专利名称：用于筛选被遮蔽的或部分被遮蔽的细胞的方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明总的来说涉及一种用于筛选被另外的细胞种群遮蔽或部分遮蔽的细胞的方法和装置，这些细胞表达了用于研究、诊断或工业目的的选择特性。更具体说，该发明涉及一种利用微球体分析该被遮蔽的细胞的方法，该微球体带有键接于其上的特殊的单克隆抗体，使人们对这些被遮蔽的细胞从一个细胞种群到另一个细胞种群的检测特性发生兴趣。
本发明总的说来涉及一种自动分析仪和使用该分析仪的方法，用于筛选用来对种群计数的生物细胞或形成体，这些种群表示用于研究、诊断、医学或工业目的选择特性。更具体说，利用本发明的该自动分析器和方法使得能够对细胞和形成体进行多重部分分类，细胞和形成体的功能性显示，在其他的细胞之中鉴定白血病、淋巴组织瘤和硬肿瘤细胞，利用了一种电子技术和光学技术的独特的组合和选择的生物分子的特异性，例如抗体的特性对这些细胞和形成体来进行这样的筛选和选择性计数。
借助Coulter Electronics，Inc.of Hialeah，Florida出品的COULTER COUNTER(注册商标)Model A成功地实现了利用一台自动血细胞计数器对人的外周血进行常规全血细胞(CBC)分析的自动化。在美国专利2656508(1953年10月20日授予Wallace H.Coulter)公开了这种仪器的电子颗粒检测系统原理。仅借助于这种Coulter电子检测原理工作的颗粒分析测量装置，就避免了使用容易出故障而又价格昂贵的光学检测装置或激光器。
这种Coulter检测原理得到发展并扩展成为更高级的仪器设备，例如COULTER COUNTER(注册商标)Model S型仪器，该仪器能借助于专门的计算机程序进行CBC参数测定，绝对细胞计数，血小板计数和形态分析，红血细胞(RBC)形态分析，从而解释正常的和不正常的血液样品。
Coulter电子粒子检测原理应用了一个使用一种直流(DC)孔电源的孔检测电路。这种粒子检测器结构简单、极其坚固和可靠，在美国以及所有世界其他地区，在临床实验室中都普遍采用COULTER COUNTER自动分析仪，这就证实了以上结论。在美国专利3502974(1970年授权于Wallace Coulter和Walter Hogg)中公开了在这种基本的孔检测电路的一种改进。除去标准的直流孔电源之外，还加有一种高频孔电流，这种电流使得能够检测用于分类目的一种附加参数。高频孔电流产生一信号，该信号是血细胞的内导电率以及其体积的函数。由直流孔电路同时产生的信号是一种普通的DC振幅信号，该信号主要提供关于细胞体积的信息。利用一高速除法器电路用该直流脉冲振幅去除该射频振幅，得到一商，该商是细胞体积和内电阻的函数，一般称为“浊度”。这一原理在美国专利3502973(又于1970年授权于Wallace Coulter和Walter Hogg)中进一步得以说明。这一参数在细胞分类系统中具有适用性。或者是一个单孔，或者是一对隔开的孔，可以利用于这种目的。
不同种群的分类是借助于在那些信号对产生时对这些信号对数据加以依次整理来完成的;一个信号是粒子体积测量值，另一个是细胞内电阻率或浊度的测量值。显示这种数据的一种方便的形式就是借助于二维绘图，称之为散布图或相关图。这种图在以下文献中有详尽说明，所述文献是flow Cytometry and Sorting，Page 371;由Melamed Melaney和Medelsohn编著，1979，John Wiley ∞ Sons，NY，NY.出版。
图5A是正常血的一个样品的数据图的一个例子。每一个点表示一个单独的细胞。基线以上的高度表示该细胞的相对体积。该点到垂直基线右侧的距离表示相对浊度。正常白血细胞(WBC)的图(除去了红血细胞)显示出表示三个不同种群的三个群集，这些群集是在尺寸上和内部组成上这些种群固有差别的反映。如果需要的话，可以利用适合的电路对这些种群进行计数，以便获得每一个种群的数目。根据这些内在的差别这些细胞得以分类。
Coulter电子粒子检测原理的最初的应用是进行红血细胞计数，后来进行有关其他红血细胞参数的更复杂的测量。通过从整个外周血中除去红血细胞的方式可以对白血细胞种群进行检测，只要红血细胞的消除没有明显地损害准备测量的剩余的白血细胞种群的性质。为此目的，红血细胞溶血试剂得以发展，尽管这种试剂是很有用的并且已被广泛使用，但它对于接下来的白血细胞测定来说在各方面从整体上来说仍然是不能令人满意。
上述就单独使用直流体积或使用各个角度光散射进行白血细胞流式分析的方法已显示出三群集白血细胞，分别相应于淋巴细胞、单核细胞和粒性白血细胞，粒性白血细胞包括嗜中性、嗜碱性和嗜酸性这三个种群。根据一些采样能对嗜酸性种群浓度作一个粗略的有用的估计。对于这种方法第五主种群相对说来是太小了。采用专门的荧光技术也已观察到清晰的群集嗜酸种群。
这些荧光技术已用于柯尔特公司的EPICS(注册商标)流式血细胞计数器之类的流动式血细胞计数仪器。此类仪器应用了细胞在鞘流(sheathflow)限定的一个柱流中排成一个单行逐个通过激光束的方式细胞运动的原理。从这些细胞来的光散射和/或荧光信号就用来对细胞种群进行分类。染有吸收或荧光染料的细胞使得有可能对另外的细胞种群进行分类。用于自动多参数分析的仪器设备和荧光染料的这种进展由R.C.Leif等人在Clinical Chemistry，Vol.23，pp.1492-98(1977)中作了进一步说明。这些进展将同时进行白血细胞种群分类数扩展为四个，即淋巴细胞、单核细胞、嗜酸细胞和“粒性细胞”(嗜中性细胞和嗜碱性细胞)。
更新近的分析血液学仪器已经将光散射技术与细胞的过氧化物酶染色(吸收染料)一起使用，以产生五部分白血细胞分类。此外，配有诸如单克隆抗体之类具有特殊反应的生物分子的结合染料已将白血细胞分类数增加到可能包括功能细分类。
在申请号为023，345、申请日为1987年3月13日，题为“用于表达选择特性的种群计数的筛选细胞或形成体的自动分析仪和方法”的第一个原始美国专利申请中公开了一种得到改进的利用同样原理的单个自动分析仪和方法。该原始申请将电子检测孔原理、用于对指定的细胞种群或形成体进行鉴别和/或计数的选择性生物分子的特性和微观粒子技术加以组合。该自动分析器可以同专门的溶血剂和/或耦合在微球体或成分变化的支撑物上的抗体一起使用。
申请号为285，856、申请日为1988年12月16日，题为“用于筛选带有表达选择特性的种群的细胞或形成体的方法和装置”的第二个原始美国专利申请公开了从全血样或其中某些部分中筛选直接的子种群。
