专利名称：靶向抗膀胱癌白蛋白载丝裂霉素药物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种靶向抗膀胱癌白蛋白载丝裂霉素药物及其制备方法，具体说是一种分子中含有抗人膀胱癌单克隆抗体、白蛋白和丝裂霉素的药物及其制备方法。
背景技术：
膀胱癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁着人们的生命和健康，其中90%以上是尿路上皮癌(移行)细胞癌(transitional cell carcinoma, TCC),其中约10%最终发展为肌层浸润性或转移性膀胱癌，远期疗效不佳，由于其较高的发病率及复发率，膀胱灌注化疗对于非肌层浸润性膀胱是主要治疗方法之一。目前膀胱灌注化疗药物有丝裂霉素(简称MMC)、喜树碱、吡柔吡星、表柔比星及柔红霉素等多种。膀胱癌高复发率原因之一是对抗癌药物耐药性的产生，体外实验证实这些药物对癌细胞有明显杀伤作用，但由于其选择性太差，在杀伤癌细胞的同时也杀伤大量的正常细胞，且其有效剂量与毒性剂量往往很接近，容易出现并发症，影响病人的生活质量，如何实现化疗药物对肿瘤细胞的特异性杀伤成为提高药物治疗效果的可能途径。靶向药物的出现，大大降低了药物的副作用。所谓靶向药物治疗就是使药物瞄准肿瘤部位，在局部保存相对高的浓度，延长药物的时间，提高对肿瘤的杀伤力，而对正常组织细胞作用较小。丝裂霉素是从头状链霉菌培养液中分离提取的一种广谱抗肿瘤抗生素，对多种癌症有抗癌作用，其作用原理可使细胞的DNA解聚，同时阻碍DNA的复制，从而抑制肿瘤细胞分裂。丝裂霉素为细胞周期非特异性药物，其抗肿瘤谱较广，作用迅速，但治疗指数不高，毒性较大。因此通过对丝裂霉素进行改性，制成靶向药物来降低它的副作用，成为研究的热点
发明内容
本发明的目的是提供一种靶向抗膀胱癌白蛋白载丝裂霉素药物及其制备方法，通过乳化热固化法用戊二醛为交联固化剂，把丝裂霉素分子载在白蛋白分子上，制备成280 350nm白蛋白载丝裂霉素(MMC-NS)纳米微球，然后用异型双功能连接剂N-琥珀酰亚胺基-3- (2-毗啶基二琉)丙酸酯(STOP)使白蛋白载丝裂霉素分子连接上吡啶二硫基基团，得到MMC-NS-PDP分子，最后MMC-NS-PDP与BD1-1-SH分子反应，得到具有靶向性和缓释功能的抗膀胱癌药物，本发明的抗膀胱癌药物对膀胱癌有特异靶向性，降低了丝裂霉素的副作用，药物对肿瘤细胞杀伤力强，药效持久，且对正常组织细胞作用小。本发明的技术方案如下
靶向抗膀胱癌白蛋白载丝裂霉素药物及其制备方法，其特征是药物分子中含有白蛋白分子、抗人膀胱癌单克隆抗体(BD1-1)和丝裂霉素(MMC)，合成方法是用戊二醛为交联固化剂，把丝裂霉素分子与牛血白蛋白分子结合，制成粒径为280 350纳米的白蛋白载丝裂霉素(MMC-NS)纳米微球，然后用异型双功能连接剂N-琥珀酰亚胺基-3- (2-毗啶基二琉)丙酸酯使白蛋白载丝裂霉素分子连接上吡啶二硫基基团，得到MMC-NS-PDP分子，最后MMC-NS-PDP与BD1-1-SH分子反应，得到分子中含有抗人膀胱癌单克隆抗体、白蛋白分子和丝裂霉素的药物，即靶向抗膀胱癌白蛋白载丝裂霉素药物，英文缩写为BD1-1-MMC-NS。所述的白蛋白载丝裂霉素(MMC-NS)纳米微球的制备方法为
