海参中皂苷类化合物echinosideA在制备肿瘤拓扑异构酶Ⅱ抑制剂中的应用的制作方法

专利名称：：海参中皂苷类化合物echinosideA在制备肿瘤拓扑异构酶Ⅱ抑制剂中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医药
技术领域：
，是从海洋动物黑乳海参中分离到的一种海参三萜皂苷类化合物echinosideA用于制备肿瘤拓扑异构酶II抑制剂的新用途及其制备方法。
背景技术：
：黑乳海参(/fo/o/ton'flwoM"Selenka)是一种大量生长于我国福建东山到海南岛海域的海参纲动物，属海参科海参属大型种，体长一般30cm,宽约6cm，体宽而厚，两端钝圆。黑乳海参是重要的食用海参之一(廖玉麟编著，中国动物志，棘皮动物门，海参纲.北京:科学出版社，1997,121-122〕，民间也常作为药用，具有滋补及治疗妇女病等功用。echinosideA是一种海参三萜皂苷类化合物，KitagawaI等人最早从棘辐肛参中分离得到了echinosideA，发现它具有抗真菌活性(KitagawaI,KobayashiM,InamotoT,FuchidaM,KyogokuY.Marinenaturalproducts,XIV.StructureofechinosideAandB，antiftmgallanostane-oligosidesfromtheseacucumberac/"wop;ygaec//""es(JAEGER).CAew.TVzar附_6w〃.1985,3(12):5214-24〕。后来EnomotoY等人发现它能对豚鼠房肌和乳突状肌产生正性变力作用(EnomotoY,ItoK，KawagoeY,MorioY，YamasakiY.Positiveinotropicactionofsaponinsonisolatedatrialandpapillarymusclesfromtheguinea-pig.5r/P/iar附aco/.1986,88(1):259-67);后来研究发现它能影响心肌膜的C^+通透性和1^+-(^2+交换能力；能与脂质体作用，并且以胆固醇作为主要结合位点，能够剂量依赖性和时间依赖性地诱导肝金属硫蛋白活性，产生肝保护作用(YamasakiY,ItoK，EnomotoY,Sutko几.AlterationsbysaponinsofpassiveCa2+permeabilityandNa+-Ca2+exchangeactivityofcaninecardiacsarcolemmalvesicles.5/—y"血1987，12;897(3):481-7;YuBS,JoIH.Interactionofseacucumbersaponinswithmultilamellarliposomes.C7je附胸//她nj".1984，52(2):185-202)。A.M.Popov报道echinosidesA具有细胞毒活性、溶血活性和调整膜通透性〈乍用〔A.M.Popov.AComparativeStudyoftheHemolyticandCytotoxicActivitiesofTriterpenoidsIsolatedfromGinsengandSeaCucumbers.5w〃eH"，2002，29(2):120-128)。闫冰等人从糙海参(//0/0//1^'"化a6raJaeger)中也分离得到echinosideA，发现它对稻瘟霉的最小活性浓度〈7.9pg/L，对MKN-45人胃癌肿瘤细胞和HCT-116人肠癌肿瘤细胞的细胞毒活性IC5。值分别为1.86和1.98pmol/L(闫冰，李玲，易杨华，汤海峰，孙鹏，张淑瑜，糙海参中三萜皂苷活性成分的研究，第二军厘丈学学瓶2005，26(6):623-631)。拓扑异构酶II(TopoII)是一种真核生物生存所必需的泛酶，在肿瘤细胞DNA复制和细胞分裂中起着重要作用，是抗癌药物的重要作用耙点，目前许多临床一线抗肿瘤药如阿霉素、依托铂苷等都是拓扑异构酶n抑制剂。