专利名称：一种用于抗癌药物筛选的细胞共培养方法
技术领域：
本发明涉及细胞共培养技术，尤其是ー种用于抗癌药物筛选的细胞共培养方法。
背景技术：
全球毎年有700多万人死于癌症，抗癌药物一方面可杀灭癌细胞，促进患者的生理生化机能恢复正常；但另一方面也可能产生严重的毒副作用，因此，在抗癌药物筛选中对其进行临床前的细胞毒、细胞増殖或细胞凋亡检测、安全性评价意义重大。目前大多数科研人员在96孔板中进行抗癌药物筛选、细胞毒、细胞增殖或细胞凋亡检测研究，由于96孔板无法拆卸，癌细胞的代谢物无法作用于正常细胞，因此，単独培养ー种细胞无法考虑到体内癌细胞与正常细胞代谢物间的相互影响，此发明中的细胞共培养方法弥补了这方面的不足。市场上虽有用于细胞共培养的Transwell培养小室，但其价格 昂贵，且无法实现两种以上贴壁细胞的共培养，限制了细胞共培养研究的发展。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于抗癌药物筛选的细胞共培养方法，它能更好的模拟体内生成的微环境，极大的提高实验效率，节省抗癌药物研发费用，具有成本低廉、操作简单、效果可靠的特点。本发明是这样实现的用于抗癌药物筛选的细胞共培养方法，将酶标孔条拆分后放入6孔板中，将体积均为lOOul，密度均为2X IO4个/ml的癌细胞与正常细胞分别接种到每个独立的酶标孔中，待所有的细胞贴壁后，向各酶标孔中加入IOul待测药物，再向6孔板中加入DMEM培养液8ml，使酶标孔浸没在培养液中，共培养48h后，吸尽培养液，采用MTT法、台盼蓝染色法、CCK-8法、形态学观察法或hoechst染色法进行细胞毒、细胞増殖或细胞凋亡检测，从而实现抗癌药物的筛选。将酶标孔条进行拆分前，先将酶标孔在质量百分比为75%的こ醇中浸泡1. 5 2. 5h，然后在生物安全柜中风机开启模式下吹lh，再在紫外线下照射I 1. 5h。将酶标孔条进行拆分前，在无菌条件下用明胶或100ug/ml多聚左旋赖氨酸包被酶标孔。以促进细胞贴壁。所述的用明胶包被酶标孔具体是指，将明胶溶解在超纯水中，配制成0. 2g/100ml的明胶溶液，待明胶完全溶解后，在温度为121°C、压カ为100 110KPA的条件下，灭菌30min，将经过高压灭菌的明胶取出，获得配制好的明胶；在无菌条件下向每个酶标孔中加入15 ul配制好的明胶，将酶标孔底全部覆盖；再将包被了明胶的酶标孔放入37°C的ニ氧化碳培养箱中I个小时后取出，最后用无菌PBS或超纯水洗涤两次，毎次lOOul，用于下一歩接种细胞实验。所述的用多聚赖氨酸包被酶标孔具体是指，取分子量为15 30万的多聚左旋赖氨酸，溶于PBS或超纯水中，配成lmg/ml的储存液，将储存液过滤后置于_20°C冰箱中储存，使用时将浓度稀释至100ug/ml ;然后在无菌条件下向姆个酶标孔中加入15微升100ug/ml的多聚左旋赖氨酸，将酶标孔底全部覆盖，再将包被了多聚左旋赖氨酸的酶标孔放入37°Cニ氧化碳培养箱中5个小时或过夜后取出，用无菌PBS或超纯水洗涤两次，用于下ー步接种细胞实验。所述的无菌PBS是，称取1. 6g氯化钠、0. 04g氯化钾、0. 04g磷酸ニ氢钾、0. 44g磷酸氢ニ钠(分子式带7个结合水)或0. 588g磷酸氢ニ钠(分子式带12个结合水)，加入超纯水，溶解并定容至200ml，高压灭菌，在4°C下保存备用。所述的共培养是指用胰蛋白酶分别消化收集癌细胞与正常细胞，用倒置相差显微镜下计数，分别以2X104个/ml的浓度接种到各酶标孔中，每孔IOOul，待细胞贴壁后分别加入IOul待测药物，并以不加入药物的有细胞培养液为无药对照组，以无细胞的培养液为空白对照组，放入37°Cニ氧化碳浓度为5%的ニ氧化碳培养箱中共培养
胰酶可采用hyclone公司生产的产品，也可自行配制，配制方法为称0. 25g胰蛋白酶 粉末加入IOOmlPBS中，4°C过夜，0. 22um的滤膜过滤，_20°C保存备用。由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本发明采用的细胞共培养方法操作简单，所使用的酶标孔条、こ醇、明胶、6孔板或24孔板价格低廉，可根据实验需要进行拆卸、清洗、重复利用，且能实现两种以上细胞的共培养，其中6孔板每孔能同时容纳10个酶标孔，即可同时接种10种细胞，极大的提高了实验效率，节省了抗癌药物研发费用，另外，此方法能更好的模拟体内生成的微环境，在观察细胞与细胞、细胞与培养环境间的相互作用及探讨抗癌药物作用机制和可能作用的靶点等医学领域将有广泛的应用。本发明方法简单，使用效果好。