(al)用生理盐水溶解牛血白蛋白，配置成每毫升含O. 15 O. 25g的牛血白蛋白溶液，用牛血白蛋白溶液溶解丝裂霉素，配置成每毫升含O. 06 O.1OmgMMC的MMC牛血白蛋白溶液；
(a2 )按照体积比，环己烷乳化剂MMC牛血白蛋白溶液为100:3. O 4. O: O. 5，把物料放入反应器中，用搅拌器搅拌均匀；用功率为200 400W的超声波乳化15min，加入戊二醛饱和甲苯溶液，加入量按照环己烷的体积计算，环己烷戊二醛饱和甲苯溶液为100:2，在20 40°C下搅拌反应2h，反应完成后把反应器内的所有物料放入离心机，在2000 4000r/min的转速下离心2min,弃去沉积的大微球,然后在500 800r/min转速下离心3min，得到所需要的纳米微球，用环己烷洗涤纳米微球，洗涤后的纳米微球加入丙酮和乙醇胺，常温搅拌lh，过滤，所得固体用异丙醇洗涤，再用丙酮洗涤，最后用冻干机冻干，得到MMC-NS冻干粉，粒径为280 350nm。所述的MMC-NS-PDP的制备方法为
(bl)用O.Olmol/L的无菌PBS缓冲溶液(即磷酸盐缓冲溶液)溶解MMC-NS，使每毫升含MMC-NS 2 3mg，与SPDP无水乙醇溶液混合，常温搅拌反应30min，投料摩尔比为SPDP:MMC-NS=20:1 ;用离心机离心，得到沉淀；
(b2)用O. 01mol/L的无菌PBS缓冲溶液与沉淀混合均匀，用离心机离心，得到沉淀；(b3)重复步骤(b2)三次，以除去多余的SPDP，得到纯净的MMC-NS-PDP，用0. 02 mo I /L无菌PBS缓冲液溶解，配置成2. 5mg/ml的MMC-NS-PDP溶液。
`
所述的BD1-1-SH为BD1-1与SPDP反应，BD1-1分子引入吡啶二硫基(PDP)，得到BD1-1-PDP，然后用二硫苏糖醇(DTT)还原得到巯基，即为BD1-1-SH。所述的靶向抗膀胱癌白蛋白载丝裂霉素药物(BD1-1-MMC-NS)的其制备方法，步骤为用0. 02 mo I / L无菌PBS缓冲液溶解BD1-1-SH，配置成每毫升含Img的BD1-1-SH，等体积加入b3步骤得到的2. 5mg/ml的MMC-NS-PDP溶液，在4 10°C下搅拌16 20h，然后在10000 15000r/min下离心30s 15min,取沉淀用0. 02 mo I / L无菌PBS离心洗漆3 4次，得到的沉淀物即为BD1-1-MMC-NS。所述的乳化剂为span40、span60、span80、span83和span85中的一种或它们的组合物。本发明的优点是1.本发明采用乳化热好固化法，同时使用超声乳化技术，得到的白蛋白载丝裂霉素粒径为280 350nm，纳米微球大小均匀，分散性好，表面光滑，对药物的靶向特异性有非常积极的作用。2.本发明通过丝裂霉素与白蛋白偶联固化，把丝裂霉素载在白蛋白上，使丝裂霉素缓慢释放，使药物的作用时间延长，减少副作用。3.本发明用抗人膀胱癌单克隆抗体(BD1-1)与白蛋白载丝裂霉素偶联制成靶向药物，使制成的药物对肿瘤细胞的选择性更强，绝大部分药物只靶向结合膀胱癌细胞，释放出丝裂霉素，杀死癌细胞，而不损害正常的膀胱粘膜细胞。
