一种生物法降解烟草浸出液中甾醇类化合物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于烟草生物技术领域，具体涉及一种利用生物法降解烟草中留醇类有害 化合物的方法。
【背景技术】
[0002] 留醇属于大分子醇类，是一类广泛存在于自然界中的留族化合物，主要存在于动 植物的脂肪或油类中，或以高级脂肪酸的酯存在于动物体内或者苷的形式存在于植物的 组织中。其基本骨架结构为环戊氢化菲体系，由三个六元环和一个五元环组成（如下图所 示），C-3、C-11位上可能有烃基或酮基，C-10、C-13位上各有一个甲基，C-17位上有8~10 个碳原子组成的侧链。
[0003]
[0004] 留醇是烟草植物中的一类激素类物质，对烟草生长有促进作用。烟草中甾醇 主要包括豆留醇、菜油留醇、β-谷留醇以及胆留醇等4种化合物，在烟草中的含量约为 0. 1-0. 3%，其中豆留醇的含量最高。烟草留醇主要存在于烟草细胞膜中，以游离态和结合 态两种形式存在，结合态包括与脂肪酸结合形成酯，以及与糖类形成糖苷键的配糖类物质 以及酰基配糖类化合物。不同产地烟叶中植物留醇含量分布呈现出明显的地域差异，不同 部位的烟叶叶片留醇的含量也不同，中部叶含量最大，上部叶次之，下部叶含量最少。
[0005] 留醇类物质在烟草植物成熟之后对烟草品质没有多少贡献，反而是烟气中稠环 芳烃类物质的最为主要前体化合物，稠环芳烃已经确认为致癌物质。已有大量研究报道 烟草燃烧过程中，留醇母核经过高温裂解可形成对人体有害的多环芳烃，包括致癌物质苯 并（a)芘。因此降解烟草制品中的留醇含量可以有效降低卷烟主流烟气中的Polycyclic AromaticHydrocarbons(PAHs)的释放，从而有效控制烟草对人体健康的危害。由此可见， 甾醇类化合物降解转化对减少烟气毒害，提高烟草品质具有十分重要作用，因此，在烟草调 制、陈化及烟草薄片加工过程中有效降解留醇，对于提高卷烟的安全性具有重要价值。
[0006] 类芽孢杆菌属（Paenibacillus)的细菌为土壤中常见的细菌，也是一类重要的病 害生物防治微生物。该菌属也可从一些植物体内分离到。现有离体实验表明，类芽孢杆菌 在抑制植物病原菌增强植物抗病能力方面有很强作用，同时还有研究者发现，该菌属对甾 醇类化合物的生物降解有重要作用。
[0007]目前已有部分研究报道，采用有机溶剂萃取法降低烟草中的游离留醇含量来降低 主流烟气中的PAHs的释放量。但是利用萃取法去除烟草中留醇类化合物的效果不是很理 想，同时可能会导致烟草中一些重要香味物质和潜香物质的散失。应用生物技术降解烟草 中部分有害物质的方法在近年来得到了一定的发展，然而关于烟草中留醇类化合物的生物 降解技术的相关研究却寥寥可数。
【发明内容】
[0008] 本发明提供一种生物法降解烟草浸出液中留醇类化合物的方法。根据本发明可从 烟草表面分离可降解留醇菌株一一类芽孢杆菌，并利用正交实验（不同温度、pH、不同生长 阶段细胞）确定该菌株降解留醇的最适条件。本发明中类芽孢杆菌降解留醇类化合物，具 有一定的选择性，同时整个过程简单且快速，可为生物法降解烟草中苯并芘的有害前提物 质的开发提供参考，同时在烟草减害领域具有重要的应用前景。
[0009] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0010] -种生物法降解烟草浸出液中留醇类化合物的方法：通过培养基从烟草表面分离 甾醇降解菌，利用种子培养基扩大培养该微生物，搜集对数期细胞，接种于烟草浸提液，发 酵。
[0011] 它的步骤如下：
[0012] (1)降留醇微生物的分离：用无菌水洗涤烟叶表面2-3次，收集沉淀，将沉淀用 15mlpH7.0的磷酸缓冲液稀释后，按照10%接种量接种到分离培养基中，37°C摇床中， 150r/min培养，于富集培养基中富集培养3次后，取200μ1培养液涂于固体平板上，培养 48h后获得可降解留醇的微生物单菌落；
[0013] (2)微生物扩大培养：挑取步骤（1)中的单菌落到种子培养基中，于37°C摇床中， 150以11^11培养48小时，获得种子培养液，保存于4°(：，同时取0.51111菌液加0.51111的50%甘 油混匀后保存于_20°C;
[0014] (3)以步骤⑵中的种子培养液为种子，重新取1ml接种到50ml新鲜的种子培养 液中，相同条件下培养48小时，每隔5小时取2ml菌液，测定0D值，在18-52h收集细胞，分 别在6000转，4°C下离心30min，去掉上清液； _5] (4)甾醇降解条件：收集18-52h的细胞，并以质量1 :50的比例将干细胞加入到烟 草浸提液中，置于37°C的摇床中，150r/min下发酵2-8h。
[0016] 所述步骤（1)中分尚培养基的组分：以分尚培养基总量1L计，显甾醇2. 0±0.lg; 葡萄糖2.0±0.lg;失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚1±0.lml;柠檬酸2.0±0.lg;Κ2ΗΡ040· 5±0·Olg;NH4C1L0±0·lg;余量为水。 _7] 所述步骤⑴中富集培养基的组分：以富集培养基总量1L计，豆甾醇，5. 0±0.lg; 七界661180，1±0.11111;柠檬酸，2.0±0.18;柠檬酸铁胺，0.05±0.01 8;1(2即04,0.5±0.18; NH4C1，1.0±0.lg;余量为水。
[0018]所述步骤⑶中的种子培养液的组分：以种子培养液总量1L计，Κ2ΗΡ04， 0· 5±0.01g;ΝΗ4Ν03,2·0±0·lg;柠檬酸，2·0±0·lg;甘油，10·0±(λ2g;余量为水，pH= 7· 0-7. 2。
[0019] 本发明的有益效果：从烟叶表面分离获得降解留醇的微生物，利用种子培养基进 行扩大后获得对数期细胞，添加到烟草浸提液中可以有效降解其中的留醇含量，留醇总降 解率达到35. 5%。留醇为烟草有害物质苯并芘的前体化合物，该发明为烟草生物减害提供 参考，具有很高的原创性，有望应用于降低苯并芘的再造烟叶生产过程。
【附图说明】
[0020] 图1为微生物细胞的生长曲线；
[0021] 图2为标准样品中的甾醇液相质谱图；
[0022] 图3为烟草浸提液中的甾醇液相质谱图。
【具体实施方式】
[0023] -种生物法降解烟草浸出液中