申请号为339，156、申请日为1989年4月14日;题为“至少利用一种检测参数用来筛选带有表达选择特性的种群的细胞或形成体的方法和装置”的第三个原始美国专利申请公开了多部分或五部分白血细胞组分，淋巴细胞子种群和根据一全血样或借助于淘汰一些种群或其子群体的方式被除掉红血细胞和白血细胞种群的样品、利用一种或多种光或电子参数完成的重叠测定。
具有选择性吸附能力的细微粒子使有可能修改决定这些种群的至少一个种群原来位置的参数。把细微粒子大量加到所选定的靶种群上会影响所测的体积和/或浊度，结果引起表示一个种群的那些点的位置发生变化。
已知特性的抗体被用来包覆细微粒子。这种包覆赋予该粒子以选择性地附着在一定的细胞上的能力，这些细胞表征与该抗体专门作用的抗原。这些被包覆或加标记的细胞是粒子与细胞的组合体，犹如是一个新的整体一样。它们的浊度、体积或浊度和体积两者的参数可以看成表示在所获得的信号中细胞和粒子两者作用的总和。如果成分特性不同，则按净效应而言，新的整体将移动到一个新的位置。这个新的位置与只是细胞的情况下从前的位置大大的不同，应该能用来对诸如此类的新的整体或新的整体群进行分类。如果附着在细胞上的粒子是磁性粒子，那么，当然按这时粒子的特性，可以用磁铁来捕获这些新的整体。如果混合得很快，就会出现出乎意料的结果，其中包括完全捕获一个种群而对所研究的细胞的特性并无有害影响。
从一个血液样品中可以很容易地对仅有三个的不同的种群进行识别和计数，这是利用了它们以前所述的直流体积和浊度参数的固有的和独特的特性。为了能对更多的种群检测和计数，必须采取一些诸如改善溶胞系统的步骤，当然，表示被称为淋巴细胞、单核细胞和粒性细胞的三个基本种群的子种群。根据本原始申请所进行的这些步骤说明了这三个基本种群的子种群是如何获得的。
使用配合二种或更多种生物微粒检测技术那些简单的微孔，就能使表示一给定种群的群集出现在一个独特的和新的位置上。种群在点散布图或相关图上的这种有选择性的移动是可以重现的，并可以用来对从这三个基本种群中分离出的一个种群进行分类。
通过把微粒附着在所选定的各个细胞上，就能修改直流体积和浊度检测技术原来的固有的组合方式。由于生物分子、抗体其中包括在它们表面上用作涂覆层的物质的性质和特殊性能赋予这些微粒具有选择能力。仅仅是一个细胞种群，如果在其表面并没有微粒，可能占据一个与其它种群或子种群没有什么区别的点散布图位置，因而不能相互区分。用这种方法能把具有选择附着能力的微粒加到我们所要识别、计数和研究的一个具体细胞的种群上去。把足量的具有选择能力的微粒有选择地加到一个性质不同的所研究种群上，由于质量、体积和浊度的这种新的独特的结合导致那个种群的点散布图位置发生偏移。
把指定的细胞种群分离出来并不会严重影响剩下的细胞种群的性质。举例来说，按照本发明从全血中除去红血球或红血细胞(RBC)就能测量T4和/或T8淋巴细胞。使用迄今为止一直使用的化学RBC溶胞剂没有其他可能。T4/T8细胞的比值已经用来表示与严重的病毒感染(其中包括爱滋病病毒)相一致的免疫缺乏症。细胞表面存在着特殊的受体，这可用来把一个种群划分为一些子种群，对这种子种群进行计数可以检测疾病的发作。例如白血病流行的形式中是外周血淋巴细胞的急剧增加。如果有快速增殖的淋巴细胞携带有T11受体的子群体，那么这个病人就有免疫不正常的危险。
再者，如果T11阳性淋巴细胞的子种群具有T4受体，则这个患者就被划分为通常在日本发生的那一类病人。这些细胞被定义为“重叠”，因为这些细胞至少包括人们所感兴趣的两种受体或抗原。重叠可能是一种诊断和治疗的重要的参数。在正常的全血样品中重叠种群的例子就是CD2和CD8子种群。种群的一种不正常的重叠的例子是在CLL(慢性淋巴细胞白血病)中发现的。在CLL病态，CD5和CD20子种群重叠。此外，如果T4受体子种群扩展为2H4阳性，那么病人不仅说明有多种感染的趋势，而且患有急性白血病，同样因为T11、T4、2H4向性细胞是抑制诱导体并且功能地抑制了患者产生抗体的能力。因此，该患者受到多种感染，必须进行接受对白血病和免疫缺乏的治疗。参考K.TaKatsuki，et al.，GANN monograph on Cancer Research 2813-22，1982;C.Morimoto，et al.，Coulter Japan Symposium，1984;C，Morimoto，et al.，Immunology 134(3)1508-1515，1985;C.Morimoto，et al.，New England Journal of Medicine 316(2)67-71，1987.本发明还可用于对诸如在其中包括细菌和病毒的形成体的悬浮液进行分析。
应用本发明的方法和装置可用于各种免疫反应，例如包括反应剂和形成体或细胞的免疫反应。本发明还用于分析形成体悬浮物，例如在其中包括细菌和病毒。在这里使用时，细胞被限定为动物或植物细胞，包括细胞细菌、真菌，这些细胞单独地或聚合都可以认为是相同的。细胞是可以作为一个独立单元起作用的活的物质的最简单结构的集合。例如，这些细胞可以是取自组织或血样的人体RBC和WBC种群，癌或其他不正常细胞。形成体被限定为某些细菌或病毒。本发明可用于对病人的诊断和监视。本发明尤其可用来除去或转移种群以分析用别的方法不易识别的种群或子种群。适于加标记或示踪的细胞和形成体可以有理由认为是可以用本发明的方法和装置以与人体血细胞样品相同的方式检测。
尽管“反应物”这个词在原申请中已被用来定义溶胞剂和单克隆抗体，反应物还可以包括检测并与一种或多种特殊的分子反应的各种试剂，而所述特殊的分子是在细胞形成体的表面上。以下给出一些例子反应物 特殊的分子抗体 抗原药物 药物受体激素 激素受体生长因子 生长因子受体该反应物偶合或键合于该细胞特殊的分子上。这些反应物的确形成了化学反应的一部分;然而，这些反应物不是必然的化学改变。
本发明提供了一种单独的多用途分析仪和使用该仪器的方法，该仪器将最低限度的电子和/或光微粒检测技术与具有选择能力的生物分子的特殊性能相结合，大大促进了用于临床实验室和工业的自动分析仪器领域的发展。人体外周血液中的多种白血细胞子种群的检测和它们的相互关系对医学研究和人体疾病诊断是十分重要的。这些数据对诸如白血病之类的疾病进行鉴别和诊断的筛选手段是很有用的。用执行本发明来鉴定不正常的情况提供了诊断有关的信息，研究范围并不限于检测白血细胞种群，正如本发明的说明书和附图所显示出的那样。
本发明的一个极有价值的特点是应用了单独的稳定的Coulter检测操作。这种操作是十分稳定而且不需要复杂昂贵的光学系统，但如果需要的话也可以使用光检测。附加RF振荡器和检测器所需的电路装置经济、坚实和可靠。所需要的就是一个单孔，但附加一个第二孔或甚至第三孔可能经济地使更大的样品通过量成为可能。
一种用于完成筛选被遮蔽的或被部分遮蔽的细胞的方法和装置，以对诸如白血细胞种群子种群的一种或多种被遮蔽的细胞计数。该被遮蔽的细胞或白血细胞种群子种群通过鉴定由被研究的细胞来表达的选择特性来进行计数。
