一类呋甾皂苷类化合物及其应用
【专利摘要】本发明公开了一类呋甾皂苷类化合物及其应用。所述呋甾皂苷类化合物从开口箭根茎中提取分离得到，经过实验研究发现本发明所获得的10种呋甾皂苷类化合物在防治癌症、抗炎方面具有很好的作用，对咽鳞癌、咽头癌等都具有一定的抑制作用。且该类化合物从植物中提取获得具有高效、低毒的优点，有望开发为新的抗癌药物及保健食品。
【专利说明】
-类巧酱皂昔类化合物及其应用
技术领域
[0001 ]本发明属于医药技术领域，具体设及一类巧酱皂巧类化合物及其应用。
【背景技术】
[0002] 肿瘤是人体器官组织的细胞在外来和内在有害因素的长期作用下所产生的一种 W细胞过度增殖为主要特点的新生物，在医学上可分为良性肿瘤和恶性肿瘤两大类。良性 肿瘤对人体健康影响较小，而恶性肿瘤(又称癌症)则严重威胁着人类的健康。根据世界卫 生组织和美国癌症协会的最新统计数据，癌症已成为人类死亡的首要病因，2008年全世界 约有1270万新诊断癌症病例和760万癌症死亡病例（约占所有死亡人数的13%)，且大约有 70%的癌症死亡病例发生在中低收入国家。预计到2030年，癌症年诊断和死亡病例将分别 高达2140万和1320万。
[0003] 天然药物尤其是来源于植物的药物具有化学结构多样性和生物活性多样性，一直 是人类预防和治疗疾病的主要来源。临床上应用的许多药物都直接或间接来源于天然产 物，天然产物不仅可W作为药物半合成的前体物，而且可W作为药物化学合成的的模板，为 新药设计提供新思路。天然产物已成为发现新药物或先导化合物的主要源泉之一。
[0004] 开口箭（Tupisha 化inensis)为百合科(Xiliaceae)铃兰族（Convallarieae)开 口箭属(Tupis化a)植物。主要分布于我国中部和西南部，主产于湖北S峡库区及神龙架林 区。开口箭在上家族医药中享有极高声誉，为神农架四大名药之一药用部位为其根状茎。开 口箭味甘微苦，性寒，具有清热解毒、益气活血、散疲止痛等多种功效，民间用于咽喉肿痛、 劳热咳嗽、跌打损伤、风湿搏痛、月经不调等症。使用方便，疗效显著，已有数百年的应用历 史。临床上，开口箭饮片治疗慢性咽炎效果良好。
[0005] 开口箭根茎的主要活性成分为酱体皂巧类成分。现代药理实验研究表明开口箭具 有较强的抗肿瘤、抗炎、抑菌等活性。现有研究对开口箭化学成分研究仍不够彻底，因而开 口箭中酱体类化学成分值得进一步研究和开发利用。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一类巧酱皂巧类化合物。
[0007] 本发明的另一目的在于提供上述巧酱皂巧类化合物的应用。
[000引本发明所采取的技术方案是：
[0009]巧酱皂巧类化合物，其结构式分别为：
[0010] 化-
化合物
[0011] 化- 化合物
[001^ 化合物5[ooK] 化合物e
[0014] 化合物7
[00巧]化合彩
[0016] 化合彩 [0017] 化合彩
[0018] 上述巧酱皂巧类化合物在制备防治癌症药物中的应用。
[0019] 进一步的，上述癌症为咽鱗癌、咽头癌、鼻咽鱗癌、肝癌、慢性骨髓性白血病、肺腺 癌。
[0020] 上述巧酱皂巧类化合物在制备抗炎药物中的应用。
[0021] 本发明的有益效果是：
[0022] 本发明通过长期研究，从开口箭根茎中分离鉴定了一类新型巧酱类皂巧类化合物 1~10。通过研究发现该化合物1~10在防治癌症、抗炎方面具有很好的作用。该类化合物从 植物中提取获得，具有高效、低毒的优点，有望开发为新的抗癌药物及保健食品。
【附图说明】
[0023] 图I为本发明化合物(50山〇对不同肿瘤细胞的抑制作用；
[0024] 图2为本发明化合物（50咖)对Raw 264.7细胞释放炎症介质NO的抑制作用；Ctl-: 空白对照；Ct 1+:模型组;**p<0.001。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0026] 实施例1巧酱皂巧类化合物的提取和鉴定
[0027] 一、巧酱皂巧类化合物的提取
[0028] 取开口箭根茎17kg，用60%乙醇加热回流提取4次，每次4小时，合并提取液减压回 收溶剂，得总浸膏，将总浸膏用水混悬，用乙酸乙醋等体积萃取4次，除去脂溶性杂质，水层 经D101大孔树脂柱层析分离，分别W水、20 %乙醇，60 %乙醇，80 %乙醇、95 %乙醇进行洗 脱，得到5个馈分TA、TB、TC、TD、TE。取馈分TC(60 %乙醇洗脱部分)200g，采用硅胶柱色谱、 ODS中低压柱色谱、反相高效液相色谱等分离方法，分离得到本发明化合物1、2和6。采用同 样的分离手段从馈分TD(80%乙醇洗脱部分）中分离得到本发明化合物3、4和7,从馈分TB (20%乙醇洗脱部分）中分离得到本发明化合物5和8-10。通过理化常数和现代波谱学手段 化尺65加5，1〇-醒1?