子细胞与可降解生物材料组成复合体，替代受损组织器官。目前，国内外骨组织替代品主要釆用自体骨，约占70%。异种骨中相对成功的是一些完全去除骨有机成分的骨矿材料，如KEIL骨，BIOOSS骨、无机骨，以及完全去除骨矿成分的有机成分材料，如脱钙骨，骨基质明胶等。前者不含有机成分，因而疏松易碎，不具备基本机械强度；后者缺乏骨矿，因而质地 柔软，不具备基本力学刚度。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供了一种具有良好力学性能、生物相容性能和毒理学性能的新型组织工程骨组织。本发明所采用的技术方案是:
一种组织工程骨组织，其特征在于:所述组织工程骨组织由塑形的皮质骨支架材料构建的骨皮质框架和其中空部位填塞的松质骨组成，所述塑形的皮质骨支架材料是根据所需修复骨缺损的具体形态进行。所述的组织工程骨组织的制备方法，其特征在于包括如下步骤:
1)提取并在体外扩增患者自体MSC，制成种子细胞；
2)将上述种子细胞接种于柔软的松质骨支架材料上，构建组织工程化松质骨；
3)构建组织工程化骨三维计算机辅助设计重构模型；
4)利用皮质骨支架材料个体化构建组织工程化骨皮质骨框架；
5)将上述组织工程化松质骨充填入皮质骨框架内构建完整的组织工程化骨组织。具体步骤如下:
O体外分离、培养骨髓间质干细胞:
抽取患者自体骨髓分离，提取有核细胞，PBS+EDTA清洗。置于纤维连接蛋白包被培养皿，加入DMEM培养液37°C含5% 二氧化碳培养箱。两天后去除未贴壁细胞，DMEM培养液培养。传代培养:当细胞融合到60%_75%密度时，用无钙镁PBS冲洗，经胰酶消化后，加入含胎牛血清的DMEM培养液终止消化，移入离心管中，离心。弃去上清液，加入含DMEM牛血清的DMEM培养液，混勻，计数，按比例传代培养。2-3日换培养液，细胞融合至60%-75%密度时，再传代培养。2〕将骨髓间质干细胞接种于松质骨支架材料，体外培养后,构建组织工程化松质骨。3)皮质骨骼三维重构CT扫描得到骨骼每隔一定距离的各断面灰度图像。采用重构软件对病变骨骼进行三维计算机辅助设计重构。通过对比度增强、阈值化、轮廓编辑、三维区域增长、平滑处理、三维编辑等处理，获得病变骨骼皮质骨的三维CAD重构模型。所述模型可输出成STL文件，供快速成型机直接加工实物模型；还可生成IGES格式，输入三维CAD软件中进一步分析、修改，最后生成数控指令，控制机床进行数控加工。4)塑形支架材料
首先对各类皮质骨替代材料置入预先制作的模框中，用骨水泥粘合成一个整体，得到所需的基材，包括板材和棒料。所得到的基材基本可保持材料固有的孔隙率，并具有较高的机械强度和可加工性能。本发明釆用骨水泥作为粘结剂具有良好生物相容性、骨传导作用和生物降解性。本发明根据CT重构得到的数据可直接用CNC将基材加工成所需形状。本发明还利用快速成形法先进行构建模具，再将颗粒状材料和粘和剂灌注入模具，从而得到各类不同形状的基材。5)将接种有MSC的松质骨直接填塞入组织工程化皮质骨框架中，构建个体化的组织工程化骨。所述组织工程化骨与正常骨组织相似，具有皮质骨、松质骨及细胞成分。本发明技术方案带来的有益效果是:
I)本发明组织工程化骨组织具有与正常骨组织相似的皮质骨、松质骨及细胞成分。临床应用中，医师可根据患者的CT片预先测定手术切除范围，并按缺损部分的CT重构数据对组织工程化骨支架材料进行塑形，从而实现个体化治疗。2)本发明孔隙率> 90%，与现有技术相比具有更好的生物降解性能和物理力学性能，具有良好的三维连通、微孔、网状微观结构，能全面满足组织工程的基本要求。
具体实施方式
:
下面通过实施例进一步描述本发明，但本发明并不仅限于此。实施例1:
O体外分离、培养骨髓间质干细胞:
抽取患者自体骨髓10ml，分离，提取有核细胞，PBS+EDTA清洗2次。置于纤维连接蛋白包被培养皿，加入DMEM培养液37°C含5% 二氧化碳培养箱。两天后去除未贴壁细胞，DMEM
培养液培养。传代培养:当细胞融合到60%_75%密度时，用无钙镁PBS冲洗，经胰酶消化后，加入含胎牛血清的DMEM培养液终止消化，移入离心管中，离心。弃去上清液，加入含DMEM牛血清的DMEM培养液，混勻，计数，按1:2比例传代培养。2-3日换培养液，细胞融合至60%_75%密度时，再传代培养。2〕将骨髓间质干细胞接种于松质骨支架材料，体外培养后,构建组织工程化松质 骨。 3 )皮质骨骼三维重构
CT扫描得到骨骼每隔一定距离的各断面灰度图像。采用重构软件对病变骨骼进行三维计算机辅助设计重构。通过对比度增强、阈值化、轮廓编辑、三维区域增长、平滑处理、三维编辑等处理，获得病变骨骼皮质骨的三维CAD重构模型。所述模型可输出成STL文件，供快速成型机直接加工实物模型；还可生成IGES格式，输入三维CAD软件中进一步分析、修改，最后生成数控指令，控制机床进行数控加工。4)塑形支架材料
首先对各类皮质骨替代材料置入预先制作的模框中，用骨水泥粘合成一个整体，得到所需的基材，包括板材和棒料。所得到的基材基本可保持材料固有的孔隙率，并具有较高的机械强度和可加工性能。根据CT重构得到的数据可直接用CNC将基材加工成所需形状。5)将接种有MSC的松质骨直接填塞入组织工程化皮质骨框架中，构建个体化的组织工程化骨。所述组 织工程化骨与正常骨组织相似，具有皮质骨、松质骨及细胞成分。
权利要求
1.一种组织工程骨组织，其特征在于:所述组织工程骨组织由塑形的皮质骨支架材料构建的骨皮质框架和其中空部位填塞的松质骨组成，所述塑形的皮质骨支架材料是根据所需修复骨缺损的具体形态进行。
2.如权利要求1所述的组织工程骨组织的制备方法，其特征在于包括如下步骤: 1)提取并在体外扩增患者自体MSC，制成种子细胞； 2)将上述种子细胞接种于柔软的松质骨支架材料上，构建组织工程化松质骨； 3)构建组织工程化骨三维计算机辅助设计重构模型； 4)利用皮质骨支架材料个体化构建组织工程化骨皮质骨框架； 5)将上述组织工程化松质骨充填入皮质骨框架内构建完整的组织工程化骨组织。
全文摘要
本发明公布了一种组织工程骨组织及其制备方法，其特征在于所述组织工程骨组织由塑形的皮质骨支架材料构建的骨皮质框架和其中空部位填塞的松质骨组成，所述塑形的皮质骨支架材料是根据所需修复骨缺损的具体形态进行。本发明组织工程化骨组织具有与正常骨组织相似的皮质骨、松质骨及细胞成分。临床应用中，医师可根据患者的CT片预先测定手术切除范围，并按缺损部分的CT重构数据对组织工程化骨支架材料进行塑形，从而实现个体化治疗。
文档编号A61F2/28GK103156710SQ201110417698
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月14日 优先权日2011年12月14日
发明者孙叶芳 申请人:西安瑞捷生物科技有限公司