可以对一种全血样或其一部分进行筛选，以提供所需要的对诸如该样品中的一种白血细胞种群子种群的一种或多种被遮蔽的细胞的分析。例如，要详细地描述这种白血细胞种群，包括被遮蔽的被研究的子种群的一个白血细胞种群首先同一种标准种群一起进行计数。这种标准种群可能是全部白血细胞种群中的一个，一个不遮蔽被研究子种群的被转移或未被转移的被检测特性的第二白血细胞种群，一个也不遮蔽被研究子种群的被转移或未被转移的被检测特性的由微球体形成的人造种群或一个该子种群的被检测特性将全部或部分地被转移为其特性的白血细胞种群。于是，被研究的白血细胞种群子种群的被检测特性通过将具有专门用于该白血细胞种群子种群的单克隆抗体的微球体键接到该细胞种群上而被转移。而后再一次对该白血细胞种群和该标准种群进行计数并与原计数值加以比较以获得被研究的白血细胞种群子种群的计数值。
现在，我们借用举例的方式，参考本说明书的附图来描述本发明的一些最佳实施例。
因此，本发明的第一个目的是提供一种从一个样品的至少一部分中获得一个被遮蔽的或被部分地遮蔽的种群分析的方法，该样品的这一部分中至少含有一个包括至少一个被研究的种群子种群的第一细胞种群和第二细胞种群，其特征在于通过电子方式对包括至少第一细胞种群及其子种群的一个第一种群进行检测和计数以产生第一计数值，将被研究的细胞种群子种群从所述第一细胞种群中转移出来并且至少部分地转移到一个第二细胞种群中，通过电子方式对包括至少第一细胞种群及其子种群的剩余的第一种群进行检测和计数以产生一个第二计数值，以及比较所述第一和第二计数值以获得被研究的细胞种群子种群的百分比贡献。
本发明的第二个目的是提供一种用于从一个样品的至少一部分中获得一种被遮蔽的或被部分地遮蔽的种群分析的一个装置，这一个样品的一部分至少含有一个包括至少一个被研究的种群子种群的第一细胞种群和一个第二细胞种群，其特征在于它包括用于通过电子方式对一个包括至少第一细胞种群及其子种群的第一种群检测和计数以产生第一计数值的部件;用于把所研究的细胞种群子种群从所述第一细胞种群中转移出来并且至少部分地转移到第二细胞种群中的部件;用于通过电子方式对剩余的包括至少第一细胞种群及其子种群的第一种群进行检测和计数，以产生一个第二计数值的部件和用于比较第一和第二个计数值以获取所研究的细胞种群子种群的百分比贡献的部件。
图1-13描述那些在申请号为025，345的第一原申请中所公开的实施例。
图1是原申请的一个细胞种群分析器实施例的图解方框图;
图2是原申请的第二分析器实施例的图解方框图;
图3是相应于图1和图2的原申请的一个具体的分析器实施例;
图4是原申请的另一个分析器实施例的原理方块图;
图5A和图5B是用类似于图2和图3所示的典型分析器系统得到的一组结果的点散布图;
图6是原申请又一个分析器实施例的原理方块图;
图7是原申请再一个分析器实施例的原理方块图;
图8A和图8B、图9A和图9B;图10A和图10B，图11A和图11B是用类似于图6和图7所示的典型分析器系统得到的一组结果的点散布图;
图12是原申请又一个分析器实施例的原理方块图;
图13是用类似于图12所示的典型分析器系统得到的一组结果的点散布图;
图14-26D描述那些在申请号为285865的第二个原申请中公开的实施例;
图14是原申请的一个WBC种群子种群分析器实施例的原理方块图;
图15是原申请的一个WBC种群子种群分析器实施例的另一个的原理方块图;
图16是原申请相应于图14和图15的一个具体分析器实施例;
图17A和图17B是用类似于图3和图16所示的典型分析器系统得到的一组结果的点散布图;
图18A是L.M和G种群的点散布图，而图18B是L.M和B种群的点散布图，这些结果是用类似于图16所示的典型分析器系统所获得的;
图19A-D，图20A-D和图21A-D是不同患者样品的CD4，CD8，CD2和CD20子种群的点散布图;
图22A是类似于图18A的点散布图，图22B是说明E种群和N种群偏移的点散布图，而图22C是说明E.N和CD4种群偏移的点散布图;
图23A-D是说明利用一个键合到所研究的WBC子种群上的微球体和一个键合到第一微球体上的第二微球体的一个直接的WBC子种群分析的点散布图;
图24A-C是说明在原申请的偏移分析中所利用的微球体尺寸影响的点散布图;
图25A-D是说明一个利用原申请的技术同时分析二个WBC子种群的点散布图;
图26A-D是在不同参数点散布图上说明相同的一些种群的点散布图;
图27-46描述一些申请号为339156的第三原申请的实施例;
图27是该原申请的一种单式检测参数几部分WBC种群子种群分析器实施例的一种原理方块图;
图28是对应图27的该原申请的一个具体的分析器的实施例;
图29A-D是用一个类似于图27和图28典型分析器系统和一个DC检测参数得到的一组结果的点散布图;
图30A-D是利用一种RF检测参数的图29A-D的同样结果的点散布图;
图31A-D是利用一个类似于图27和图28的典型分析器系统和一种DC检测参数得到的第二组结果的点散布图;
图32A-D是利用一种RF检测参数得到的图31A-D的相同结果的点散布图;
图33-36是说明使用一个单独的光检测参数的得到的结果的点散布图;
图37是关于增强小的或遮蔽种群的一种WBC种群子种群分析的原理方块图;
图38A-E是利用一种类似图27和图37所示的典型分析系统和一种RF检测参数所获得的一组结果的点散布图;
图39A-E是利用一种DC检测参数得到的另一组结果的点散布图;
图40A-E是利用一种RF检测参数得到的相同的一组结果的点散布图;
图41A-E是利用二个检测参数得到的一组结果的点散布图;
图42A-G和图43A-G是在二个各自的不正常的血样中利用不同的检测参数所得到的结果的点散布图;
图44是用于测定细胞重叠分类的本发明一种WBC子种群分析实施例的原理方块图;
图45A-D和图46A-D是利用类似于图27和图44所示的一种典型分析器系统和一个DC检测参数所得到的二组结果的点散布图;
图47-60涉及本发明的若干实施例;
图47是本发明的一白血细胞种群子种群分析器的一个原理方块图;
图48A和图48B是说明在本发明中所利用的分类法的概念的点散布图;
图49-60是利用本发明的分类法分析被遮蔽或被部分遮蔽的白血细胞种群子种群所得结果的点散布图。
图1-13描述了申请号为025345的第一原申请的一些实施例。
参照图1，申请号为025345的原申请的细胞这种群分析方法和装置的第一个实施例一般用编号10表示。分析器(10)包括一个含有至少一个第一组活的生物细胞(没有示出)的生物样品(12)，例如在全血样中或从全血样中取出的细胞。生物样品(12)的细胞在进行定量和/或定性测定或分析时被卷入一生物反应，样品(12)中可能还含有缓冲液，所述细胞就加进这种缓冲液中。