，2〇-醒1〇鉴定^上1〇个化合物的结构，化合物1为(255)寸脚〇31-10，3口，5 0,2化，26-pentol-26-〇-0-D-glucopyranoside，化合物2为（25S)-fu;rost-10,30,50,22a, 26-pentol-26-〇-0-D-glucopyranoside，化合物3为（25S)-26-〇-0-D-glucopyranosyl- fu;rost-30,50,22日，26-tet;rol-5-〇-0-D-glucopyranoside，化合物4为26-0-0-D- 邑Iucopyranosyl-furost-25(27)-ene-30,50,22口，26-tetrol-5-〇-0-D-邑Iucopyranoside， 化合物 5为26-〇-0-D-glucopyranosy 化;rost-25 (27 )-ene-30,处，50,2化，26-pentol-5- O-0-D-glucopyranoside ,化合物6为（25R)-26-〇-0-D-glucopyranosyl-22a-meth〇wl- furost-5(6)-en-30,26-diol-3-〇-口-L-rhamnopyranosy1-(1一2)-0-0-邑Iucopyranosyl- (1一4)-0-〇-旨日1日。1:〇97^]1〇31(16，化合物7为（255)-26-〇-0-〇-旨111。〇97^]1〇371-化1'〇31：-5 (6)-ene-30,22a，26-triol-3-〇-a-L-rhamnopyranosyl-(1一2)-0-D-glucopyranosyl-(l 一4)-0-D-galactopyranoside，化合物8 为 26-〇-0-D-glucopyranosy；L-郎-fu;rost-25(27)- 611-30,22日，26-付;[01-3-0-0-0-邑111。097脚]1〇354-(1一4)-0-〇-邑111。〇97脚]1〇31(16，化合物9 为（251〇-26-〇-0-〇-邑111。〇口7扣]1〇371-50-扣1'〇31：-10,3日，22日，26-161：1'〇1-3-〇-0-〇- 邑111。〇口7招]1〇31(16，化合物1〇为（255)-26-〇-0-〇-邑111。〇口7阿]1〇354-郎-化1'〇31：-10,30,22口， 26-tet;rol-1-〇-a-k;rhamnopyranosy；L-( 1 一2)-0-0-巧Iopyranos ide。上述所获得的化合 物1~10的结构W表1所示的结构式为准。
[0029] 表1本发明10个巧酱皂巧类化合物的结构
[0031]
[0033]
[0034] 二、巧酱皂巧类化合物的鉴定
[0035] 化合物1-10的结构鉴定过程如下：
[0036] 化合物1的鉴定
[0037] (25S)-fu;rost-10,3日，50,2化，26-pentol-26-〇-0-D-glucopyranoside (化合物 1):白色无定形粉末，[冲;>-7.6 ('('化50, McOH),红外谱图中显示强的多径基吸收峰3411cm-i， 对Anisaldehyde (A试剂)反应显黄色，对Elhr IisKE试剂）显粉红色，酸水解检出D-葡萄糖， 提示该化合物为巧酱皂巧类化合物。HRESIMS(positive)给出准分子离子峰[M+Hrm/z 611.3830(calcd. for C3抽日日Oio 611.3795)，提示其分子量为610，结合Ih-NMR和"C-匪R (DEPT)可确定其分子式为C33也4010。
[0038] 在Ih-匪R谱中，高场区给出酱体皂巧元上四个甲基的特征信号，其中两个角甲基 为单峰，另外两个为双峰，分别位于 S0.91(3H，s，Me-18)、1.49(3H，s，Me-19)、1.34(3H，d，J = 6.9Hz，Me-21)及1.03(3H，d，J = 6.7Hz，Me-27)。在糖端基氨区给出一个糖端基氨信号5 4.82(IH，d，J = 7 .細Z )，提示该化合物为含有一个P-D-葡萄糖的巧酱皂巧。另外，由于27位 甲基的化学位移大于1.OOppm且26位两个质子的化学位移之差(0.6化pm)大于0.57ppm，说 明该化合物为25S巧酱皂巧。
[0039] i3C-NMR( 126MHz，pyridine-d日）显示出33个碳信号，其中Sl 11.0为巧酱皂巧C-22特 征信号，Sl05.5为糖端基碳信号。通过lH-NMR、Uc-NMR(DEPT)、服QC、HMBC及lH-lHC0SY谱并 结合文献可W对该化合物的碳及氨信号进行全面归属。在Ih-Ih COSY谱中，两个亚甲基质子 信号S2.12化-化)和2.59化-20)与两个连氧碳上的质子信号M.3UH-1)和5.12化-3)相关， 质子信号S5.12化-3)与另外两个亚甲基质子信号S2.25化-姑)和2.60化-4〇)相关，说明化 合物的C-I和C-3位连有径基。在HMBC谱中，19-Me与季碳S77.4 (C-5)相关，说明化合物C-5位 连有径基。通过NOESY谱，A环上径基相对构型得到确定:H-4a与H-7a和H-9a相关，H-化与H-9 a相关，说明A、B环为顺式连接，因此C-5位径基为e取向；H-Ia与Me-19和H-Il相关，说明C-I 位径基为e取向；H-30与H-20和H-4时目关，说明C-3位径基为a取向。在HMBC谱中，葡萄糖端基 质子信号M.82(lH，d，J = 7.細Z)与巧元C-26(S75.7)相关，从而确定葡萄糖连接在化合物1 的(：-26位。综合^上信息，化合物1鉴定为（255)-化'〇31-10，3日，50，22日，26可日111〇1-26-〇- 0-D-glucopyranoside。化合物1的Ih-NMR和Uc-NMR数据见表2，化合物1的结构见表1。
[0040] 化合物2的鉴定
