一种测定大豆凝集素凝集活性的微胶珠elisa试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物成分检测技术领域，具体设及一种测定大豆凝集素凝集活性的微 胶珠化ISA试剂盒。
【背景技术】
[0002] 大豆种质资源丰富，蛋白质含量较高且氨基酸比例较平衡，是动物优质的植物性 蛋白质饲料来源。但是大豆中含有多种抗营养因子，包括膜蛋白酶抑制因子、凝集素、异黄 酬、抗原蛋白等。该些抗营养因子通过干扰动物对营养物质的消化、吸收和代谢等多种方式 危害人和动物尤其是幼龄动物的生长和健康。大豆凝集素是大豆中主要的抗营养因子之 一，在成熟种子中约占大豆蛋白总含量的10%，其含量在一定程度上抑制了大豆的广泛应 用，因此建立大豆凝集素活性的灵敏、快速的检测方法引起研究者的关注。
[0003] 现有的大豆凝集素检测方法，按照检测目的不同可W分为两类，一是检测免疫学 活性的免疫化学分析方法，二是检测凝集活性的兔血凝抑制实验W及功能性化ISA方法。 最为成熟的凝集活性检测方法是兔血凝抑制实验，其优点是检测设备简单，价格低廉，缺点 是测定结果不宜观察（需要一定的经验才能判断准确）、检测准确性低、重复性差W及需要 新鲜的兔红细胞。基于上述缺点，张海泉等建立了功能性化ISA方法，W提高检测的准确 性，但是检测的重复性仍然较差，而且需要准备新鲜的兔红细胞外壳给实际检测带来了极 大不便。因此本申请建立了全新的微胶珠化ISA方法替代W往采用的兔血凝抑制实验实验 和功能性化ISA方法。
【发明内容】
[0004] 本发明针对现有技术存在的缺陷，目的在于提供一种测定大豆凝集素凝集活性的 微胶珠化ISA试剂盒，本发明利用共价键将大豆凝集素与凝集相关的特异性结合物连接至 胶珠上，从而获得了耐酸，耐碱，耐盐，能够稳定保存的化ISA固相载体，可W替代W往采用 的兔血凝抑制实验和功能性化ISA方法。
[0005] 本发明具体通过W下技术方案实现：
[0006] 一种测定大豆凝集素凝集活性的微胶珠化ISA试剂盒，包括：
[0007] 1)保存于浓度为20 %酒精中的微凝胶；
[000引 2)大豆凝集素抗体（冻干粉）；
[0009] 3)抗体稀释剂PBST;
[0010] 4)有筛板的小管；
[0011] 5)辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG抗体；
[001引 6)终止液（11. 1血浓硫酸，88. 9血水）。
[001引本发明所述的微凝胶通过W下方法制备；1)将琼脂糖配制成4%的溶液，利用喷 射方法制得琼脂糖凝胶珠，利用柱管式分流装置进行分级得到微胶株；2)取11ml琼脂糖微 胶株用500ml蒸馈水洗漆，抽干加15ml0. 8moVI的化OH，4ml环氧氯丙烷，20mg棚氨化钢， 在水浴摇床上25°C轻摇她，用冰水清洗活化凝胶，真空抽去多余的环氧氯丙烷；3)取半乳 糖溶于pH9. 00. 25M碳酸钢缓冲液制成半乳糖溶液，将半乳糖溶液与洗净的凝胶混合，在摇 床上振荡，25°C偶联20小时，用20倍微球体积的生理盐水清洗微球，将清洗后的微球置于 4C保持，待用。
[0014] 本发明所述的大豆凝集素抗体为多克隆抗体的冻干粉。
[00巧]所述的抗体稀释剂为；9g化Cl，2.9g化2册〇4,0.3gNa&PO"定容至1000血，加0. 5血吐温20。
[0016] 所述的终止液为；11. 1血浓硫酸和88. 9血水配置得到。
[0017] 本发明所述的试剂盒报包括大豆凝集素标准品。
[001引本发明所述的试剂盒的通过W下步骤进行检测：
[0019] 1)微凝胶置于1ml有筛板的小管，将待测样品滴到有微凝胶的小管中，解育化，用 稀释剂冲洗；
[0020] 2)加入用稀释剂稀释抗大豆凝集素抗体，在37°C温箱内培养化后，用稀释剂冲 洗；
[0021] 3)在小管加入辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG抗体，在37°C温箱内培养化，用稀 释剂冲洗；
[0022] 4)加入底物培养lOmin后，滴加终止液，反应终止，测490皿处光密度值。
[0023] 所述的大豆凝集素抗体与稀释剂的稀释比例为l:800v/v。
[0024] 所述加入的辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG抗体用稀释剂稀释1000倍。
