一种土壤蛋白质的提取方法与流程

本发明涉及一种土壤蛋白质的提取方法。

背景技术：

环境宏蛋白质组学是近年来兴起的一种研究技术，该技术可以将土壤中复杂的微生物群体有效的进行综合分析，以揭示土壤生态系统中的变化。

土壤环境中宏蛋白质组学的研究问题的关键在于，土壤蛋白质的提取和分析，其中蛋白质的提取是研究土壤环境的重点。土壤蛋白质的提取是土壤蛋白质组学研究的前提，然而由于土壤蛋白质提取方法的缺乏，当前土壤蛋白质组学的研究还不能有效的开展。因此，本发明针对土壤宏蛋白质提取方面的关键技术进行优化，以期本发明能在土壤宏蛋白质组学研究中做出一定贡献。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种有效的土壤蛋白质的提取方法。

本发明所提供的土壤蛋白质的提取方法，包括下述步骤：

1)向土壤样品中加入土壤蛋白质提取缓冲液，震荡，静置；

2)置于沸水中加热，于0℃冰水中冷却，震荡，离心；

3)将上清液过滤，向已过滤的上清液中加入Tris饱和酚，震荡，离心，弃去上清液，收集下层苯酚溶液；

4)向下层苯酚溶液中加入甲醇醋酸铵溶液，-20℃放置6h-8h；

5)离心，将上清液移出，收集蛋白质沉淀，将蛋白质沉淀用丙酮清洗，冻干，得到蛋白质干粉。

上述方法步骤1)中，所述土壤蛋白质提取缓冲液为中性的蛋白质提取缓冲液，具体可为pH6.8的蛋白质提取缓冲液。

所述pH6.8的蛋白质提取缓冲液的配制方法为：称取十二烷基硫酸钠(SDS)1.25g，三羟甲基氨基甲烷(Tris)1.2114g，NaCl 0.8766g，二硫苏糖醇(DTT)0.386g，加入70ml双蒸水溶解，使用浓盐酸调节pH至pH 6.8，最后使用双蒸水定容至100ml，即可。

所述土壤样品与土壤蛋白质提取缓冲液的配比为1.8g-2.2g：5ml。

所述震荡的速度为3000rpm-3200rpm，时间为10-20min，具体可为15min。

所述静置的时间为3-5min，具体可为3min。

上述方法步骤2)中，所述加热的时间为5-15min，具体可为10min。

所述冷却的时间为3-5min，具体可为3min。

所述震荡的速度为3000rpm-3200rpm，时间为5-10min，具体可为5min。

所述离心的条件为：4℃下4500-5500rpm离心5-10min，具体可为4℃下5000rpm离心5min。

上述方法步骤3)中，所述过滤采用0.45μm的尼龙滤膜。

所述Tris饱和酚的pH值为8.0。

所述上清液与Tris饱和酚的配比为3-4ml：2ml。

Tris饱和酚购自北京索莱宝科技公司。

所述震荡的速度为3000rpm-3200rpm，时间为15-30min，具体可为20min。

所述离心的条件为：4℃下10000-13000rpm离心15-20min，具体可为4℃12000rpm离心20min。

上述方法步骤4)中，所述甲醇醋酸铵溶液的浓度为0.1M。

所述甲醇醋酸铵溶液的配制方法为：称取0.7708g醋酸铵溶于80ml甲醇溶液中，并定容至100ml。

所述甲醇醋酸铵溶液与苯酚溶液的体积比为5-6：1。

上述方法步骤5)中，所述离心的条件为：4℃下13000-15000rpm离心15-20min，具体可为4℃15000rpm离心20min。

所述丙酮为预冷的丙酮。

所述清洗可进行多次，具体可为3次。

所述冻干的温度为-80℃。

经SDS-PAGE电泳检测发现通过上述方法提取的土壤蛋白质的条带较另外两种具有代表性的土壤蛋白质提取方法(Wang et al.,2011土壤蛋白质提取方法，具体方法参考论文：Characterization of Metaproteomics in Crop Rhizospheric Soil.Journal of Proteome Research，2011(10)：932-940；Chourey et al.,2010土壤蛋白质提取方法，具体方法参考论文：Direct Cellular Lysis/Protein Extraction Protocol for Soil Metaproteomics.Journal of Proteome Research，2010(9)：6615-6622.)获得的蛋白质的条带更清晰。