迄今未见有关从黑乳海参中提取分离到echinosideA的报道，也未见有关echinosideA具有抑制肿瘤拓扑异构酶II活性的报道。本发明的目的之一是提供一种以黑乳海参为原料制备化合物echinosideA的新方法；目的之二是对化合物echinosideA提供一种制备肿瘤TopoII抑制剂的新用途。本发明从生长于中国福建东山海域的黑乳海参中提取分离到一种海参皂苷类化合物echi加sideA，其化学结构式如下1).提取将黑乳海参干品粉碎，按常规用50%~90%乙醇浸泡提取，浓縮提取液，得到流浸膏。将流浸膏均匀分散于水中，依次用石油醚、水饱和正丁醇分别萃取。将正丁醇萃取液浓縮至干，得总皂苷提取物。2)分离将上述总皂苷提取物进行硅胶柱层析，以氯仿甲醇水=8~6.5:2~3.5:l混合溶剂洗脱，薄层色谱检测，收集含有皂苷的流分，再经过ds反相柱层析，以甲醇水=65:35洗脱，薄层层析检测，收集含有echinosideA的流分，浓縮至干，得到echinosideA。2.echinosideA的结构鉴定经多种现代光谱分析，特别是综合应用多种先进的二维核磁共振波谱的解析，确定了echinosideA的化学结构和立体构型。
发明内容本发明化合物的制备方法和结构鉴定如下:1.制备echinosideAechinosideA为无色结晶性粉末，熔点203~205°C(MeOH-H20)，分子式C54H87026SNa;^-12.3°(c=0.2，MeOH)，Liebermann-Burchard反应和Molish反应均呈阳性。电喷雾阳离子质谱ESI-MS+zw/z:1229[M+Na]+;电喷雾阴离子质谱ESI-MS—1183[M-Na]—;高分辨质谱HRESI-MS+中准分子离子峰提供的精确分子量1229.5017[M+Na]+(Calc.Mass1229.5002)。IR(KBr)cm":3416(羟基)，1740(羰基)，1637(双键)，1256，1070(硫酸酯基)。BCNMR与'HNMR数据见表1。以三氟醋酸水解皂苷后得到组成皂苷糖链的单糖，将其制备成糖腈乙酸酯衍生物，进行气相色谱-质谱联用分析，经与标准糖的糖腈乙酸酯衍生物对照，确定echinosideA的糖链由D-木糖、Z)-奎诺糖、D-葡萄糖和3-氧甲基-D-葡萄糖组成，比例为l:i:i:i。表1.echinosideA苷元和糖链部分的13CNMR与^NMR数据_<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>2239.71.882322.21.522438.91.172528.11.532622.50.86(3H,s)2722.50.87(3H,s)3016.71.04(3H,s)3127.91.24(3H,s)3220.01.67(3H，s)Xyl:木糖；Glc:Qui:奎诺糖；葡萄糖；3-OMeGlc:3-氧甲基-D-葡萄糖；偶合常数本发明化合物echinosideA的肿瘤T叩oII抑制活性测定本发明进行了系统的体外抗肿瘤分子机制研究，采用T叩oII介导的kDNA去连环反应，对echinosideA进行了TopoII抑制活性的测定。材料与方法动质体DNA(KinetoplastDNA，kDNA)和拓扑异构酶II为美国TopoGEN(PortOrange,FL，USA)公司产品。实验分组如下1.标准品对照组(电泳图谱中用DNAstd表示)，反应体系中不含TopoII;2.阴性对照组(电泳图谱中用NoDrug和1%DMSO表示)；3.阳性对照组(电泳图谱中用VP16表示)，阳性药为依托泊苷；4.本发明化合物echinosideA不同浓度组(echinosideA)，由高到低设4个浓度组，浓度分别为125，25，5和ljiM。反应体系总体积为15pl，溶剂为水，含50mMTris.HCl(pH7.7)，50mMKC1，5mMMgCl2，1mMATP，0.5mMDTT，0.5mMEDTA，50mg/mlBSA，20ngkDNA，2unitsTopoII和相应浓度的待测化合物。