[0041 ] (25S)-fu;rost-10,30,50,2化，26-pentol-26-〇-0-D-glucopyranoside (化合物 2):白色无定形粉末，[祁-24.0 ((' 0.50, McOH)，红外谱图中显示强的多径基吸收峰3411cm -1，对Anisaldehyde (A试剂)反应显黄色，对Elhrlish化试剂）显粉红色，酸水解检出D-葡萄 糖，提示该化合物为巧酱皂巧类化合物。HRESIMS(POSitive)给出准分子离子峰[M+H]+m/z 611.3821 (calcd. for C3抽55〇1〇 611.3795)，提示其分子量为610，结合Ih-匪R和"C-匪R (DEPT)可确定其分子式为C33也4〇1〇。
[0042] 在Ih-匪R谱中，高场区给出酱体皂巧元上四个特征的甲基信号，其中两个角甲基 为单峰，另外两个为双峰，分别位于 S〇.91(3H，s，Me-18)、1.55(3H，s，Me-19)、1.33(3H，d，J = 6.9Hz，Me-21)及1.03(3H，d，J = 6.7Hz，Me-27)。在糖端基氨信号区给出一个糖端基氨信 号M. 81 (IH，d，J = 7.細Z )，提示该化合物为含有一个P-D-葡萄糖的巧酱皂巧。另外，由于27 位甲基的化学位移大于1. OOppm且26位两个质子的化学位移之差(0.6化pm)大于0.57ppm， 说明该化合物为25S巧酱皂巧。
[0043] Uc-NMR( 126MHz，pyridine-ds)显示出33个碳信号，其中Sl 11.0为巧酱皂巧C-22特 征信号，S105.4为糖端基碳信号。该化合物巧元部分与糖链部分的碳谱数据与化合物1极其 相似，仅A环上的数据有较小的差异，推测运两个化合物有相同的平面结构，只是取代基相 对构型不同而已。该化合物巧元部分碳谱数据与已知化合物（255)-26-〇-0-〇- 邑Iucopyranosyl-furost-lP, 30,50,22日，26-pentaol-3-〇-0-D-glucopyranoside)基本一 致，只是在A环的C-l、C-2、C-3化学位移有差别。与化合物（255)-26-〇-0-〇- 邑111。〇口7脚]1〇354-化1'〇31：-10,30,50,22日，26-口6]11:日〇1-3-〇-0-〇-邑111。〇口7脚]1〇31(16)相比，该 化合物的C-3向高场位移，C-I和C-2向低场位移，提示化合物2的C-3位径基游离。综合W上 信息，化合物2鉴定为（25 5)-扣'〇31-10，30，50，2 2日，26-96111〇1-26-〇-0-〇- g 1 ucopyranoS i de。通过Ih-NMR、I3C-NMR(DEPT)、服QC、HMBC和Ih-Ih COSY谱可 W 对该化合物 的碳及氨信号进行全面归属，化合物2的Ih-NMR和I3C-NMR数据见表2。化合物2的结构见表1。
[0044] 化合物3的鉴定
[0045] (25S)-26-〇-0-D-glucopyranosyl-furost-30,50,22a,26-tetrol-5-〇-0-D- 邑111(3〇口7拘]1〇31(16(化合物3):白色无定形粉末，[础;'-29.1(['().50、、1地!4)，红外谱图中显示 强的多径基吸收峰3459cm-i，对Anisaldehyde (A试剂)反应显黄色，对Elhr IisKE试剂)显粉 红色，酸水解检出D-葡萄糖，提示该化合物为巧酱皂巧类化合物。HRESIMS(posi t i ve)给出 准分子离子峰[M+扣+m/z 757.4398(calcd.for C3姐65014 757.4374)，提示其分子量为756， 结合Ih-NMR和I3C-NMR(DEPT)可确定其分子式为C3姐64014。
[0046] 在Ih-匪R谱中，高场区给出酱体皂巧元上四个特征的甲基信号，其中两个角甲基 为单峰，位于 S〇.89(3H，s，Me-18)和1.24(3H，s，Me-19)，另外两个为双峰，位于1.34(3H，d，J = 6.9Hz，Me-21)和1.03(3H，d，J = 6.6Hz，Me-27)。在糖端基氨信号区给出两个糖端基氨信 号M.81(lH，d，J = 7.7Hz)和5.14(lH，d，J = 7.7化），结合运些糖端基氨信号的J值与酸水解 分析结果，说明该化合物为含有两个e-D-葡萄糖的酱体皂巧。另外，由于27位甲基的化学位 移大于1 .OOppm且26位两个质子的化学位移之差(0.6化pm)大于0.57ppm，说明该化合物为 25S巧酱皂巧。
[0047] i3C-NMR( 126MHz，pyridine-ds)显示出39个碳信号，其中Sl 11.1为巧酱皂巧C-22特 征信号，S97.6和105.4为糖端基碳信号。该化合物巧元部分与糖链部分的碳谱数据与已知 化合物reinocarnoside B碳谱数据比较，除了多出六个糖信号和F环有差别外，其余基本一 致，提示该化合物为reinocarnoSide B的F环开环后形成的产物。
