蛋白质VdAL在提高植物产量和促进植物生长中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域中蛋白质VdAL在提高植物产量和促进植物生长中的应 用。
【背景技术】
[0002] 目前我国大面积粮食及经济作物的持续高产主要依赖大量使用化肥、防治病虫害 主要依赖大量喷施化学农药。中国农业科学院农业经济与发展研究所研究员胡定梟，在谈 及农业污染问题时他指出，我们国家现在还是相当严重的，化肥和农药的过量使用，W及养 殖业中大量使用的抗生素和重金属添加剂对农业生产都将造成严重的污染。
[0003] 据迂宁省统计该省目前化肥年使用量在3万吨W上，单位面积化肥施用强度约 340千克每公顷，国家生态区建设要求每公顷限值则为每公顷250千克，重氮肥轻憐肥钟 肥现象普遍不规范施肥问题也较为突出，迂宁省农药年用量超过1. 4万吨且呈逐年上升趋 势。残留农药通过大气沉降和雨水冲刷的形式进入环境和农产品中极易造成环境污染事 件。迂宁省环保厅农村处处长王军表示近年来随着农村环境污染问题日渐突出环境信访案 件呈高发态势。据统计近两年迂宁省74个设农县区环境信访案件每年平均4310件其中设 农案件近2795件占信访案件的65%左右。
[0004] 过量施肥会造成农作物吸收营养元素时离子之间增强括抗作用，若某种养分离子 高浓度的存在能够抑制另一种或多种养分离子的活性，从而影响农作物对另一种营养离子 的吸收。如在酸性±壤里氮肥的施入量过多，作物吸收巧离子就很困难。如果过量地施用 巧肥会诱发农作物的锋、棚、铁、儀、儘等微量元素缺乏。钟肥用量过多也会影响农作物对巧 离子、儀离子的吸收；而且过量施肥易引起农作物中毒，因施入大量肥料，增加了±壤溶液 的浓度，使农作物根系吸收水分困难，造成地上部萎黨，植株枯死。此外，过量施肥还影响农 产品的品质，农作物生长中、后期，如果大量施入化肥，会使农产品器官含糖量降低，不耐胆 藏，从而影响商品价值，降低农作物的经济效益。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是如何促进植物生长和如何提高植物产量。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质在提高植物产量和/或调控植物 生长中的应用。
[0007] 本发明所提供的蛋白质在提高植物产量和/或调控植物生长中的应用中，所述蛋 白质的名称为VdAL为如下Al)或A2)或A3): 阳00引 Al)氨基酸序列为序列1的蛋白质；
[0009] A2)在序列1的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸 残基得到的具有相同功能的由Al)衍生的蛋白质；
[0010] A3)在Al)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。 阳0川其中，序列1由297个氨基酸组成。
[0012] 为了使Al)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列I或序列I的氨基酸所示的 蛋白质的氨基末端或簇基末端连接上如表1所示的标签。
[001引表l、t不签的序列
[0014]
阳015] 上述A2)中的VdAL可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上 述A2)中的VdAL的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个 氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或 3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0016] 上述VdAL在提高植物产量和/或调控植物生长中的应用中，所述调控植物生长可 为促进植物生长。
[0017] 为解决上述技术问题，本发明还提供了与VdAL相关的生物材料在提高植物产量 和/或调控植物生长中的应用。
[0018] 本发明所提供的与VdAL相关的生物材料在提高植物产量和/或调控植物生长中 的应用；
[0019] 所述生物材料，为下述BI)至B20)中的任一种：
[0020] BI)编码VdAL的核酸分子；
[0021] B2)含有BI)所述核酸分子的表达盒；
[0022] B3)含有BI)所述核酸分子的重组载体；
[0023] B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
[0024] B5)含有BI)所述核酸分子的重组微生物； 阳0巧]B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
[00%] B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
[0027] B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；
[0028] B9)含有BI)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
[0029] B10)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
[0030] Bl1)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系； 阳03UB。）含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
[0032] B13)含有BI)所述核酸分子的转基因植物组织；
[0033] B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
[0034]B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物组织；
[0035] B16)含有B4)所述重组载体的转基因植物组织；
[0036] B17)含有BI)所述核酸分子的转基因植物器官；
[0037] B18)含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；
[003引B19)含有B3)所述重组载体的转基因植物器官；
[0039]B20)含有B4)所述重组载体的转基因植物器官。
[0040] 上述与VdAL相关的生物材料在提高植物产量和/或调控植物生长中的应用中， BI)所述核酸分子可为如下bl)或b2)或b3)的基因：
[0041] bl)核巧酸序列是序列表中序列2的CDNA分子或DNA分子；
[0042]b2)与bl)限定的核巧酸序列具有75%或75%W上同一性，且编码VdAL的CDNA 分子或基因组DNA分子；
[0043]b3)在严格条件下与bl)限定的核巧酸序列杂交，且编码VdAL的CDNA分子或基因 组DNA分子。 W44] 其中，所述核酸分子可W是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA;所述核酸分子也 可W是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0045] 其中，序列2由894个核巧酸组成，编码序列1所示的蛋白质。