将各反应体系置37°C水浴15min后，反应混合物中加入2^10%SDS终止反应；按常规1%琼脂糖凝胶电泳1h，电泳缓冲液为1TAE(40mMTris碱，40mM醋酸，1mMEDTA)，电压4V/cm。0.5mg/ml溴化乙咬染色15min，凝胶成像分析仪300nM透射紫外光观察并拍照。结果见图1。由图1可见，标准品对照组中kDNA条带清晰正常；阴性对照组中TopoII介导kDNA的去连环作用，形成了DNA小环((minicircles);阳性对照组中明显抑制了Topon介导产生kDNA去连环反应，未形成DNA小环；本发明化合物echinosideA不同浓度组中，echinosideA在125和25jiM的高浓度下明显抑制TopoII介导产生kDNA去连环反应，在5和l^M的低浓度下未抑制TopoII介导产生kDNA去连环反应。系统的体外抗肿瘤分子机制研究结果显示，echinosideA具有显著的TopoII抑制活性，为有效的TopoII抑制剂。在无细胞体系中，echinosideA在125和25pM均能有效的抑制TopoII介导的kDNA去连环作用，其作用强度与经典TopoII抑制剂VP16的作用强度相似。本发明为研制肿瘤TopoII抑制剂提供了新的先导化合物，对开发利用中国的海洋药用生物资源具有重要意义。图l为本发明抑制TopoII介导的kDNA去连环实验的电泳图谱。具体实施方式实施例1:echinosideA的分离制备选择生长于中国福建东山海域的黑乳海参干品7500克，洗涤切碎后分别用5倍重量70%的乙醇依次浸泡提取3次，每次浸泡7天。合并乙醇提取液，减压回收乙醇，得流浸膏。将流浸膏溶于3倍体积的水中，依次用石油醚和水饱和的正丁醇各萃取4次，萃取液每次2500ml。合并正丁醇萃取液，回收溶剂至近干，7(TC水浴蒸干，得黑乳海参正丁醇部位总提取物62克。按常规将总提取物干法上样，进行硅胶柱色谱分离，以氯仿甲醇水=86.5:23.5:1混合溶剂约3000ml洗脱，收集含有皂苷的部分，再进行ds反相柱层析，以甲醇水=65:35混合溶剂1500ml洗脱，薄层层析检测，收集含有echinosideA的流分，回收溶剂至近干，7(TC水浴蒸干，得到echinosideA1.9克。权利要求1.海参中皂苷类化合物echinosideA在制备肿瘤拓扑异构酶II抑制剂中的应用，所说的皂苷类化合物echinosideA的化学结构式如下2.权利要求1所述化合物的制备方法，步骤如下-(1)提取将黑乳海参干品粉碎，按常规用50%~90%乙醇浸泡提取，浓縮提取液，得到流浸膏；将流浸膏均匀分散于水中，依次用石油醚、水饱和正丁醇分别萃取；将正丁醇萃取液浓缩至干，得总皂苷提取物；(2)分离将上述总皂苷提取物进行硅胶柱层析，以氯仿甲醇水=8~6.5:2~3.5:l混合溶剂洗脱，薄层色谱检测，收集含有皂苷的流分，再经过ds反相柱层析，以甲醇水=65~60:35~40洗脱，薄层色谱检测，收集含有echinosideA的流分，回收溶剂至干，得到echinosideA0全文摘要本发明涉及医药
技术领域：
，具体为海参中皂苷类化合物echinosideA在制备肿瘤拓扑异构酶II抑制剂中的应用，化合物echinosideA的分子式为C₅₄H₈₇O₂₆SNa，经多种现代波谱分析，包括多种先进的二维核磁共振波谱的解析，确定了该化合物的化学结构和立体构型。体外试验表明，该化合物对肿瘤拓扑异构酶II(TopoII)具有显著的抑制作用，为有效的TopoII抑制剂。本发明为研制TopoII抑制剂提供新的先导化合物，对开发利用中国的海洋药用生物资源具有重要价值。文档编号A61P35/00GK101336928SQ20081004031公开日2009年1月7日申请日期2008年7月8日优先权日2008年7月8日发明者健丁,刘宝姝,鹏孙,易杨华,明李,玲李,林莉萍,汤红叶,缪泽鸿申请人:中国人民解放军第二军医大学;中国科学院上海药物研究所