专利名称：大豆凝集素基因lec-s 的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，涉及大豆凝集素基因Iec-S的应用。
背景技术：
烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)是一种植物正链RNA病毒,可侵染38科268种植物，引起多种重要的植物病毒病(Scholthof，2004)。由于TMV抗逆性极强，对寄主专性寄生，加上植物缺乏完整的免疫代谢系统，使得该病很难防治。甜菜夜蛾最初产生于东南亚，但在世界范围内也是一种重要的虫害，可以危害多种园艺作物及蔬菜(Smaggheet al，2003)。化学药剂的使用是目前防治植物病虫害的一种重要措施，但化学药剂的滥用对环境和农产品安全造成了严重的影响。而近年来植物抗病虫基因工程的发展则为防治植物病虫害提供了一条新途径，主要思路是将抗性相关基因通过基因工程手段转入受体植物中，从而获得植物抗病虫新品种，而且较传统育种具有基因资源多、育种周期短等特点(Kang et al,2005)。凝集素是一种能凝集红细胞、多糖或糖复合物的非免疫来源的糖蛋白。目前为止，人们已经从多种植物、动物、细菌、病毒和真菌中分离出凝集素(Tateno et al，1998 ；ffanget al, 1996 ；Inamori and Saito, 1999 ；Leteux and Chai, 2000) 迄今为止已发现的许多凝集素中，植物凝集素是最大的一个家族。在这些植物中，尤以豆科植物的种子中凝集素含量最为丰富。植物凝集素在植物中具有重要的防御功能。以往的许多研究报道表明，植物凝集素可以提高植物对真菌、细菌、线虫等多种病原物和有害昆虫的抗性(Ye et al,2001 ；Ooi et al, 2000 ；Machuka and Oladapo, 2000)。但关于大豆凝集素抗植物病毒的研究还未见报道。在发明人的前期工作中，利用RACE和反向PCR技术从大豆品种合丰29号中分离得到一个新的大豆凝集素基因，命名为lec-s (DQ235094)。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种新的大豆凝集素基因lec-s的应用。本发明的目的通过如下技术方案实现:大豆凝集素基因lec-s在培育抗病和/或抗虫的转基因植物品种中的应用，其中，所述的大豆凝集素基因lec-s的GenBank登录号为DQ235094。其中，所述的抗病为抗烟草花叶病毒，所述的抗虫指抗甜菜夜蛾。含有大豆凝集素基因lec-s的重组质粒在培育抗病和/或抗虫的转基因植物品种中的应用其中，所述的大豆凝集素基因lec-s的GenBank登录号为DQ235094。其中，所述的抗病为抗烟草花叶病毒，所述的抗虫指抗甜菜夜蛾。
有益效果:转基因烟草由于其基因转化技术成熟，从侵染到获得再生苗的周期较短，已被作为一个模式工作系统，常被用来进行植物抗病虫性研究。本发明对大豆凝集素基因Iec-S进行了转基因烟草及其抗病抗虫性的研究，获得的转基因烟草对TMV表现出显著的抗性，对甜菜夜蛾也表现良好抗性。qRT-PCR的检测结果也表明，与转空载体烟草相比，转基因烟草接种TMV后12h和24h，烟草中防卫基因PR-la, Pal和GSTl和HR标志基因hsr515均显著上调表达，并且最终表现为转基因烟草对TMV的抗性增强。所以，我们推断，lec-s基因在烟草体内表达，可能同时激活了烟草中的抗病性SA信号通路和过敏性细胞死亡(hypersensitive cell death, HCD)信号通路,赋予了烟草对TMV的抗性。可见将大豆凝集素基因lec-s通过基因工程手段转入农作物，能够获得具有抗病性以及抗虫性的转基因植物新品种。
图llec-s 基因 RT-PCR 扩增图(A)和 pMD18-T Simple:: lec-s (B)的酶切验证图A:M.分子量标记(DNA Marker DL2000);1 2.从大豆品种29中扩增lec_s; 3.清水对照B:M.分子量标记(DNA Marker DL2000) ; 1.Sma I 和 Xba I 酶切 pMD18_T Simple:: lec-s图2大豆凝集素lec-s基因编码的氨基酸同其它大豆凝集素的同源比较有*的位点是相似性高的位置图3植物重组表达质粒pBI121::lec-s构建图谱LB.T-DNA左边界；RB.T-DNA右边界；npt I1.新霉素磷酸转移酶基因；Pr0.启动子；Ter.终止子；gus.β -半乳糖醒酸酶基因图4植物表达载体ρΒΙ 121:: lec-s构建酶切图Ml.分子量标记(DNA Marker DL2000) ；M2.分子量标记(DNA Marker DL15000)；Γ2.质粒 pBI121:: lec-s 用 Sma I 和 Xba I 双酶切；3.质粒 pBI121 用 Sma I 和 Xba I 双酶切。图5重组载体pBI121:: lec-s转化农杆菌的PCR验证M.分子量标记(DNA Marker DL2000) ;ff.阴性对照，清水；P.阳性对照，质粒pBI121:: lec-s ;1 3.不同的转化子。图6转基因烟草Ttl代的PCR检测A、B:Μ.分子量标记(DNA Marker DL2000) ；P.阳性对照，质粒 pBI121:: lec_s ;W.阴性对照，清水；CK.阴性对照，未转化植株；f 45.转基因植株；C:M.分子量标记(DNA Marker DL2000) ；P.阳性对照，质粒pBI121 ；ff.阴性对照，清水；CK.阴性对照，未转化植株；f 24.转空载体植株。图7转基因植株Ttl代的Southern杂交分析M.分子量标记(DNA Marker DL2000, λ -Hind III digest)； 1.阳性对照，lec_s PCR扩增产物；2.未转化植株；3.转空载体植株；4 8.转基因植株图8 \代转基因烟草对TMV的抗性WT.未转化烟草；VEC.转空载体烟草；T1-11，Τ1-20.转基因烟草图OT1代转基因烟草接种TMV后病 斑数差异比较WT.未转化烟草；VEC.转空载体烟草；T1-11，Τ1-20.转基因烟草；数据表示为平均值土标准差表示与转空载体烟草相比在0.05水平上差异显著