样品(12)经通路(14)与经通路(18)的至少一种反应物(16)混合。然后，由在功能上被指定为RBC除去部位(20)将红血细胞(RBC)从混合物中清除。部位(20)可以用若干种方法将所述那些RBC从该混合物中清除。RBC可用溶胞剂在反应物(16)中细胞溶解。一种这样的优先选用的溶胞剂和可以利用的一种猝灭剂在题为“Method And Reagent System for Isolation Identification and/or Analysis of Leukocytes from whole Blood Samples”(申请号为130911，申请日为1987年12月10日)的申请案中被公开，该案是申请号为025303，申请日为1987年3月13日，题目相同的CIP，在这里仅作参考。反应物(16)可能是或者包括许多带有抗体的磁性微球体，这种抗体是专门用于RBC键接在这种微球体上(未示出)。在这个例子中，所利用的这种特殊的红血细胞专用抗体在题为“Monoclonal Antibody for Recovery of Leukocytes in Human Peripheral Blood and Method of Recovery Employing said Monoclonal Antibody”(申请号为799489，申请日为1985年11月19日)的申请案中被公开，该申请案在这里仅作参考。除样品缓冲液之外反应物(16)还可能包括一种缓冲液，而且反应物(16)还可以包括一种缓冲液代替样品缓冲液。反应物(16)还可能是一种所述优先选用的溶胞剂和所述RBC专用微球体的组合体。
一旦RBC基本上从混合物中被清除，这一部分混合物就通过通路(24)送到白血细胞(WBC)分析器(22)。WBC分析器(22)至少要对混合物中的WBC进行计数。WBC分析器(22)还能测量WBC的一个或多个体积或浊度参数。分析器(22)得出的结果通过线路(28)送到比较器(26)。
第二部分RBC贫化的混合物通过通路(32)送到WBC子种群减去部位(30)。有许多方式能从混合物中减去WBC。带有专门对WBC某一子种群的单克隆抗体的微球体能加到混合物中。该子种群被键接到那里。非磁性微球体能键合在WBC上，以改变或移动该细胞的生成物浊度和体积参数。磁性微球体也能键合到WBC上，于是这些WBC就能用磁场从该混合物中清除。
还除去WBC子种群或已改变一个或几个参数的混合物而后就通过通路(36)送到WBC子种群分析器(34)。分析器(34)可以与分析器(22)是相同的。然后，由分析器(34)得到的结果通过线路(38)送到比较器(26)。然后比较器(26)能把分析器(22)送来的WBC结果与分析器(34)送来的经过修正的结果加以比较，以确定所选定的白血细胞种群的至少一个特征，例如在一个特殊范围的细胞数。
参照图2，实施原申请的细胞种群分析方法和装置的第二个实施例简略地用参考数字(40)标记。分析器(40)包括也含有至少一个第一组活的生物细胞(未示出)(例如在全血样中或从全血样中取出的细胞的)生物样品(42)。生物样品(42)的细胞在进行定量和/或定性测定或分析时要卷入一生物反应。样品(42)也可以包括有一种缓冲液，细胞就加进这种缓冲液中。
样品(42)通过通路(44)与通过通路(48)的至少一种反应物(46)混合。在分析器(40)中，由在功能上被指定为去除RBC和移动WBC的部位(50)在除去混合物中的RBC的同时改变或移动至少一个WBC子种群的至少一个特性。如上所述，该部位可以按许多方式来除去混合物中的RBC，这在前边就部位(20)已经列举过了。同时，在这相同的混合物部分中，WBC被键合在通常是非磁性的微球体上，以改变或移动细胞的生成物浊度和/或体积参数。
然后，已除去RBC和已移动WBC子种群的混合物通过通路(54)送到分析器(52)。分析器(52)可基本上与分析器(22)相同。因此，分析器(40)对一个选定的WBC种群或WBC子种群的至少一个特性提供了快速的直接的分析。
实施原申请并能完成第一和第二分析器(10)和(40)的分析的一种分析器装置的具体的实施例在图3中一般用参考数字(56)来标记。
在仪器(56)中，只表示出一个具体的记数，按照原申请的原理可以作出几乎无数种变化。再者，对仪器(56)显示的是在一般的功能上的细节，而具体的实施例可以按许多已知的方式完成其结构。
仪器(56)包括一个用来将所研究的生样品，如样品(12)或(42)，抽入仪器(56)的吸气泵机构(58)。吸气器(58)通过通路(60)与连接到采样探头(63)上的采样阀(62)连接。溶胞剂泵(64)可以含有诸如反应物(18)或(46)那样溶胞剂一部分，而且通过通路(66)也与阀(62)相连接。在适当的时机，阀(62)和泵(58)可以与经泵(64)而来的溶胞剂一道吸取生物样品(12)或(42)。
而后，反应物的混合物或生物样品本身经由泄放通路(68)送到混合装置(70)。混合器(70)包括一个送入样品或反应物的混合室(72)。在这一点上分析器(10)和分析器(40)的工作不一样，因此，将分别加以描述。
在分析器(10)的情况下，如果RBC已经被来自泵(64)的溶胞剂溶胞，则在反应完成时从部位(74)经由通路(76)供给猝灭剂或固定剂。搅拌混合室(72)内的溶胞剂和样品可以促进反应，如同在(78)所表达的功能那样。
在这里可以采用的合适的混合装置(70)的具体细节在申请号为025337、申请日为1987年3月13日，题为“Method And Apparatus for Rapid Mixing of Small Volumes For Enhancing Biological Reactions”的申请案中被公开，该申请案在此被收作参考。通过使用混合器(70)，反应速度大为提高，但并没有明显地损害我们所研究的细胞特性，而如用提高反应温度的办法，则细胞特性受到损害。进一步说，通常反应可以在远小于1分钟时间内完成，一般是大致15秒或更短。这使自动化程度高的体积分析仪(56)可以进行高速分析。
而后，被溶胞剂除去RBC并已停止反应的反应物(即自部位(20)送出的)经由通路(80)送到容纳室(82)，在这种情况下，该室将容纳该混合物的第二部分。该混合物的第一部分将从室(82)经由通路(84)送到WBC分析器(86)(即分析器(22))。按照Wallace H.Coulter在美国专利2656508中所说明的和在Coulter电子公司经销的大量商品血细胞计数器中所实施的计数和尺寸测量的技术，分析器(86)可以具有许多实际类型。
通常，分析器(86)包括一个流动式检测器或检测室(88)。室(88)包括一个具有一个贯通孔(92)的变换器。室(88)包括一个具有一个与那里的流体接触的第一电极(96)的第一部分(94)。