图1为单个MMC-NS药物放大20万倍的扫描电镜 图2为形状规则、分散性良好的MMC-NS药物放大15万倍扫描电镜 图3为MMC-NS药物的粒径分布图，纳米微球的粒径测试结果粒径=314. 18±31· 093nm ；
图4为MMC-NS纳米微球与EJ人膀胱癌细胞图，从图中看出，MMC-NS很少与EJ人膀胱癌细胞结合，扫描电镜可见肿瘤细胞表面有丰富的突起和微绒毛；
图5为靶向抗膀胱癌白蛋白载丝裂霉素药物(BD1-1-MMC-NS)与EJ人膀胱癌细胞结合图，从图中看出，BD1-1-MMC-NS与EJ人膀胱癌细胞结合得很好，BD1-1-MMC-NS把肿瘤细胞大部分覆盖了，扫描电镜可见肿瘤细胞表面突起和微绒毛明显减少，说明BD1-1-MMC-NS对肿瘤细胞有非常好的杀伤力。
具体实施例方式实施例1 本发明的靶向抗膀胱癌白蛋白载丝裂霉素药物的制备包括如下步骤
a.白蛋白载丝裂霉素(MMC-NS)纳米微球的制备
(al)用生理盐水溶解牛血白蛋白，配置成每毫升含O. 15g的牛血白蛋白溶液，用牛血白蛋白溶液溶解丝裂霉素，配置成每毫升含O. 06mgMMC的MMC牛血白蛋白溶液；
(a2) IOOml环己烷、3. 0mlspan40和O. 5mlMMC牛血白蛋白溶液放入三口烧瓶中，用搅拌器搅拌均匀；用功率为200W的超声波乳化15min，加入2ml戊二醛饱和甲苯溶液，20°C下搅拌反应2h,把物料放入离心机,在2000r/min的转速下离心2min,弃去沉积的大微球,然后在500r/min转速下离心3min，得到所需要的纳米微球，用环己烷洗涤纳米微球，加入丙酮，加入适量乙醇胺，常温搅拌lh，过滤，固体用异丙醇洗涤，再用丙酮洗涤，最后用冻干机冻干，得到MMC-NS冻干粉，粒径为280 350纳米；
b.MMC-NS-PDP 的制备
(bl)用O. 01mol/L的无菌PBS缓冲溶液溶解MMC-NS，使每毫升含MMC-NS 2mg,与SPDP无水乙醇溶液混合，常温搅拌反应30min，投料摩尔比为SPDP:MMC-NS=20:1 ;离心，得到沉淀；
(b2)用O. 01mol/L的无菌PBS缓冲溶液与沉淀混合均匀，用离心机离心，得到沉淀；(b3)重复步骤(b2)三次，以除去多余的SPDP，得到纯净的MMC-NS-PDP，用O. 02 mo I /L无菌PBS缓冲液溶解，配置成2. 5mg/ml的MMC-NS-PDP溶液；
c.BD1-1-MMC-NS 的制备
用0.02 mo I / L无菌PBS缓冲液溶解BD1-1-SH，配置成每毫升含Img的BD1-1-SH，等体积加入b3步骤得到的2. 5mg/ml的MMC-NS-PDP溶液，在4°C下搅拌20h，然后在15000r/min下离心30s,取沉淀用0. 02 mo I / L无菌PBS离心洗漆3_4次，得到的沉淀物即为BD1-1-MMC-NSo实施例2
步骤与实施例1相同，只是把(al)步骤的生理盐水配置成的蛋白质浓度为0. 20g/ml,配置成每毫升含O. 07mgMMC的MMC牛血白蛋白溶液；(a2)步骤的乳化剂改为3.6ml span80，超声波的功率为300W, 3000r/min下去大微球,600r/min下得到要求的纳米微球；(bl)步骤每毫升含MMC-NS 2. 5mg ；c步骤改为6°C下搅拌18h，离心转速为12000r/min，时间为IOmin,得到大小均匀，分散性好，二联体药物BD1-1-MMC-NS。实施例3