图1OqRT-PCR测定防卫反应相关基因表达A:接种TMV后12h ;B.接种TMV后24h ；WT.未转化烟草；VEC.转空载体烟草； B:T1-11，T1-20.转基因烟草数据表示为平均值土标准差；*表示与转空载体烟草相比在0.05水平上差异显
著图1lT1代转基因烟草对甜菜夜蛾幼虫体重的影响WT.未转化烟草；VEC.转空载体烟草；T1-11，Τ1-20.转基因烟草图12 \代转基因烟草对甜菜夜蛾幼虫化蛹率的影响WT.未转化烟草；VEC.转空载体烟草；T1-11，Τ1-20.转基因烟草
具体实施例方式以下实施例中所涉及的材料及试剂:烟草品种为三生烟(Nicotiana tabacum cv.Samsun NN),取烟草叶片作为转化材料。根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105、植物表达载体pBI121购自Invitrogen0烟草组织培养基以MS培养基为基础，pH5.8，121°C灭菌15min。预培养培养基:MS+6BA0.5mg/L ;共培养培养基:MS+6_BAlmg/L ;筛选培养基:MS+6-BAlmg/L+Kml00mg/L+Cb500mg/L ;生根培养基:1/2MS+Kml00mg/L+Cb200mg/L+IAA0.2mg/L ;农杆菌培养用 YEB
培养基。Taq DNA聚合酶、限制性内切酶、T4连接酶、dNTPs、核酸分子质量标准、DNase 1、PrimeScript Reverse Transcriptase 和 SYBR Premix ExTaq Kit 均购自 TaKaRa 公司。质粒抽提和DNA凝胶回收试剂盒购自Axygen公司。植物RNA提取试剂盒Plant RNAKit购自Omega公司。卡那霉素(Kanamycin)、羧节青霉素(Carbenicillin)购自上海索莱宝生物科技有限公司。实施例1ρΒΙ121:: lec-s质粒的构建1.llec-s的克隆取大豆品种合丰29号叶片，使用Omega公司的Plant RNAKit植物RNA提取试剂盒提取大豆总RNA,用无RNase的DNase I处理纯化。使用PrimeScript ReverseTranscriptase (Takara)进行RNA反转录合成cDNA。以I μ g总RNA经反转录酶获得cDNA第一链为模板，lec-s-F/lec-s-R为引物，通过PCR反应扩增的到两端含有Xba I/Sma I酶切位点的lec-s基因片段。采用Axygen公司的AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒对PCR电泳条带进行回收。将回收的lec-s片段连接至测序载体pMD18-T Simple Vector,获得质粒pMD_18T Simple vector:: lec_s。质粒 pMD_18T Simple vector:: lec_s 转化 DH5 α 感受态细胞，使用Axygen公司的AxyPrep质粒DNA小量试剂盒提取初筛阳性克隆的质粒,经PCR筛选阳性克隆，从经PCR筛选的阳性克隆中提取的质粒，使用TaKaRa公司限制性内切酶进行酶切鉴定，将酶切验证正确的质粒送测序。PCR反应体系为:
权利要求
1.豆凝集素基因Iec-S在培育抗病和/或抗虫的转基因植物品种中的应用，其中，所述的大豆凝集素基因lec-s的GenBank登录号为DQ235094。
2.据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的抗病为抗烟草花叶病毒，所述的抗虫指抗甜菜夜蛾。
3.有大豆凝集素基因lec-s的重组质粒在培育抗病和/或抗虫的转基因植物品种中的应用，其中，所述的大豆凝集素基因lec-s的GenBank登录号为DQ235094。
4.据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的抗病为抗烟草花叶病毒，所述的抗虫指抗甜菜夜蛾。
全文摘要
本发明属于基因工程领域，涉及大豆凝集素基因lec-s的应用。本发明对大豆凝集素基因lec-s(GenBank登录号为DQ235094)进行了转基因烟草及其抗病抗虫性的研究，获得的转基因烟草对TMV表现出显著的抗性，对甜菜夜蛾也表现良好抗性。可见，大豆凝集素基因lec-s可在培育抗病和/或抗虫的转基因植物品种中应用。
文档编号C12N15/29GK103088035SQ201310008139
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月10日 优先权日2013年1月10日
发明者高学文, 郭佩佩, 伍辉军, 张岩 申请人:南京农业大学