该室的第一部分(94)和电极(96)通过孔(92)与其中具有一个第二电极(100)的室第二部分(98)相连通。电极(96)和(100)通过反馈导线(102)和(104)与RF/DC源和检测电路(106)相连。电路(106)将直流或低频电流或信号和在电极(96)和(100)的高频信号两者偶合。
低频信号用来检测由通过孔(92)的一个细胞所引起的信号脉冲的振幅。高频信号用来获得通过孔(92)的同一细胞的电浊度。
Wallace H.Coulter和Walter R.Hogg在美国专利3502974以及以后的几个专利中，以及Coulter Electronics Inc.经销的出版物中对测量细胞的电浊度作了说明。一种能在这里应用的具体的电路在题为“Particle Analyzer For Measuring the Resistance and Reactance of A Particle”的案例168008中被公开，该案例的申请日为1986年10月21日，现在的美国申请号为921654，该申请案在此列入参考。
由电路(106)从被检测细胞产生的信号经由DC信号引线(108)和RF信号引线(110)耦合到比较器(112)[类似于比较器(26)]。比较器(112)可以存储从第一部分，即没有减去WBC子种群的那部分，产生的信号，以便与从所述第二部分得到的结果相比较。
分析器(86)可以包括一个以众所周知的方式将细胞聚集到检测器(88)的鞘流，该鞘流可以由射流系统(114)提供，该系统用一对通路(116)和(118)以一种已知的方法与检测器(88)相连。样品反应混合物可以经导入管(120)送入检测器(88)，也能经排出管(122)从检测器(88)排到废液容器(124)中。
当该混合物的第一部分正在分析器(86)内进行分析时，该混合物的第二部分就保存在室(82)里，而混合器(72)由清洗通路(120)清洗或冲洗，并通过废水通路(128)排出。一旦室(72)清洗完毕，第二部分经通路(130)返回室(72)。象部位(30)一样，现在通过加入经通路(134)、阀(136)和室通路(138)自部位(132)送出的WBC微球体的方法把WBC子种群减去。
用混合机构(78)将WBC微球体与第二部分混合。如果WBC微球体是非磁性的，则键合有WBC的微球体的反应混合物经通路(80)、室(82)以及通路(84)送入分析器(86)[即分析器(34)]，在那里对第二部分进行类似对第一部所进行的那样的分析。然后，将这结果在比较器(112)[即比较器(26)]里比较。在第二部分由所述WBC子种群键合微球至少改变了所述WBC子种群细胞参数的一个，例如细胞浊度，以便提供被改变了的结果，然后可以对这些结果进行分析。
如果这WBC微球体是磁性的，键合在微球体上的WBC子种群在混合过程中和/或混合以后用一个磁场或磁铁(140)除去。该磁场可以由电磁部件或由相对于室(72)以物理学方式被移动的磁体(140)产生，以用磁性方式捕获被键合的WBC子种群。而后不带键合的WBC子种群的第二部分经通路(80)、室(82)以及通路(84)送到分析器(86)用以上所述方式以便得到分析[类似于分析器(34)]。
此后，装置(56)准备为下一次分析取样。探头(63)可以用探头清洗机构(142)进行清洗，而一些通路及室(72)和(82)可以很方便地加以冲洗。以后的样品混合物的每一次分析都可以以一种快速的自动的方式来进行。在以后的样品混合物的各次分析之间的时间间隔大约是几分钟或更少一些。
在操作分析装置(56)时，与分析器(40)类似，含有RBC溶胞剂/反应物(46)和样品(42)的反应混合物在室(72)中与来自部位(132)的键合有WBC子种群之一的非磁性WBC微球一道相混合。猝灭剂(74)被加到反应混合物中，而后将该混合物经通路(80)、室(82)以及通路(84)送到分析器(86)进行分析[即类似于分析器(52))。
在分析器(10)和(40)任何一种，作为一个代替使用溶胞剂的方法，样品(12)或(42)都可以经阀(62)送入混合器(70)而不带有任何溶胞剂。在这种情况下，可以利用键合有RBC专用抗体的微球体以磁性方式除去WBC，这些微球体由一个RBC微球体部位(144)经通路(146)送到阀(136)，再经通路(138)送到室(70)。在那里不使用溶胞剂，在混合后键合有RBC的微球体用磁铁(140)以磁力除去，其方式大致与前面所述以磁力去除键合有WBC的微球体的方式相同。
此外，在第二种促进反应速度的情况下，可以利用既含RBC溶胞剂又含有RBC磁性球的样品的反应混合物。搅拌反应混合物，溶胞作用被猝灭，键合的RBC以磁力除去，然后进行如上所述的WBC分析。
现在参照图4，实施原申请的细胞种群分析方法和装置的另一个实施例，总的用参考数字(148)标记。分析器(148)包括一个生物样品(150)，该生物样品也至少含有第一组活的生物细胞，如在全血样中或从全血样中取出的细胞。样品(150)也可以含有缓冲液，那些细胞就加在该缓冲液中。
样品(150)经通路(152)与经通路(156)的至少一种反应物(154)混合在一起。然后，如前所述，利用从功能上被指定为RBC去除部位(158)除去RBC。去除了RBC的反应混合物经通路(160)送到WBC分析器(162)，由分析器(162)得出的结果经线路(166)送到比较器(164)，提供了带有关于单核细胞(M)、淋巴细胞(L)和粒性细胞(G)的结果的一种三部分的WBC组分。
然后该混合物经通路(170)送到从功能上被指定为嗜中性细胞(N)去除部位(168)。通过移动或改变一个参数，如浊度的方式或通过磁力去除方式从该混合物中除去N细胞，这两种方式均如上所述。在这个例子中，所用的特殊的N专用抗体在题目为“Monoclonal Antibody Specific to Neutrophils”的判例中被公开，该判例的申请日为1986年12月8日，目前的美国申请号为938864。
而后，被除去或移动了N细胞的混合物就经通路(174)送到另一个WBC分析器(172)。分析器(172)的结果经线路(176)送到比较器(164)。分析器(172)的结果用来获得四部分的WBC组分，该组分还带有关于M细胞和L细胞的结果，然而目前另外还有因为所述N细胞被除去或移动，还获得关于嗜酸性细胞(E)和嗜碱性细胞(B)的结果。而后就可以用比较器(164)比较来自分析器(162)和(172)的二种分析结果，以便形成五部分的WBC组分。具体说，从G细胞的数中减去B细胞的和E细胞的数，得出被除去的N细胞的数。