[004引在HMBC谱中，葡萄糖端基质子信号M.8laH，d，J = 7.7Hz)与巧元C-26(S75.7)相 关，另一端基质子S5.14(lH，d，J = 7.7Hz)与巧元C-5(S81.5)相关，从而确定两个葡萄糖分 别连接在化合物的C-26和C-5位。通过Ih-NMR、i3C-NMR( DEPT)、服QC、HMBC及Ih-Ih COSY谱可 W对该化合物的碳及氨信号进行全面归属。综合W上信息，化合物3鉴定为(25S)-26-0-e- D-glucopyranosyl-化;rost-30,50,22日，26-tet;rol-5-0-0-D-glucopyranoside。化合物3 的Ih-NMR和"C-NMR数据见表3。化合物3的结构见表1。
[0049] 化合物4的鉴定
[0050] 26-〇-0-D-glucopyranosyl-fu;rost-25(27)-ene-30,50,2化，26-te1:;rol-5-〇-0- D-glucopyranoside(化合物4):白色无定形粉末，[a]/;i-38.3 (('化50, McOH),红外谱图中显 示强的多径基吸收峰3444畑1-1，对4]113曰1(16117(16(4试剂）反应显黄色，对化1'11311化试剂）显 粉红色，酸水解检出D-葡萄糖，提示该化合物为巧酱皂巧类化合物。HRESIMS(positive)给 出准分子离子峰[M+H]+m/z 773.4368(calcd.for C3讯65〇15 773.4323)，提示其分子量为 772,结合Ih-NMR和I3C-NMR(DEPT)可确定其分子式为C3姐64〇15。
[0051] 在Ih-醒R谱中，高场区给出S个特征的甲基信号，其中两个角甲基为单峰，位于5 0.89(3H，s，Me-18)和1.24(3H，s，Me-19)，另外一个为双峰，位于Sl.34(3H，d，J = 6.細z，Me- 21)。在低场区给出两个末端双键上的质子信号化.35(1山3)和5.07(1山3)。在糖端基氨信 号区给出两个糖端基氨信号M.91(lH，d，J = 7.細z)和5.15(lH，overlapping)，说明该化合 物为含有两个葡萄糖的酱体皂巧。
[0化2] UC-NMR( 126MHz，pyridine-d日）显示出39个碳信号，其中Sl 10.7为巧酱皂巧C-22特 征信号，S97.6和104.3为糖端基碳信号。最低场处147.6ppm的季碳信号及111. Ippm的亚甲 基信号提示运两个碳是一个末端双键信号，分别归属为25位和27位。该化合物碳谱数据与 化合物3非常相似，只是F环发生变化，推测可能是化合物3的25位与27位碳形成末端双键的 缘故，其二维图谱也证明了上述推巧U。通过Ih-NMR、i3C-NMR(DEPT )、HSQC、HMBC及Ih-Ih COSY 谱可W对该化合物的碳及氨信号进行全面归属。综合W上信息，化合物4鉴定为26-〇-0-〇- 邑Iucopyranosyl-furost-25(27)-ene-30,50,22口，26-tetrol-5-〇-0-D-邑Iucopyranoside。 化合物4的Ih-NMR和I3C-NMR数据见表4。化合物4的结构见表1
[0053] 化合物5的鉴定
[0054] 26-〇-0-D-glucopyranosyl-fu;rost-25(27)-ene_30,处，50,2化，26-pentol-5-〇- 0-〇-邑111(3〇口7^]1〇31(16(化合物5):白色无定形粉末，的;-,、-1〇.9扛化25,1\4洗)1~1)，红外谱图中 显示强的多径基吸收峰3422cm-i，对Anisaldehyde (A试剂)反应显黄色，对Elhr IisKE试剂） 显粉红色，酸水解检出D-葡萄糖，提示该化合物为巧酱皂巧类化合物。HRESIMS(POSitive) 给出准分子离子峰[M+H]+m/z 789.4219(calcd.for C3姐65〇16 789.4273)，提示其分子量为 788，结合1护醒巧日1化-^吸(06?1')可确定其分子式为〔3姐64〇16。
[0055]在Ih-醒R谱中，高场区给出S个特征的甲基信号，其中两个角甲基为单峰，位于5 0.90(3H，s，Me-18)和1.37(3H，s，Me-19)，另外一个为双峰，位于Sl.34(3H，d，J = 6.9Hz，Me- 21)。在低场区给出两个末端双键上的质子信号化.35( 1H，S)和5.06(lH，s)。在糖端基氨信 号区给出两个糖端基氨信号M.91(lH，d，J = 7.細z)和5.23(lH，d，J = 7.7Hz)，说明该化合 物为含有两个e-D-葡萄糖的酱体皂巧。
[0化6] i3C-NMR( 126MHz，pyridine-d日）显示出39个碳信号，其中Sl 10.7为巧酱皂巧C-22特 征信号，897.4和104.3为糖端基碳信号。最低场处147.699111的季碳信号及111.化91]1的亚甲 基信号提示运两个碳是一个末端双键信号，分别归属为25位和27位。该化合物碳谱数据与 化合物4非常相似，只是A环发生变化。结合分子中的氧数，可知巧元部分较化合物4多一个 径基。由于该化合物的3位及5位较化合物4向低场发生了较大位移，分别为5.2ppm及 6. Oppm，而6位碳却向高场位移了 6.4ppm，故可知在该化合物的4位存在一个径基，运样3位 和5位位于4位径基的0位，移向低场，6位处于丫位，受丫 -效应的影响向高场发生较大位移。 其二维图谱也证明了上述推测。综合W上信息，化合物5鉴定为26-〇-0-〇-旨111(3〇口7^]1〇371- fu;rost-25(27)-ene-30,40,50,22日，26-口6111:〇1-5-〇-0-〇-邑111。〇口7招]1〇31(16。通过1护醒尺、 I3C-NMR(DEPT)、HSQC、HMBC及Ih-Ih COSY谱可W对该化合物的碳及氨信号进行全面归属，化 合物5的Ih-NMR和I3C-NMR数据见表4。化合物5的结构见表1。