[0046] 本领域普通技术人员可W很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方 法，对本发明的编码VdAL的核巧酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分 离得到的VdAL的核巧酸序列75 %或者更高同一性的核巧酸，只要编码VdAL且具有VdAL功 能，均是衍生于本发明的核巧酸序列并且等同于本发明的序列。
[0047] 运里使用的术语"同一性"指与天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括与本 发明的编码VdAL所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核巧酸序列具有75%或更高，或85% 或更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核巧酸序列。同一性可W用肉眼或计算机 软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可W用百分比（％)表示， 其可W用来评价相关序列之间的同一性。
[0048] 上述与VdAL相关的生物材料在提高植物产量和/或调控植物生长中的应用中，所 述严格条件是在2XSSC，0.1%SDS的溶液中，在68°C下杂交并洗膜2次，每次5min，又于 0. 5XSSC，0. 1 %SDS的溶液中，在68°C下杂交并洗膜2次，每次15min;或，0. 1XSS阳（或 0. 1XSSC)、0. 1%SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。
[0049] 上述75%或75%W上同一性，可为80%、85%、90%或95%W上的同一性。
[0050] 上述与VdAL相关的生物材料在提高植物产量和/或调控植物生长中的应用中， B2)所述的含有编码VdAL的核酸分子的表达盒（VdAL基因表达盒），是指能够在宿主细胞 中表达VdAL的DNA，该DNA不但可包括启动VdAL基因转录的启动子，还可包括终止VdAL 基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子 包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子 的例子包括但不限于：花挪菜花叶病毒的组成型启动子35S:来自西红柿的创伤诱导型启 动子，亮氨酸氨基肤酶广LAP",Chao等人（1999)PlantPhysiol120:979-992);来自烟 草的化学诱导型启动子，发病机理相关1 (PRl)(由水杨酸和BTH(苯并嚷二挫-7-硫代径 酸S-甲醋）诱导）；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子（PIN2)或LAP启动子（均可用莱莉 酬酸甲醋诱导）；热休克启动子（美国专利5,187,267);四环素诱导型启动子（美国专利 5,057,422);种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专 利200710099169. 7))，种子胆存蛋白质特异的启动子（例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin 和大豆betaconglycin的启动子度eachy等人（1985化MBOJ.4:3047-3053))。它们可 单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适 的转录终止子包括但不限于：农杆菌姻脂碱合成酶终止子（N0S终止子）、花挪菜花叶病 毒CaMV35S终止子、tml终止子、魏豆rbcSE9终止子和姻脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止 子（参见，例如：〇dell等人（I98S)化Uire313:810;Rosenberg等人（1987)Gene, 56:125 ; Guerineau等人（1991)Mol.Gen.Genet, 262:141 ;P;rou壯oot(1991)Cell, 64:671;Sanfacon 等人GenesDev. ,5:141;Mogen等人（1990)PlantCell, 2:1261 ;Mun;roe等人（1990) Gene, 91:151 ;Ballad等人（1989)NucleicAcidsRes. 17:7891 ;Joshi等人（1987)Nucleic AcidRes. , 15:9627)。
[0051] 可用现有的表达载体构建含有所述VdAL基因表达盒的重组载体。所述植物 表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如PAHC25、地in438、 PCAMBIA1302、PCAMBIA2301、PCAMBIA1301、PCAMBIA1300、PBI121、pCAMBIA1391-Xa或 pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司）等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译 区域，即包含聚腺巧酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺巧 酸信号可引导聚腺巧酸加入到mRNA前体的3'端，如农杆菌冠瘦瘤诱导（Ti)质粒基因（如 姻脂碱合成酶基因Nos)、植物基因（如大豆胆存蛋白基因）3'端转录的非翻译区均具有类 似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录 增强子，运些增强子区域可W是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码 序列的阅读框相同，W保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源 是广泛的，可W是天然的，也可W是合成的。翻译起始区域可W来自转录起始区域或结构基 因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工， 如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、蛋光 素酶基因等）、抗生素的标记基因（如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptll基因，赋 予对除草剂麟丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的h地基因，和赋予对氨甲 噪岭抗性的化化基因，赋予对草甘憐抗性的EPSPS基因）或是抗化学试剂标记基因等（如 抗除莽剂基因）、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-憐酸异构酶基因。从转基因植物的安全 性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接W逆境筛选转化植株。
[0052] 上述与VdAL相关的生物材料在提高植物产量和/或调控植物生长中的应用中，所 述载体可为质粒、黏粒、隧菌体或病毒载体。所述质粒可为载体祀T