现在参见图5A和图5B，说明二组点散布图结果是利用类似于分析器(148)的典型的分析方法从一个全血样品获得的，生物样品(150)是20微升全血样，该血样同140微升缓冲液混合的40微升的键合有RBC专用抗体的磁性微球体混合，形成反应物(154)。将该反应混合物搅拌15秒钟并在部位(158)中的磁场中放置10秒钟。除去RBC的混合物由分析器(162)进行分析，结果如图5A的点散布图所示，L细胞的计数为45.6(1)，M细胞的计数为5.6(2)以及G细胞的计数为48.7(3)。
然后，该混合物在部位(168)与10微升带有键合N细胞专用抗体的磁性微球体混合。将该混合物搅拌30秒钟，而后在一磁场中放置10秒钟。而后，除去了N细胞的混合物送到分析器(176)，形成图5B的点散布图，结果是L计数为81.0(1)，M计数为0.6(2)，E计数为11.0(3)以及B计数为1.8(4)。而后比较器(164)给出L计数为45.6、M计数为5.6、N计数为41.6，E计数为6.0和B计数为1.2的五部分的WBC组分。这与利用载片上样品的Wright染色、所得结果计数为L计数44.0，M计数为3.4，N计数为45.0，E计数为6.1和B计数为0.4的标准是微五部分的WBC组分相一致。
图6说明实施原申请的细胞种群分析方法和装置的再一个实施例，总的用数字(178)标记。分析器(178)包括一个生物样品(180)，该生物样品也含有至少一种第一组活的生物细胞，也可以包括一种缓冲液。
样品(180)经通路(182)与经通路(186)的反应物(184)混合。现从功能上作如下说明该混合物的第一部分经通路(188)送到功能上被指定为RBC和N去除部位(190)。如前所述的那样，将RBC细胞和N细胞除去或移位，并将该第一部分经通路(192)送往WBC分析器(194)。
由分析器(194)给出了一个结果，该结果经由线路(196)送往比较器(198)。该结果包括以上所指的含有M、L、E和B的四部分的组分。
同时，样品(180)与反应物(184)的混合物的第二部分经通路(200)送到在功能上被指定为RBC去除部位(202)。除去了RBC的混合物经通路(204)送到另一个WBC分析器(206)。分析器(206)的结果经线路(208)送到比较器(198)。分析器(206)的结果就直接包括以上所指的包括M、L和G计数的三部分的WBC组分。然后，用比较器(198)比较分析器(194)和(206)的结果，给出五部分WBC组分。
结合分析器(178)的方法和装置的一个具体的分析仪器实施例在图7中总的用参考数字(210)标出。此外，只表示出一种具体的计算机部件计算，但与分析仪(56)一样，分析仪(210)可以由许多构形实现。
仪器(210)包括一个由通路(216)连接到采样阀(214)上的吸气泵机构(212)。阀(214)可以包括一个样品探头(218)，以吸取所要研究的生物样品，例如样品(180)。稀释剂供给泵(220)由通路(222)连接到阀(214)上，以便在需要的时候为样品，例如全血样，提供稀释剂。而后，该混合物的第一部分经通路(224)和通路(226)送到第一混合器(228)。同时该混合物的第二部分经通路(224)和通路(230)送到第二混合器(232)。
混合器(228)(可比得上部位(190)基本上与混合器(232)(可比得上部位(202))相同，将首先予以说明。混合器(228)包括一个混合室(234)，混合物的第一部分就送到这个室。混合器(228)包括上述所有各种选择，如果需要还可以包括用于RBC溶胞的溶胞剂输入通路(236)。
如果采用溶胞剂，则在混合(如在238中所显示功能)后，经由猝灭剂通路(240)加入猝灭剂。同时，通过加入带有N专用抗体键合的合适的磁性或非磁性微球体的方式除去N细胞，这种微球体是由微球体源(242)经通路(244)送入室(234)内的。如果对N细胞或RBC使用磁性微球体，则要用磁铁(246)或磁场通过磁力方式除去被键合的细胞。
而且，被混合和被猝灭(如果需要的话)的混合物经通路(248)通过阀(250)和通路(252)送到WBC分析器(254)(即分析器(194))。分析器(254)与分析器(86)相同，就不再那么详细地说明了。此外，分析器(254)包括一个带有孔(258)的检测室(256)，混合物和细胞就穿过这个孔。鞘流射流系统(260)可以连接到室(256)上。细胞产生的信号由RF/DC源和检测电路(262)检测，其输出信号送到比较器(264)，如前所述。
同时，混合物的第二部分送入混合室(266)。在这第二部分中，只除去RBC(即类似部位(202))并且RBC可以用经由通路(268)送入室(266)的RBC溶胞剂来除去。将溶胞剂同样品混合，而后经猝灭剂通路(270)加入猝灭剂。可以用带有键合RBC专用抗体的磁性微球体来除去RBC，这种微球体是从微球体源(272)经通路(274)送入室(266)内的。这些微球体在(276)被混合，而后用磁铁(278)将键合RBC的微球用磁力方式除去。
而后，已除去RBC的混合物经通路(280)送到阀(250)再经通路(252)送到分析器(254)，以便获得以上所述结果。混合器(228)和(232)包括合适的相应清洗通路(282)和(284)，以及排废通路(286)和(288)，还有探头清洗机构(290)，以便在吸入下一个样品或要分析的样品之前清洗仪器(210)。
图8A和图8B给出了用类似于分析器(178)的分析方法从一个全血样得到的结果的点散布图。在这个例子中，样品(180)为20微升全血，而反应物(184)为40微升键合RBC专用抗体的磁性微球体和140微升缓冲液混合。该混合物的一部分在部位(202)内搅拌20秒钟，而后在磁场中放置10秒钟。而后，除去RBC的混合物在分析器(206)内进行分析，产生图8A的点散布图，该图给出L的计数为29.4(1)，M的计数为8.1(2)和G的计数为62.4(3)。
同时，同一混合物的另一部分在部位(190)与10微升带有键合N专用抗体的磁性微球体相混合以除去RBC和N细胞。将该混合物搅拌30秒，而后在磁场中放置10秒。除去了N和RBC的混合物又用分析器(194)进行分析，产生图8B的点散布图，该图给出L的计数为73.5(1)，M的计数为21.7(2)，E的计数为3.4(3)和B的计数为1.4(4)。这两种计数在比较器(198)内进行比较，得到五部分的WBC组分，为L的计数29.4，M的计数为8.0，N的计数60.8，E的计数为1.2和B的计数为0.60并且还作了显微镜方法比较，得到的计数为L29.4，M5.0，N65.0，E1.0而B小于1.0。
图9A和图9B为类似于图8A和图8B的五部分的WBC组分的例子的结果的点散布图。按照对应于图8A和图8B所述的同样的步骤分析20微升全血样，得出图9A的点散布图，该图给出的计数为L为35.4(1)，M为14.6(2)和G为50.0(3)。图9B的点散布图给出的计数为L为66.4(1)，M为25.0(2)，E为6.6(3)和B为2.0(4)。最后得到的五部分的WBC组分结果用如下计数表示L为35.4，M为14.6，N为45.5，E为3.5和B为1.1，而与此相比较的显微镜计数为L为36，M为11，N为49，E为3和B为1。