[0025] 本发明的有益效果为：本发明利用共价键将大豆凝集素与凝集相关的特异性结合 物连接至胶珠上，从而获得了耐酸，耐碱，耐盐，能够稳定保存的化ISA固相载体，可W替代 W往采用的兔血凝抑制实验和功能性化ISA方法，全新的微胶珠化ISA方法解决了W往方 法存在的弊端。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，W下所述，仅是对本发明的较佳实施 例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示 的技术内容加W变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明 的技术实质对W下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。 [0027] 实施例1
[002引 1)琼脂糖微胶株的制备：将琼脂糖配制成4%的溶液后，利用喷射方法制得琼脂 糖凝胶珠，利用柱管式分流装置进行分级得到微胶株。
[0029] 2)微胶株的活化：取11ml琼脂糖微胶株用500ml蒸馈水洗漆，放在G3漏斗中抽 干加15ml0. 8mol/l的PM)H，4ml环氧氯丙烷，20mg棚氨化钢。在水浴摇床上25°C轻摇她。 用大量的冰水清洗活化凝胶，真空抽去多余的环氧氯丙烷。
[0030] 3)大豆凝集素特异性配基的偶联；取半乳糖溶于pH9. 00. 25M碳酸钢缓冲液制 成半乳糖溶液；将半乳糖溶液与洗净的凝胶混合，在摇床上振荡，25°C偶联20小时；用 0. 5mol/L的磯酸钢溶液（pH7. 5)清洗微球2次。用Imol/LNaCl溶液和0. 05mol/L磯酸钢 溶液（pH7.W清洗微球两次。加10倍体积的lOOmmol/L己醇胺（PH7. 5)，室温下解育化或 4°C过夜，轻轻摇匀。PBS洗2次。
[0031] 4)标准品的制备与鉴定
[00扣]大豆凝集素粗提液的制备；将48g脱脂豆粉溶于500血0. 9 %的化C1 (pH7. 2)中， 磁力揽拌器揽拌约两个小时后，离屯、取上清液，用0. 45ym滤膜过滤，（大约500血）W备上 样。
[003引分离提纯；平衡；将柱子用0. 9%的化C1平衡两个柱床体积（约200血）。上样； 将上述粗提液上样（两个多小时），注意；瓶内大约剩10mlW内就可W换生理盐水洗，防 止柱子干。洗杂蛋白；上样后，用0.9%的化C1 (抑7.2)洗脱杂蛋白，至基线。洗脱凝集 素；换用0. 3M半乳糖洗脱凝集素，并用自动收集器收集洗脱液，直至基线，换用0. 9 %的 化Cl(pH7. 2)再平衡。
[0034] 透析与浓缩；将部分收集器的试管中的液体倒入透析袋中，并用透析夹夹好，放入 含有0. 9%的化C1的溶液中透析。可用磁力揽拌器揽拌每半小时换液，约3-4次即可。后 用聚己二醇浓缩。浓缩后将液体倒入50ml离屯、管中，测0D280和0D260的值，放入-20°C冻 存。
[0035] 纯度检测：经SDS-PAGE检测，得到大豆凝集素标准品达到99% W上的纯度。
[0036] 5)大豆凝集素抗血清的制备；健康雄性兔子=只，购自吉林省公主岭，动物许可 证号；，要求年龄、胎次、体重（约2.化g)。分别免疫大豆凝集素标品。饲养阶段在吉林农 业大学动物科技学院动物室进行。采用甲醒熏蒸方式消毒兔舍，待异味完全释放后再进兔 子，保持室内干净，空气清新。兔子单笼饲养，自由采食、饮水。日粮配置参考GB14924-94 实验动物营养需要及饲养成分表（中国饲料数据库，1994年修订版）制订，且每日补饲胡萝 h、绿菜叶等。
[0037] 抗原；亲和层析方法提纯的大豆凝集素。
[003引试剂；弗氏完全佐剂（均购自鼎国公司），弗氏不完全佐剂；肾上腺素（购自吉林 农业大学兽医院）。
[0039] 器材与仪器；Gk88B旋祸混合器（江苏海口牒麟医用仪器厂），微量移液器。
[0040] 疫苗的制备；首次免疫用油佐剂苗的制备；首次采用弗氏完全佐剂疫苗。取等量 的凝集素与弗氏完全佐剂混合，利用旋祸混合器使其乳化完全即可。
[0041] 加强免疫用油佐剂苗的制备；制备方法同上，所用佐剂为弗氏不完全佐剂。
[0042] 免疫方法；
[0043] 首次免疫，足内侧上皮消毒后，注射完全佐剂疫苗，选两个位点，每点0.5ml;加强 免疫，首免后14天，背