[0057] 化合物6的鉴定
[005引（25R)-26-0-0-D-glucopyranosyl-22a-metho巧1-化;rost-5(6)-en-30,26-diol- 3-0-口-L-rhamnopyr anosyl-( 1 一2)-0-D-邑lucopyranosyl-(1一4)-0-0- galactopyranoside(化合物6):白色无定形粉末，[a];'M9.6 (t' 0.50, McOH)，红外谱图中显 示强的多径基吸收峰3400cm-i，对Anisaldehyde (A试剂)反应显黄色，对ElhrlisKE试剂）显 粉红色，酸水解检出D-葡萄糖、D-半乳糖及心鼠李糖，提示该化合物为巧酱皂巧类化合物。 HRESIMSUegative)给出准分子离子峰[M-H]-m/z 1077.5535( calcd. for C 日油 85〇23 1077.5482)，提示其分子量为1078,结合Ih-NMR和I3C-NMR(DEPT)可确定其分子式为 C 日出 86〇23d
[0059] 在Ih-NMR谱中，高场区给出五个特征的甲基信号，其中四个为酱体皂巧元上特征 的甲基信号，两个角甲基为单峰，位于S〇.79(3H，s，Me-18)和0.86(3H，s，Me-19)，另外两个 为双峰，位于 Sl.l8(3H，d，J = 6.細z，Me-21)和 0.98(3H，d，J = 6.7Hz，Me-27);另一个处于最 低场的甲基Sl.75(3H，d，J = 6.2Hz)为鼠李糖甲基的特征信号，提示分子中含有一个鼠李糖 基。在较低场区给出一个甲氧基质子信号的.25(3H，s)。在糖端基氨信号区给出四个糖端基 氨信号S4.84(lH，d，J = 7.甜z)、4.85aH，d，J = 6.細z)、5.39aH，d，J = 7.5Hz)和6.29(lH， brs)，说明该化合物为四糖巧酱皂巧。另外，由于27位甲基的化学位移小于1.OOppm且26位 两个质子的化学位移之差(0.38ppm)小于0.48ppm，说明该化合物为25R巧酱皂巧。
[0060] Uc-NMR化EPT)显示出52个碳信号。由巧酱皂巧C-22特征信号S112.9可知22位连接 有甲氧基（如果22位连接径基，C-22化学位移会向高场位移到111.0左右）。最低场处 141.化pm的季碳信号及121.9ppm的次甲基信号及氨谱中不饱和质子信号化.30(lH，d，J = 4.2Hz，H-6)提示运个化合物5位与6位形成双键。5105.2、103.5、104.8和102.7为四个糖端 基碳信号。该化合物的碳谱数据与文献报道的methyl protodioscin非常相似，只是3位糖 链信号有差异，提示二者具有相同的巧元。
[0061 ]根据TOCSY谱，结合Ih-Ih C0SY、HSQ幻普的分析结果，由3-0-^的端基质子出发可 W找到并归属该半乳糖基上的H-4信号，而从3-0-^的4位质子出发可W找到并归属该半 乳糖残基上的H-2、H-3、H-5和H-6信号；同法由3-0-Gal-(4-l)-Glc和3-0-Gal-(4-l)-Glc- (2-1)-固的端基质子出发，可W将各自糖残基上的信号进行!liii。结合HMB村普，可W进一 步验证糖残基的信号归属。在HMB幻普中，鼠李糖端基质子信号S6.29(IH，brS)与内侧葡萄糖 的C-2(S79.2)相关，说明鼠李糖连接在葡萄糖的2位，另外该葡萄糖的端基质子信号S5.39 aH，d，J = 7.5Hz)与半乳糖的C-4(S77.5)相关，说明该葡萄糖连接在半乳糖的4位，而半乳 糖的端基质子信号M.85(lH，d，J = 6.細Z)与巧元C-3(S78.6)相关，从而确定该化合物3位 的糖链为3-0-Gal-(4-l)-Glc-(2-l)-化曰，经CA查证，该糖链为一未见文献报道的新糖链。 综合 W 上信息，化合物 6 鉴定为（25R)-26-〇-0-D-glucopyranosy；L-22a-meth〇w；L-fu;rost-5 (6)-en-30,26-diol-3-〇-a-L-rhamnopyranos yl-(I一2)-0-D-glucopyranosyl-(I一4)- (6-D-galactopyranoside。通过lH-NMR、l3C-NMR(DEPT)、服QC、HMBC、lH-lHCOSY及TOCSY谱可 W对该化合物的碳及氨信号进行全面归属，化合物6的Ih-NMR和I3C-NMR数据见表5。化合物6 的结构见表1。
[0062] 化合物7的鉴定
[0063] (25S)-26-〇-0-D-glucopyranosyl-fu;rost-5(6)-ene-30,2^,26-1:;riol-3-〇-a- L-rhamnopyranosyl-( 1 一2)-0-D-glucopyranosyl-(l 一4)-0-D-galactopyranoside (化合 物7 ):白色无定形粉末，帕f -26.2 ((' 0.50, McOH)，红外谱图中显示强的多径基吸收峰 3425cm-i，对AnisaldehydeU试剂)反应显黄色，对化rlisME试剂）显粉红色，酸水解检出 D-葡萄糖、D-半乳糖及心鼠李糖，提示该化合物为巧酱皂巧类化合物。HRESIMS(negative) 给出准分子离子峰[M-H]-m/z 1063.5386(calcd.for C日出83〇23 1063.5325)，提示其分子量 为1064，结合1护醒巧日1化-^吸(06?1')可确定其分子式为〔5曲4〇23。