图10A和图10B也给出了类似于图8A、图8B和图9A、图9B的五部分的WBC组分的点散布图结果，但在这个例子中使用了溶胞剂。在这个例子中，将20微升全血样与80微升的缓冲液以及240微升的以上所述的RBC优选溶胞剂相混合。将该混合物搅拌6秒钟，而后加入猝灭剂。时间的长度非常关键，因为大于10秒尚未被猝灭的溶胞剂将开始对WBC的性质产生非常显著的影响。对除去了RBC的混合物进行分析，以得出图10A的点散布图，该图的结果用计数表示为L为25.7(1)，M为9.6(2)和G为65.0(3)。
含有第二个20微升全血液的该混合物的第二部分与120微升缓冲液和10微升带有键合N专门抗体的磁性微球体相混合，搅拌30秒钟，而后在磁场中放置10秒钟。然后，将RBC优选溶胞剂加入已除去N的混合物，而在溶胞作用被猝灭之前将该混合搅拌6秒钟，所得出的点散布图10B结果用以下计数百分比表示L为74.6(1)，M为21.6(2)，E为2.9(3)和B为0.8(4)。所得出的五部分的WBC组分结果用计数百分比表示为L为25.6，M为9.6，N为63.5，E为1.06和B为0.3。与此相比较显微镜的计数结果为L为29.4，M为5.0，N为65.0，E为1.0和B小于1。
类似于图10A和图10B的五部分WBC组分的点散布图的另一个例子用图11A和图11B表示。一个全血样曾有过二个按对应用图10A和图10B所述的相同的步骤同时分析的样品。图11A的点散布图提供的计数L为31.9(1)，M为17.6(2)和G为50.4(3)。图11B的点散布图提供的计数L为67.1(1)，M为24.1(2)，E为7.6(3)和B为1.2(4)。所得出的五部分的WBC组分的结果是L为31.9，M为11.4，N为46.0，E为3.6和B为0.7。作为比较，显微镜计数为L为36，M为11，N为49，E为3和B为1。
实施原申请的细胞种群分析方法和装置的又一个实施例总的用参考数字(292)标记在图12中。分析器(292)包括一生物样品(294)，该生物样品还包括至少第一组活的生物细胞，如果需要的话还包括一种缓冲液。
样品(294)经通路(296)与经通路(300)来的至少一种反应物(298)相混合。在分析器(292)中，在一个指定的功能的部位(302)顺序地或同时除去RBC和移动N。RBC除去功能标记为(304)，而N除去或移动功能标记为(306)以便指示这二种功能可以同时执行或顺序完成。RBC可以用如上所述的磁力方式或溶胞剂或这两种方式的组合来除去。N的去除或移动是通过将带有键合有N专用抗体的微球体加入该混合物中进行的。
一旦RBC被去除并且N被除去或移动，而后得到混合物经通路(308)送到分析器(310)。在这种情况下，N被充分地移动离开E和B的图形，结果直接得到M、L、E、B和N的五部分的WBC组分。分析器(292)的这一功能可以利用仪器(56)和(210)或者它们小的变动的仪器来完成。
用分析器(292)直接得出五部分的WBC组合的一个例子的点散布图的结果表示在图13中。在这个例子中，生物样品(294)是20微升全血样，而反应物(298)是10微升带有键合N专用抗体的非磁性微球体，该微球体掺有100微升缓冲剂并在子部位(306)中搅拌过30秒钟。而后，将10微升RBC优选溶胞剂加入到该混合物中，该混合物在加入猝灭剂之前曾在分部位(304)搅拌过6秒钟。然后，除去了RBC并移动了N的混合物由分析器(310)加以分析，得到图13这个点散布图，该图给出的直接记数L为29.6，M为13.6，N为52.2，E为3.4和B为1.06，作为比较的显微镜计数L为35，M为5，N为56，E为4并无B。在这个具体的例子中，该全血样也用Coulter电子公司的通用细胞计数仪进行了分析，结果是L为29，M为11.1和G为59.9(N，E和B)。
现在参照图14-26D，说明申请号为285856的第二个原申请的一些实施例。
参照图14，所述第二个原申请的WBC种群子种群分析方法和装置的第一个实施例总的标记为参考数字(320)。分析器(320)包括至少含有第一组活的生物细胞(未示出)的生物样品(322)，它包括具有至少一个可确定子种群的至少一种白血细胞种群，例如在全血样中或从全血样中取出的样品。如在此所采用的，WBC子种群是专用单克隆抗体能键合在其上的一个WBC种群的子种群。世界健康组织和国际免疫学会对单克隆抗体现已规定了一种命名法。单克隆抗体由分化基(CD)术语来定义，这种术语为细胞或细胞群和专用于这种CD群的单克隆抗体定义了具体的特性。仅仅作为例子而言，在以后的例子中要用到四个CD群CD4、CD8、CD2和C20。这个单克隆抗体CD命名法、特性和一些商品来说在表Ⅰ中加以说明。
表Ⅰ分化基 抗体 特性(商品来源)bCD2(g p50)aT11(Coulter) E RossetteOKT11(Ortho); 受体Leusa(BD)CD4(gp 56) T4(Coulter)OKT4a(Ortho); 助剂/诱导体Leu 3a(BD)CD8(gp 32-33) T8(Coulter)OKT8(Ortho); 细胞毒素/抑制因子TLeu 2a(BD)CD20(gp35) B1(Coulter) 除淋巴液以外的所有Leu 16(BD) B细胞除骨髓病以外的B细胞肿瘤，某些非T ALL细胞。
d gp-糖蛋白，以干道尔顿计的分子量bCoulteR-Coulter公司的Coulter免疫部(Hialeah，Florida)
BD-Becton-Dickinson免疫系统orho-Orho诊断系统(Raritan，NewJersey)生物样品(322)的细胞在进行定量和/或定性测定或分析时要卷入生物反应。样品(322)可以包括缓冲剂，所述细胞就加在该缓冲剂中。
样品(322)经通路(324)与经通路(328)来的至少一种反应物(326)相混合。在分析器(320)中，由在功能上被指定用于除去RBC和移动WBC子种群的部位(330)从该混合物中除去RBC，并且同时或顺序地改变或移动至少一个WBC子种群的至少一个特性。如在第一个原申请中所述，用部位(330)从混合物中除去RBC可以采用许多方法，例如关于部位(20)列举的。在相同的混合物部分同时或顺序将至少一个WBC子种群键合到带有专用于该子种群的单克隆抗体的WBC微球体上，以修改(改变或移动)该细胞的生成物浊度和/或体积参数。