图1为不同浓度九香虫血淋巴作用48h对SGC-7901细胞形态的影响(400 X )； Al.为对照组；A2 A4.分别为20mg/L、30mg/L、40mg/L九香虫血淋巴处理组；
图2为不同浓度九香虫血淋巴作用48h对BGC-823细胞形态的影响(400 X )；
B1.为对照组；B2 B4分别为20mg/L、30mg/L、40mg/L九香虫血淋巴处理组；
图3为九香虫血淋巴作用24h对两株细胞增殖的抑制作用；
图4为九香虫血淋巴作用48h对两株细胞增殖的抑制作用；
图5为九香虫血淋巴作用72h对两株细胞增殖的抑制作用；
图6为胃癌SGC-7901细胞Hoechst33258突光染色(400X )；
A.无药对照组；B. 20mg/ml药物剂量组；C. 30mg/ml药物剂量处理组；D40 mg/ml药物剂量组；
图7为兔主动脉平滑肌CCC-SMC-1细胞Hoechst33258荧光染色；
A.无药对照组；B. 20mg/ml药物剂量组；C. 30mg/ml药物剂量组；D. 40 mg/ml药物剂量组。
具体实施例方式本发明的实施例1 :形态学观察法检测九香虫提取物对共培养的胃癌细胞系BGC-823和SGC-7901体外增殖的抑制作用，人胃癌细胞系BGC-823和SGC-7901分别由人体低分化胃腺癌和人体胃腺癌淋巴结转移后建系而成，代表着胃上皮细胞恶变和转移两阶段。将酶标孔条在质量百分比为75%的こ醇中浸泡2h，置生物安全柜中吹干，紫外线下照射lh，将明胶溶解在超纯水中，配制成0. 2g/100ml的明胶溶液，待明胶完全溶解后，在温度为121°C、压カ为100 110KPA的条件下，灭菌30min，将经过高压灭菌的明胶取出，获得配制好的明胶；在无菌条件下向每个酶标孔中加入15 ul配制好的明胶将酶标孔底全部覆盖；再将包被了明胶的酶标孔放入37°C的ニ氧化碳培养箱中I个小时后取出，最后用超纯水洗涤两次，毎次lOOul，用于下一歩接种细胞实验；将此酶标孔条拆成3孔3个，I孔I个放入6孔板中，取胃癌SGC-7901细胞与胃癌BGC-823细胞，用倒置相差显微镜下计数，分别以2X IO4个/ml的浓度接种到各酶标孔中，每孔IOOul，待细胞贴壁后分别加入不同浓度的血淋巴液(待测药物)IOul,反应体系中血淋巴终浓度为20mg/L、30mg/L、40mg/L，设置5个重复孔，I个空白对照，再向6孔板中加入8ml培养液，使酶标孔浸没在培养液中，在ニ氧化碳培养箱中37°C、体积浓度为5%的ニ氧化碳浓度下共培养48h后于倒置显微镜下观察细胞的状态(见附图1、2)。本发明的实施例2 =MTT法检测九香虫提取物对共培养的胃癌细胞系BGC-823和 SGC-7901体外增殖的抑制作用，人胃癌细胞系BGC-823和SGC-7901分别由人体低分化胃腺癌和人体胃腺癌淋巴结转移后建系而成，代表着胃上皮细胞恶变和转移两阶段。将酶标孔条在质量百分比为75%的こ醇中浸泡2h，置生物安全柜中吹干，紫外线下照射lh，将明胶溶解在超纯水中，配制成0. 2g/100ml的明胶溶液，待明胶完全溶解后，在温度为121°C、压カ为100 110KPA的条件下，灭菌30min，将经过高压灭菌的明胶取出，获得配制好的明胶；在无菌条件下向每个酶标孔中加入15 ul配制好的明胶将酶标孔底全部覆盖；再将包被了明胶的酶标孔放入37°C的ニ氧化碳培养箱中I个小时后取出，最后用超纯水洗涤两次，每次lOOul，用于下一歩接种细胞实验；将此酶标孔条拆成3孔3个，I孔I个放入6孔板中，取胃癌SGC-7901细胞与胃癌BGC-823细胞，用倒置相差显微镜下计数，分别以2X104个/ml的浓度接种到各酶标孔中，每孔IOOul，待细胞贴壁后分别加入不同浓度的血淋巴液(待测药物)IOul,反应体系中血淋巴终浓度为10mg/L、20mg/L、30mg/L、40mg/L，设置5个重复 し，I个空白対照，以无细胞的培养液为空白对照组，再向6孔板中加入8ml培养液，使酶标孔浸没在培养液中，在ニ氧化碳培养箱中37°C、体积浓度为5%的ニ氧化碳浓度下共培养48h后吸尽培养液，每孔加入5g/L的MTT溶液10 yl，在37°C继续孵育4h，每孔加入100 U IFormazan溶解液，继续培养4h，待结晶充分溶解，在波长570nm处测定OD值。抑制率的计算公式为抑制率(％ ) =1-(药物组OD值-空白对照OD值)/ (对照组OD值-空白对照组 OD 值)]X 100% (见附表1、图 3、4、5)。