[0064] 在Ih-NMR谱中，高场区给出五个特征的甲基信号，其中四个为酱体皂巧元上特征 的甲基信号，两个角甲基为单峰，位于S〇.88(3H，s，Me-18)和0.88(3H，s，Me-19)，另外两个 为双峰，位于 Sl.32(3H，d，J = 6.7Hz，Me-21)和1.03(3H，d，J = 6.6Hz，Me-27);另一个处于最 低场的甲基SI.77(3H，d，J = 6. IHz)为鼠李糖甲基的特征信号，提示分子中含有一个鼠李糖 基。在糖端基氨信号区给出四个糖端基氨信号84.84( lH，d，J = 7.5Hz)、4.85( lH，d，J = 6.細z)、5.41(lH，d，J = 7.甜z)和6.31(lH，brs)，说明该化合物为四糖巧酱皂巧。另外，由于 27位甲基的化学位移大于1.0 Oppm且26位两个质子的化学位移之差（0.59ppm)大于 0.57ppm，说明该化合物为25S巧酱皂巧。
[0065] I3C-NMR化EPT)显示出51个碳信号。由巧酱皂巧C-22特征信号S111.0可知22位连接 有径基（如果22位连接甲氧基，C-22化学位移会向低场位移到112.9左右）EiW。最低场处 141.化pm的季碳信号及122.化pm的次甲基信号及氨谱中不饱和质子信号化.30(lH，d，J = 4.2Hz，H-6)提示运个化合物5位与6位形成双键。5105.5、103.6、104.9和102.8为四个糖端 基碳信号。该化合物核磁数据与化合物6(25R)非常相似，仅F环信号有差异，运与前面分析 的化合物7的25位为S构型一致。与化合物6相比，该化合物缺少一个甲氧基的信号，进一步 证明该化合物22位连接的是径基而非甲氧基。
[0066] 综合^上信息，化合物7鉴定为（255)-26-〇-0-〇-旨111。〇97^]1〇371-化1'〇31：-5(6)- ene-30,22口，26-triol-3-〇-口-L-rhamnopyranosyl-(I一2)-0-0-邑lucopyranosyl-(I一4)- e-D-galactopyranosi de。化合物7的Ih-NMR和Uc-NMR数据见表5。化合物7的结构见表1。
[0067] 化合物8的鉴定
[0068] 26-〇-0-D-glucopyranosyl-50-fu;rost-25(27)-en-30,22a ,26-t;riol-3-〇-0-D- glucopyranosyl-(l 一4)-0-D-glucopyranoside(化合物8):白色无定形粉末， [a]n-30.9 (t. 0.50, McOH)'红夕4普图中显示强的多美圣基吸收峰3418cm-i，对Anisaldehyde(A 试剂)反应显黄色，对化rlisKE试剂）显粉红色，酸水解检出D-葡萄糖，提示该化合物为巧 酱皂巧类化合物。HRESIMS(negative)给出准分子离子峰[M-H]-m/z 917.4794(calcd.for C45出3〇i9 917.4746)，提示其分子量为918，结合Ih-NMR和I3C-NMR(DEPT)可确定其分子式为 C4 出 74〇19。
[0069] 在Ih-醒R谱中，高场区给出S个特征的甲基信号，其中两个角甲基为单峰，位于5 0.86(3H，s，Me-18)和0.84(3H，s，Me-19)，另外一个为双峰，位于Sl.32(3H，d，J = 6.9Hz，Me- 21)。在低场区给出两个末端双键上的质子信号化.33(1山3)和5.04(1山3)。在糖端基氨信 号区给出 S 个糖端基氨信号 M.88(lH，d，J = 7.細 z)、4.89(lH，d，J = 7.細 Z)和 5.21(lH，d，J =7.9Hz )，说明该化合物为含有S个P-D-葡萄糖的酱体皂巧。
[0070] Uc-NMR( 126MHz，pyridine-ds)显示出39个碳信号，其中Sl 10.6为巧酱皂巧C-22特 征信号，8103.2、104.3和105.3为糖端基碳信号。最低场处147.5ppm的季碳信号及111.化pm 的亚甲基信号提示运两个碳是一个末端双键信号，分别归属为25位和27位。该化合物碳谱 数据与已知化合物Chamae化OSides E非常相似，只是F环发生变化，推测可能是化合物8的 25位与27位碳形成末端双键的缘故，其二维图谱也证明了上述推测。综合W上信息，化合物 8鉴定为26-〇-0-〇-邑111。〇97阿]1〇371-50-化1'〇31：-25(27)-6]1-30,22日，26-付;[01-3-0-0-0- glucopyranosyl-( 1一4)-0-D-glucopyranoside，为一未见文献报道的新化合物。通过1护 NMR、UC-NMR(DEPT)、HSQC、HMBC及Ih-Ih COSY谱可W对该化合物的碳及氨信号进行全面归 属，化合物8的Ih-NMR和I3C-NMR数据见表6。化合物8的结构见表1。
[0071] 化合物9的鉴定