步骤与实施例1相同，只是把(al)步骤的生理盐水配置成的蛋白质浓度为O. 30g/ml,配置成每毫升含O. 08mgMMC的MMC牛血白蛋白溶液；(a2)步骤的乳化剂改为4. Oml span83，超声波的功率为400W, 2000r/min下去大微球,600r/min下得到要求的纳米微球；(bl)步骤每毫升含MMC-NS 2. 5mg ；c步骤改为6°C下搅拌18h，离心转速为10000r/min，时间为15min,得到大小均匀，分散性好，二联体药物BD1-1-MMC-NS。实施例4
步骤与实施例1相同，只是把(al)步骤的生理盐水配置成的蛋白质浓度为O. 30g/ml,配置成每毫升含O.1OmgMMC的MMC牛血白蛋白溶液；(a2)步骤的乳化剂改为3.8ml span85，超声波的功率为400W,4000r/min下去大微球,800r/min下得到要求的纳米微球；(bl)步骤每毫升含MMC-NS 3mg ；c步骤改为10°C下搅拌16h，离心转速为14000r/min，时间为60s，得到大小均匀，分散性好，二联体药物BD1-1-MMC-NS。应用实施例1
本发明的靶向抗膀胱癌白蛋白载丝裂霉素药物治疗裸小鼠皮下EJ人膀胱癌细胞移植瘤的研究，试验方法如下1.裸小鼠膀胱癌皮下瘤模型的建立取已传代3 4代的EJ人膀胱癌细胞以PBS液配置成细胞悬液进行接种，接种细胞浓度为I X 10 Vml每只裸小鼠接种量为O. 2ml。接种前以碘伏消毒裸小鼠皮肤，应用I ml注射器抽取细胞悬液，接种于裸小鼠左前腋部皮下，观察接种部位有无溢出、肿瘤生长及荷瘤裸小鼠的一般状况。待2周后可明显触及皮下瘤，无菌操作切下，同上方法在裸小鼠皮下传代两次。成瘤后，再分组治疗。取下皮下瘤，切成厚度O. 2cm薄片，再用自制的内直径O. 12cm的不锈钢管,统一规格下压切成面积约O. 045cm2的肿块，确保每只小鼠接种部位的肿瘤细胞数量一致，用自制套管针传送接种于实验用裸小鼠左侧肩部，连续观察肿瘤的生长情况。待肿瘤平均直径达到O. 8cm时，将裸小鼠随机分组，给予化疗药物进行实验。持续观察，称量体重，用游标卡尺测量皮下瘤肿瘤体积大小。SPF级饲养室饲养，裸小鼠饮用的灭菌蒸馏水及辐照饲料均由广西医科大学实验动物中心提供。操作均遵守动物伦理学条例。2.皮下瘤实验为组随机将20只4 6周龄，体重相近，雌性裸小鼠分成4组。于左前肩背部皮下种植体积相同大小的瘤块，种植10天后可达到直径8_皮下瘤，分组实验。其中以含MMC有效剂量2. 5mg / kg给予瘤内注射，为了使药液完全渗透肿瘤组织，一半剂量被注入肿瘤中央，另一半则在瘤周。分组如下①.空白对照组(5只):瘤内注射无菌PBS O. 15ml/ 次；@ . MMC 组(5 只):瘤内注射 O. 2mg/ml 丝裂霉素 O. 15ml/ 次. MMC-NS组(5只)瘤内注射O. 2mg/ml丝裂霉素白蛋白微球O. 15ml/次；④· BD1-1-MMC-NS组(5只):瘤内注射O. 2mg/ml膀胱癌单克隆抗体 与丝裂霉素白蛋白微球的二联体O. 15ml/次；以上操作均每3天一次，共治疗30天，实验结束。3.肿瘤体积测定每周测量肿瘤直径，计算体积，实验结束时，将裸小鼠用颈椎脱臼法处死，切取瘤体称湿重，统计各组肿瘤体积、重量的差异，计算肿瘤抑制率。绘制裸小鼠皮下移植瘤生长曲线图分组治疗后每周用游标卡尺检测各组小鼠肿瘤的最长径a值和最短径b值，根据公式计算出小鼠肿瘤体积。第I次用药时间记为O天，以时间(d)为横坐标，每组动物肿瘤体积的均数为纵坐标,绘制肿瘤生长曲线。v=l/2ab2