权利要求
1.一种用于抗癌药物筛选的细胞共培养方法，其特征在于将酶标孔条拆分后放入6孔板中，将体积均为IOOul，密度均为2 X IO4个/ml的癌细胞与正常细胞分别接种到每个独立的酶标孔中，待所有的细胞贴壁后，向各酶标孔中加入IOul待测药物，再向6孔板中加入DMEM培养液8ml，使酶标孔浸没在培养液中，共培养48h后，吸尽培养液，用MTT法、台盼蓝染色法、CCK-8法、形态学观察法或hoechst染色法等进行细胞增殖、细胞毒或细胞凋亡检测，从而实现抗癌药物的筛选。
2.根据权利要求1所述的用于抗癌药物筛选的细胞共培养方法，其特征在于将酶标孔条进行拆分前，先将酶标孔在质量百分比为75%的乙醇中浸泡1. 5 2. 5h，然后在生物安全柜中风机开启模式下吹lh，再在紫外线下照射I 1. 5h。
3.根据权利要求1所述的用于抗癌药物筛选的细胞共培养方法，其特征在于将酶标孔条进行拆分前，在无菌条件下用明胶或lOOug/ml多聚左旋赖氨酸包被酶标孔。
4.根据权利要求3所述的用于抗癌药物筛选的细胞共培养方法，其特征在于所述的用明胶包被酶标孔具体是指，将明胶溶解在超纯水中，配制成0. 2g/100ml的明胶溶液，待明胶完全溶解后，在温度为121°C、压力为100 110KPA的条件下，灭菌30min，将经过高压灭菌的明胶取出，获得配制好的明胶；在无菌条件下向每个酶标孔中加入15 ul配制好的明胶，将酶标孔底全部覆盖；再将包被了明胶的酶标孔放入37°C的二氧化碳培养箱中I个小时后取出，最后用无菌PBS或超纯水洗涤两次，每次IOOul，用于下一步接种细胞实验。
5.根据权利要求3所述的用于抗癌药物筛选的细胞共培养方法，其特征在于所述的用多聚赖氨酸包被酶标孔具体是指，取分子量为15 30万的多聚左旋赖氨酸，溶于PBS或超纯水中，配成lmg/ml的储存液，将储存液过滤后置于_20°C冰箱中储存，使用时将浓度稀释至100ug/ml ;然后在无菌条件下向每个酶标孔中加入15微升100ug/ml的多聚左旋赖氨酸，将酶标孔底全部覆盖，再将包被了多聚左旋赖氨酸的酶标孔放入37°C二氧化碳培养箱中5个小时或过夜后取出，用无菌PBS或超纯水洗涤两次，用于下一步接种细胞实验。
6.根据权利要求4或5所述的用于抗癌药物筛选的细胞共培养方法，其特征在于所述的无菌 PBS 是，称取1. 6gNaCl、0. 04gKCl、0. 04gK H2P04、0. 44gNa2HP04 *7H20，加入超纯水，溶解并定容至200ml，高压灭菌，在4°C下保存备用。
7.根据权利要求1所述的用于抗癌药物筛选的细胞共培养方法，其特征在于所述的共培养是指用胰蛋白酶分别消化收集癌细胞与正常细胞，用倒置相差显微镜下计数，分别以2X104个/ml的浓度接种到各酶标孔中，每孔lOOul，待细胞贴壁后分别加入IOul待测药物，并以不加入药物的有细胞培养液为无药对照组，以无细胞的培养液为空白对照组，放A 37°C二氧化碳浓度为5%的二氧化碳培养箱中共培养。
全文摘要
本发明公开可一种用于抗癌药物筛选的细胞共培养方法，将酶标孔条拆分后放入6孔板中，将癌细胞与正常细胞分别接种到每个独立的酶标孔中，待所有的细胞贴壁后，向各酶标孔中加入待测药物，再向6孔板中加入DMEM培养液，共培养吸尽培养液，用MTT法、台盼蓝染色法、CCK-8法、形态学观察法或hoechst染色法等进行细胞增殖、细胞毒或细胞凋亡检测，从而实现抗癌药物的筛选。本发明采用的细胞共培养方法操作简单，成本低廉，可根据实验需要进行拆卸、清洗、重复利用，且能实现两种以上细胞的共培养，极大的提高了实验效率，节省了抗癌药物研发费用，能更好的模拟体内生成的微环境。
文档编号C12Q1/02GK103014118SQ20131000812
公开日2013年4月3日 申请日期2013年1月10日 优先权日2013年1月10日
发明者檀军, 郭建军, 魏超, 杨佳琪, 李刚 申请人:贵州大学