[0072] (25R)-26-〇-0-D-glucopyranosyl-50-furost-10,3a,22a,26-tetrol-3-〇-0-D- glucopyranoside(化合物9):白色无定形粉末，[地9-2.1J.(c0.，.沸M奶:巧，红外谱图中显示 强的多径基吸收峰3420畑1-1，对4]113曰1(16117(16(4试剂)反应显黄色，对化1'11311化试剂)显粉 红色，酸水解检出D-葡萄糖，提示该化合物为巧酱皂巧类化合物。HRESIMS(posi t i ve)给出 准分子离子峰[M+扣+m/z 757.4398(calcd.for C3姐65014 757.4374)，提示其分子量为756， 结合Ih-NMR和I3C-NMR(DEPT)可确定其分子式为C3姐64014。
[0073] 在Ih-匪R谱中，高场区给出酱体皂巧元上四个特征的甲基信号，其中两个角甲基 为单峰，另外两个为双峰，分别位于 S0.90(3H，s，Me-18)、1.27(3H，s，Me-19)、1.36(3H，d，J = 6.9Hz，Me-21)和0.99(3H，d，J = 6.7Hz，Me-27)。在糖端基氨区给出两个糖端基氨信号5 4.82(lH，d，J = 7.細z)和5.04(lH，d，J = 7.7化），提示该化合物为含有两个(6-D-葡萄糖的巧 酱皂巧。另外，由于27位甲基的化学位移小于1. OOppm且26位两个质子的化学位移之差 (0.3^ipm)小于0.48ppm，说明该化合物为25R巧酱皂巧。
[0074] Uc-NMR( 126MHz，pyridine-ds)显示出39个碳信号，其中Sl 11.0为巧酱皂巧C-22特 征信号，S103.0和105.3为糖端基碳信号。该化合物巧元部分与糖链部分的碳谱数据与化合 物（25R)-50-spi;rostan-10,3a-diol-3-〇-0-D-glucopyranoside 碳谱数据比较，除 了多出 六个糖信号和F环有差别外，其余基本一致，提示该化合物为化合物(25R)-50-spirostan-l 0. 3a-diol-3-〇-0-D-glucopyranoside 的 F 环开环后形成的产物。
[0075] 在HMBC谱中，葡萄糖端基质子信号M.82(lH，d，J = 7.細Z)与巧元C-26(S75.6)相 关，另一端基质子S5.04(lH，d，J = 7.7Hz)与巧元C-3(S74.8)相关，从而确定两个葡萄糖分 别连接在化合物的C-26和C-3位。通过Ih-NMR、i3C-NMR( DEPT)、服QC、HMBC及Ih-Ih COSY谱可 W对该化合物的碳及氨信号进行全面归属。综合W上信息，化合物9鉴定为(251〇-26-0-护 D-glucopyranos}d-50-fu;rost-10,3日，2化，26-tet;rol-3-〇-0-D-glucopyranoside。化合物 9的Ih-NMR和"C-NMR数据见表7。化合物9的结构见表1。
[0076] 化合物10的鉴定
[0077] (25S)-26-〇-0-D-glucopyranosyl-50-fu;rost-10,30,22a, 26-tet;rol-1-〇-a-l^- rhamnopyranosy I - (I一2)-0-D-xylopyranoside(化合物 10):白色无定形粉末， [a],-,、-57.5 ((' 0.50, MeOH),红夕谱图中显示强的多径基吸收峰3406cm-i，对Anisaldehyde(A 试剂)反应显黄色，对化rlisKE试剂)显粉红色，酸水解检出D-葡萄糖、D-木糖和心鼠李糖， 提示该化合物为巧酱皂巧类化合物。HRESIMS(positive)给出准分子离子峰[M+Hrm/z 873.4908(calcd. f or C4姐730i7873.4848)，提示其分子量为872，结合Ih-NMR和"C-匪R (DEPT)可确定其分子式为C4姐72017。
[0078] 在Ih-NMR谱中，高场区给出五个特征的甲基信号，除去酱体皂巧元上四个甲基信 号 S0.88(3H，s，Me-18)、1.32(3H，s，Me-19)、1.30(3H，d，J = 6.9Hz，Me-21)及1.02(3H，d，J = 6.7化，Me-27)外，在最低场处甲基信号Sl.73(3H，d，J = 6.1Hz)为鼠李糖甲基的特征信号， 提示该化合物含有一分子鼠李糖。在糖端基氨区给出S个糖端基氨信号54.79( 1H, overlapping)、5.07(IH，d，J = 7.2Hz)和6.57(IH，d，J= 1. IHz)，结合酸水解结果，说明该化 合物含有一分子鼠李糖，一分子葡萄糖和一分子木糖。另外，由于27位甲基的化学位移大于 1. OOppm且26位两个质子的化学位移之差(0.6化pm)大于0.57ppm，说明该化合物为25S巧酱 皂巧。
[0079] i3C-NMR( 126MHz，pyridine-ds)显示出44个碳信号，其中Sl 10.9为巧酱皂巧C-22特 征信号，S98.4、102.2和105.4为=个糖端基碳信号。该化合物巧元部分碳谱数据与文献报 道的rhodeasapogenin碳谱数据相比，除了C-I位及F环有差别外，其余基本一致，提示该化 合物为rhodeasapogenin的F环开环后形成的产物。与rhodeasapogenin相比，化合物10的C- 1位向低场发生较大位移，而C-2位向高场位移，说明该化合物C-I位成巧。