其中，蛋白质分离检测方法为：称取1.5mg冻干的蛋白质粉末加入1ml SDT缓冲液溶解得到蛋白质溶液，取20μl蛋白质溶液于2ml离心管中，加入5μl 5×上样缓冲液制备成蛋白质样品，涡旋混匀后沸水浴加热10min，待样品冷却，取20μl蛋白质样品进行SDS-PAGE电泳，凝胶规格为12×16×18cm，蛋白质样品在电泳槽中加入电泳缓冲液，浓缩胶为5％聚丙烯酰胺凝胶，80V，电泳30min，分离胶为12％的聚丙烯酰胺凝胶，120V，电泳90min，15mA恒定电流进行电泳，室温，待电泳结束后，卸下胶片，考马斯亮蓝染色，脱色液脱色。

本发明的优点在于：

土壤中腐殖酸含量高，其中腐殖酸HA溶于碱溶液，富里酸FA既溶于碱，也溶于水和酸，胡敏素HM溶于稀碱，不溶于水和酸，由此可知蛋白质提取缓冲液的pH对提取蛋白质影响较大，所以中性pH蛋白提取缓冲液可以最大程度的减轻腐殖酸的影响，且在提取过程中，沸水浴加热可以帮助细胞有效的裂解并使蛋白酶失活，防止蛋白质降解。本发明通过中性蛋白质提取缓冲液和沸水浴加热结合的土壤蛋白质提取法可以最大程度的排除了腐殖酸干扰。

所提取的黑土土壤蛋白质较另外两种具有代表性的土壤蛋白质提取方法来说，经SDS-PAGE检测后条带清晰。

附图说明

图1为Wang et al.,2011、Chourey et al.,2010和本发明方法所提取的土壤蛋白质提取方法的SDS-PAGE胶图。其中，条带1为采用Wang et al.,2010的方法提取的番茄根际土壤蛋白质；条带2采用Chourey et al.,2010的方法提取的番茄根际土壤蛋白质；条带3采用本发明方法提取的番茄根际土壤蛋白质。

图2为本方法提取不同土壤蛋白质的SDS-PAGE胶图。其中，条带4为采用本发明方法提取的露地土壤的蛋白质；条带5为采用本发明方法提取的番茄根际土的蛋白质；条带6为采用本发明方法提取的小麦秸秆还田后的番茄根际土。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所使用的Tris饱和酚购自北京索莱宝科技公司。

下述实施例中所使用的试剂的配制方法为：

100ml的蛋白质提取缓冲液的配制方法：称取SDS 1.25g，Tris 1.2114g，NaCl 0.8766g，二硫苏糖醇(DTT)0.386g，加入70ml双蒸水溶解，使用浓盐酸调节pH至pH 6.8，最后使用双蒸水定容至100ml。

100ml 0.1M甲醇醋酸铵溶液的配制：称取0.7708g醋酸铵溶于80ml甲醇溶液中，并定容至100ml。

10ml SDT缓冲液配制：SDS 0.4g，Tris 0.121g，DTT 0.039g，溶解于5ml双蒸水中，使用浓盐酸调节pH至pH 6.8，最后使用双蒸水定容至10ml.