(注V-体积；a_肿瘤长径；b_肿瘤短径；式中体积为平均体积)
抑瘤率=(对照组肿瘤体积-实验组肿瘤体积)/对照组肿瘤体积*100 %
4.裸小鼠皮下瘤的给药方法及裸小鼠皮下瘤模型的观测用Iml注射器在皮下瘤的远端正常皮肤进针，在皮下潜行一段后，刺入瘤体，缓慢注射给药。腋下接种I周后裸小鼠皮下出现米粒大小结节，2周后裸小鼠皮下出现绿豆大小的白色结节，质硬，活动度差，即为皮下种植瘤。
`
5.标本的收集手术开始时，即对各组小鼠进行精神状态、饮食、大小便、腹部情况等严密观察。于荷瘤裸小鼠皮下瘤模型治疗后一月，颈椎脱白法处死裸小鼠，切取皮下肿瘤观察其大体形态，浸入等渗盐水漂洗干净，测量各组肿瘤体积。将瘤块浸泡到10%的福尔马林溶液中。6.统计学处理:计量资料以￡ ±s表示，采用SPSS 13. O统计软件对结果单因素方差分析。检验水准α =0. 05，以Ρ〈0. 05作为有显著性差异的标准；P<0. 01认为差异有非常显著性。实验结果1.皮下瘤组的实验结果
分组治疗后对照组裸小鼠皮下瘤肿瘤生长迅速，BD1-1-MMC-NS组肿瘤生长明显减慢，部分肿瘤停止生长，少数肿瘤缩小，但未出现肿瘤消退。BD1-1-MMC-NS组抑瘤显著，肿瘤体积明显小于其他三组(见表1，图1)。表I实验期间每周测量皮下瘤计算瘤体积(土s，η=5)
权利要求
1.靶向抗膀胱癌白蛋白载丝裂霉素药物的制备方法，其特征是药物分子中含有白蛋白分子、抗人膀胱癌单克隆抗体(BD1-1)和丝裂霉素(MMC)，合成方法是用戊二醛为交联固化剂，把丝裂霉素分子与牛血白蛋白分子结合，制成粒径为280 350纳米的白蛋白载丝裂霉素(MMC-NS)纳米微球，然后用异型双功能连接剂N-琥珀酰亚胺基-3- (2-毗啶基二琉)丙酸酯使白蛋白载丝裂霉素分子连接上吡啶二硫基基团，得到MMC-NS-PDP分子，最后MMC-NS-PDP与BD1-1-SH分子反应，得到分子中含有抗人膀胱癌单克隆抗体、白蛋白分子和丝裂霉素的药物，即靶向抗膀胱癌白蛋白载丝裂霉素药物，英文缩写为BD1-1-MMC-NS。
2.根据权利要求1所述的靶向抗膀胱癌白蛋白载丝裂霉素药物的制备方法，其特征在所述的白蛋白载丝裂霉素(MMC-NS)纳米微球的制备方法为(1)用生理盐水溶解牛血白蛋白，配置成每毫升含O.15 O. 25g的牛血白蛋白溶液，用牛血白蛋白溶液溶解丝裂霉素，配置成每毫升含O. 06 O.1OmgMMC的MMC牛血白蛋白溶液；(2)按照体积比，环己烷乳化剂MMC牛血白蛋白溶液为100:3.O 4.0:0. 5，放入反应器中，用搅拌器搅拌均匀；用功率为200 400W的超声波乳化15min，加入戊二醛饱和甲苯溶液，加入量按环己烷的体积比计算，环己烷戊二醛饱和甲苯溶液100:2，在20 40°C下搅拌反应2h，反应完成后的所有物料放入离心机，在2000 4000r/min的转速下离心2min,弃去沉积的大微球,然后在500 800r/min转速下离心3min,得到所需要的纳米微球，用环己烷洗涤纳米微球，洗涤后的纳米微球加入丙酮和乙醇胺，常温搅拌lh，过滤，所得固体用异丙醇洗涤，再用丙酮洗涤，最后用冻干机冻干，得到MMC-NS冻干粉，粒径为280 350nmo