[0080] 在HMBC谱中，鼠李糖的端基氨66.57( lH，d，J=I. IHz)与木糖C-2(S77.2)相关，而 木糖的端基氨化.07aH，d，J = 7.2Hz)与巧元C-l(S76.2)相关，由此确定巧元l位的糖链为 I-O-Xy 1-(2-1 )-化曰。葡萄糖的端基氨 M. 79 (1H, overlapping)与巧元 C-26 位（S75.6)相关， 由此确定葡萄糖连接在巧元的26位。
[0081 ]综合W上信息，化合物 10鉴定为（25S)-26-〇-0-D-glucopyranosyl-50-fu;rost-l 0,30,22日，26-tet;rol-1-〇-a-l^-;rhamnopyranosyl-( 1一2)-0-D-xylopyranoside。通过 Ih- NMR、UC-NMR(DEPT)、HSQC、HMBC及Ih-Ih COSY谱可W对该化合物的碳及氨信号进行全面归 属，化合物10的Ih-NMR和I3C-NMR数据见表8。化合物10的结构见表1。
[0082] 表2本发明化合物I和化合物2的Ih-NMR和Uc-NMR谱数据(pyridine-ds)
[0083]
[
[0085] 表3本发明化合物3的Ih-NMR和I3C-NMR谱数据(pyridine-ds)
[0086]
[0087]
[008引表4本发明化合物4和化合物5的Ih-NMR和Uc-NMR谱数据(pyridine-ds)
[0091] 表5本发明化合物6和化合物7的Ih-NMR和I3C-NMR谱数据(pyridine-ds)
[0092]
[0103]
1234567 实施例2抑瘤试验： 2 本发明化合物对人体2个瘤株的体外抑瘤活性实验，运2个瘤株为化Du(人咽鱗癌 细胞），Detroit 562(人咽头癌胸水转移细胞）。顺销作为阳性对照。 3 抑制肿瘤细胞增殖(MTKi) 4 将肿瘤细胞接种于96孔板中，培养24h后加入待测试样品，再培养4她后用MlT法测 定样品对肿瘤细胞增殖的抑制率。细胞增殖抑制率按下述公式计算，并用化IcuSyn软件计 算被测试样品的半数抑制浓度(ICso)。 5 细胞增殖抑制率=(阴性对照组OD值平均值-样品组OD值平均值）-(阴性对照组 OD值平均值-空白对照组OD值平均值）X 100% 6 实验结果见表9和图1。 7 表9本发明化合物对不同肿瘤细胞的抑制作用
[0111]
[0112] 从表9和图I的实验数据可知，化合物I和8对W上两种肿瘤细胞的增殖均具有很好 的抑制作用(见表9)，其余化合物在浓度为SOiiM时对化Du和Detroit 562运两种细胞也有不 同程度的抑制作用(见图1)。
[0113] 实施例3抗炎试验：
[0114] 本发明化合物对体外抗炎活性实验，采用LPS(脂多糖)诱导的Raw 264.7(小鼠巨 隧细胞)细胞，建立体外炎症模型。采用MlT和Griess实验，考察本发明化合物对经脂多糖诱 导后的Raw 264.7细胞释放炎症介质NO的影响。抗炎药Indomethacin(吗I噪美辛）作为阳性 对照。
[0115] 1)MTT 实验
[0116] Raw 264.7细胞接种于96孔板中，培养24小时后，加入待测供试品，再培养24h后用 MlT法测定样品对肿瘤细胞增殖的抑制率。细胞增殖抑制率按下述公式计算，并用化IcuSyn 软件计算被测试样品的半数抑制浓度(ICso)。
[0117] 细胞增殖抑制率=(阴性对照组OD值平均值-样品组OD值平均值）-(阴性对照组 OD值平均值-空白对照组OD值平均值）X 100%
[011 引 2)G;riess 实验
[0119] Raw 264.7细胞接种于96孔板中，培养24小时后，加入待测供试品，再培养24h后， 吸取各孔培养液50化，加入50化Griess A试剂和50化Griess B试剂混匀，用酶标仪于 546nm处测定OD值，按如下公式计算对NO产生的抑制率，并用化IcuSyn软件计算被测试样品 的半数抑制浓度(ICso)。
[0120] NO抑制率=(模型对照组OD值平均值-样品组OD值平均值）-(模型对照组OD值平 均值-阴性对照组OD值平均值）X 100%
[0121] 实验结果见表10和图2。
[0122] 表10本发明化合物对Raw 264.7细胞释放炎症介质NO的抑制作用
[0123]
从表10和图2的实验数据可知，化合物5和8具有很好的体外抗炎活性(见表10)，其 他化合物在浓度为50iiM时对LPS诱导的Raw 264.7细胞释放炎症介质NO也有不同程度的抑 制作用(见图2)。
[0125]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.呋留皂苷类化合物，其结构式分别为：2. 权利要求1所述呋留皂苷类化合物在制备防治癌症药物中的应用。3. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于:所述癌症为咽鳞癌、咽头癌、鼻咽鳞癌、肝 癌、慢性骨髓性白血病、肺腺癌。4. 权利要求1所述呋留皂苷类化合物在制备抗炎药物中的应用。
【文档编号】A61P35/00GK105924494SQ201610301570
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月6日
【发明人】何祥久, 向丽敏, 王宜海, 易晓敏
【申请人】广东药学院