5ml 5％的浓缩胶配制：双蒸水3.4ml，30％丙烯酰胺混合液0.83ml(29.2g丙烯酰胺溶于50ml双蒸水中，加入0.8g双丙烯酰胺，使用双蒸水定容至100ml，过滤，4℃保存)，1.0M Tris-HCl pH6.8，0.63ml(称取12.114g溶于70ml双蒸水中，使用浓盐酸调节pH到6.8，在用双蒸水定容至100ml，4℃保存)，10％过硫酸铵50ul(称取0.1g过硫酸铵置于1.5ml离心管中，加入1ml双蒸水，最大速度涡旋混匀，现用现配)，10％SDS溶液50ul(称取10g SDS加入80ml双蒸水，于37℃恒温水浴锅中加热溶解，使用双蒸水定容至100ml)，四甲基乙二胺(TEMED)5ul。

10ml 12％的分离胶配制：双蒸水3.3ml，30％丙烯酰胺混合液4ml，1.5M Tris-HCl pH8.8，2.5ml(称取18.15g溶于70ml双蒸水中，使用浓盐酸调节pH到8.8，在用双蒸水定容至100ml，4℃保存)，10％过硫酸铵100ul，10％SDS溶液100ul，四甲基乙二胺(TEMED)4ul。

5倍Tris-甘氨酸缓冲液配制：94g甘氨酸溶于500ml双蒸水中，溶解后加入15.1g Tris和5g SDS，待全部溶解，使用双蒸水定容止1L，存于4℃。使用时量取50ml缓冲液。使用双蒸水稀释至500ml。

考马斯亮蓝染色液配制：称取1.25g考马斯亮蓝R-250溶于250ml甲醇中，加入少量双蒸水后再加入80ml冰乙酸，使用双蒸水定容止1000ml，迅速过滤。

脱色液配制：250ml甲醇加入80ml冰乙酸使用双蒸水定容至1L。

Wang et al.,2011土壤蛋白质提取方法，具体方法参考论文：Characterization of Metaproteomics in Crop Rhizospheric Soil.Journal of Proteome Research，2011(10)：932-940.

Chourey et al.,2010土壤蛋白质提取方法，具体方法参考论文：Direct Cellular Lysis/Protein Extraction Protocol for Soil Metaproteomics.Journal of Proteome Research，2010(9)：6615-6622.

实施例

1土壤蛋白质提取步骤：

土壤蛋白质的提取：分别称取2g陆地土壤、2g番茄根际土壤、2g小麦秸秆还田后番茄根际土，将3种土壤分别置于10ml离心管中，加入5ml土壤蛋白质提取缓冲液，最大速度震荡15min，静置3min后打开离心管盖子，将离心管置于沸水中加热10min，取出离心管置于0℃冰水中，冷却3min后最大速度震荡5min，4℃5000rpm离心5min，将上清液过0.45μm的尼龙滤膜，已过滤膜的上清液转移到一个新的10ml离心管中，加入2ml pH 8.0的Tris饱和酚，最大速度震荡20min后4℃12000rpm离心20min，去上清液，取下层苯酚层置于50ml离心管中，加入约苯酚层5-6倍体积的0.1M甲醇醋酸铵溶液，-20℃放置6h后，从-20℃取出离心管4℃15000rpm离心20min，将上清液小心移出，沉淀为蛋白质，再将蛋白沉淀用预冷的丙酮清洗3次，-80℃冻干，获得蛋白质干粉。

2蛋白质分离：将3种蛋白质分别取出1.5mg蛋白质粉末置于2ml离心管中，加入1ml SDT缓冲液溶解蛋白质粉末，取20μl蛋白质溶液于2ml离心管中，加入5μl5×上样缓冲液制备成蛋白质样品，涡旋混匀后沸水浴10min，待样品冷却，3种土壤蛋白质样品分别取20μl进行SDS-PAGE电泳，凝胶规格为12×16×18cm，在电泳槽中加入电泳缓冲液，浓缩胶为5％聚丙烯酰胺凝胶，80V，电泳30min，分离胶为12％的聚丙烯酰胺凝胶，120V，电泳90min，15mA恒定电流进行电泳，室温，待电泳结束后，卸下胶片，考马斯亮蓝染色，脱色液脱色。

图1为Wang et al.,2011、Chourey et al.,2010和本发明方法所提取的土壤蛋白质提取方法的SDS-PAGE胶图。

图2为本方法提取不同土壤蛋白质的SDS-PAGE胶图。

结果表明，采用本发明所提取的不同土壤的蛋白质，经SDS-PAGE检测后，所提取的土壤蛋白质质量较好，土壤蛋白质浓度高、条带清晰。