3.根据权利要求1所述的靶向抗膀胱癌白蛋白载丝裂霉素药物的制备方法，其特征是所述的MMC-NS-PDP的制备方法为(1)用O.01mol/L的无菌PBS缓冲溶液溶解MMC-NS，使每毫升含MMC-NS 2 3mg，与SPDP无水乙醇溶液混合，常温搅拌反应30min，投料摩尔比为SPDP:MMC_NS=20:1 ;用离心机离心，得到沉淀；(2)用O.01mol/L的无菌PBS缓冲溶液与沉淀混合均匀，用离心机离心，得到沉淀；(3)重复步骤(2)三次，以除去多余的SPDP，得到纯净的MMC-NS-PDP，用O.02 mo I / L无菌PBS缓冲液溶解，配置成2. 5mg/ml的MMC-NS-PDP溶液。
4.根据权利要求1所述的靶向抗膀胱癌白蛋白载丝裂霉素药物的制备方法，其特征在于所述的BD1-1-SH为BD1-1与SPDP反应，BD1-1分子引入吡啶二硫基(PDP)，得到BD1-1-PDP，然后用二硫苏糖醇(DTT)还原得到巯基，即为BD1-1-SH。
5.根据权利要求1所述的靶向抗膀胱癌白蛋白载丝裂霉素药物的制备方法，其特征是用0.02 mo I / L无菌PBS缓冲液溶解BD1-1-SH，配置成每毫升含Img的BD1-1-SH，等体积加入b3步骤得到的2. 5mg/ml的MMC-NS-PDP溶液，在4 10°C下搅拌16 20h，然后在10000 15000r/min下离心30s 15min,取沉淀用0. 02 mo I / L无菌PBS离心洗漆3 4次，得到的沉淀物即为BD1-1-MMC-NS。
6.根据权利要求2所述的靶向抗膀胱癌白蛋白载丝裂霉素药物的制备方法，其特征在于所述的乳化剂为span40、span60、span80、span83和span85中的一种或它们的组合物。
7.权利要求书所述的靶向抗膀胱癌白蛋白载丝裂霉素药物的制备方法得到的产品。
全文摘要
本发明公开了一种靶向抗膀胱癌白蛋白载丝裂霉素药物及其制备方法，其特征是药物分子中含有白蛋白分子、抗人膀胱癌单克隆抗体(BDI-1)和丝裂霉素(MMC)，其合成方法是用戊二醛为交联固化剂，把丝裂霉素分子与牛血白蛋白分子结合，制成粒径为280～350纳米的白蛋白载丝裂霉素(MMC-NS)纳米微球，然后用异型双功能连接剂N-琥珀酰亚胺基-3-(2-毗啶基二琉)丙酸酯(SPDP)使白蛋白载丝裂霉素分子连接上吡啶二硫基基团(PDP)，得到MMC-NS-PDP分子，最后MMC-NS-PDP与BDI-1-SH分子反应，得到分子中含有抗人膀胱癌抗体、白蛋白分子和丝裂霉素的药物，即靶向抗膀胱癌白蛋白载丝裂霉素药物，英文缩写为BDI-1-MMC-NS。本发明的药物对膀胱癌有很强的靶向性，对膀胱癌的杀伤力强，而对正常组织细胞作用较小。
文档编号A61K47/42GK103041401SQ201210550539
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月18日 优先权日2012年12月18日
发明者李云龙, 周红华 申请人:李云龙, 周红华