而后，除去了RBC和移动了WBC子种群的混合物经通路(334)送到分析器(332)。分析器(332)可基本上与分析器(22)相同。通常将所研究的WBC子种群表示为所研究的WBC种群的百分比。因此，分析器(320)提供了一个WBC种群的一个选定的子种群的至少一个特征的一种快速的直接的分析。分析器(320)可以用于被移动的WBC子种群没有被其他数目更多的细胞遮蔽的情况，或当被识别的WBC子种群的大量被移动了的细胞占有很大百分比，即使被遮蔽了也能识别的情况。
参照图15，第二个原申请的WBC种群子种群分析方法和装置的第二个实施例总的用参考数字(340)标出。分析器(340)包括含有至少第一组活的生物细胞(未示出)的生物样品，该样品包括至少一个具有至少一个子种群的一个白血细胞种群，如在全血样中或从全血样中取出的那样。生物样品(342)的细胞在进行定量和/或定性测定或分析时也要卷入生物反应。生物样品(342)可以包括一种缓冲剂，所述细胞就加入该缓冲剂中。
样品(342)经通路(344)与经通路(348)而来的至少一种反应物(346)相混合。在分析器(340)中，用具有去除RBC和移动WBC子种群功能的部位(350)将RBC从混合物中除去，并同时或顺序地使至少一个WBC子种群的至少一个特征被改变和被移动。如前所述，可以有许多方法用部位(350)将RBC从混合物中除去，例如关于部位(20)所列举的方法。此外，同时或顺序地在同一混合物部分中将至少一个WBC子种群键合到微球体上以修改(改变或移动)这些细胞的生成物浊度和/或体积参数。
同时或顺序地将至少一个WBC种群或子种群从该混合物中除去。由于除去了WBC种群或子种群，结果所研究的WBC子种群就不会被该种群所遮蔽。这最好是按以下方式来完成，这就是在WBC种群被键合到带有专用于该WBC种群的单克隆抗体的磁性微球体上之后用磁力除去该WBC种群。
而后，将除去了RBC和WBC种群并移动了WBC子种群的混合物经通路(354)送到分析器(352)。分析器(352)也可以与分析器(22)基本相同。
实施第二个原申请并能完成第一和第二分析器(320)和(340)的分析方法的一个分析器装置的实施例在图16中总的用参考数字(360)标出。
在仪器(360)中，类似仪器(56)，只说明一种具体的枚举，按第一个原申请的原理，可以在几乎无穷多的细节上变化。此外，对仪器(360)的说明只是一般功能细节的，而许多具体的实施例可以按许多已知的方式结构上实现。
仪器(360)包括吸气泵机构(362)，用来将所研究的生物样品(如样品(322)或(342))抽到仪器(360)中。吸气泵(362)经通路(364)连接到与采样探头(368)相连的采样阀(366)上。溶胞剂泵(370)可以包括溶胞剂，例如部分反应物(326)或(346)，经通路(372)也连到阀(366)上。在适当的时候，与经泵(370)与吸取溶胞剂一道，阀(366)和泵(362)，可以吸取生物样品(322)或(342)。生物样品(322)或(342)最好是与溶胞剂分开加入。
而后，反应混合物或生物样品本身经排放通路(374)送入混合装置(376)。混合器(376)包括混合室(378)，样品和反应物就送入该室。分析(320)或(340)仅在操作上略有不同，今后将一起加以说明。
在操作时，如果RBC已经被来自泵(370)的溶胞剂溶胞，则在反应完成时由部位(380)经通路(382)供给猝灭剂或固定剂。于是除去RBC的反应就完成了。通过在室(378)内搅拌溶胞剂和样品可以促进反应，如在(374)功能性说明。
无论是在除去RBC之前、之后或其同时，移动WBC，并且在使用分析器(340)的情况下，也可以除去一个WBC种群或其子种群。通过加入从部位(386)经通路(388)、阀(390)和室通路(392)来的专用WBC微球体，移动该WBC子种群。利用混合机构(384)使WBC微球体与该混合物或样品混合。
合适的混合装置(376)的具体细节与混合装置(70)大体相同。通过使用混合器(376)，大大提高了这些反应的速度，而不会象提高反应温度那样出现明显地损害细胞有关性质的情况。此外，反应一般在少于几分钟的时间内完成，一般是2分钟或更短时间。这使自动化程度高的体积分析仪器(360)可以进行快速分析。
在分析器(320)中，用溶胞剂(例如来自部位(20))除去RBC的被猝灭的反应物和被修改了的WBC子种群而后就经通路(394)送到WBC分析器(396)(即分析器(322))。根据Wallace H.Coulter在美国专利2656508中所描述的和在Coulter电子公司所经销的许多商品血细胞计数器中实施的计数和尺寸测量技术，分析器(396)可以有许多具体的类型。
如前所述，一般说来分析器(396)包括一个液流检测器或检测室(398)。室(398)包括一个具有一个通孔(402)的变换器(400)。室(398)包括一个具有与其中液流接触的第一电极(406)的第一部分(404)。
该室的部分(404)和电极(406)通过孔(402)同其中具有第二电极(410)的该室的第二部分(408)连通。电极(406)和(410)通过馈线(412)和(414)与RF/DC源和检测电路(416)耦合。电路(416)将直流(或低频)电流或信号和在电极(406)和(410)之间高频信号这两部分耦合。
低频信号被用来检测由通过孔(402)的一个细胞所引起的一个信号脉冲的振幅。高频信号用来获取通过孔(402)的同一细胞的电浊度。
关于测量细胞电浊度，由Wallance H.Coylter和Walter R.Hoff在美国专利3502974和以后的一系列专利中以及自从该专利申请以来在由Coulter电子公司经销的出版物中对此作了描述。一个在此可利用的具体的电路在美国专利申请921654中被公开，它被引作参考文献。
由电路(416)从被检测的细胞产生的信号经一DC信号导线(418)和RF信号导线(420)耦合到比较器(422)(类似比较器(26))上。
分析器(396)可以包括一个将细胞按众所周知的方式聚集到检测器(398)内的鞘流。鞘流由射流系统(424)提供，鞘流通过一对通路(426)和(428)以一种已知的方式连接到检测器(398)上。样品反应混合物可以经导入管(430)送到检测器(398)，而通过排出管(432)从检测器(398)排入废水容器(434)。
每次操作后，混合器(378)都要由清洗通路(436)清理或冲洗并通过排废通路(438)排净。一旦室(378)清理完毕，另一个样品或样品部分就可以送入仪器(360)。
在分析器(340)中，工作情况与加有磁性白血细胞种群或子种群的微球体的分析器(320)相同。键合到那里的WBC子种群在混合过程中和/或混合后用磁场或磁铁(440)除去。磁场可以用电磁部件或通过相对于室(378)作机械运动的磁铁(440)产生，以磁性捕获键合的WBC子种群。除去了键合的WBC子种群的混合物而后经通路(394)以与前面所述相同的方法送到分析器(396)，以获得分析(类似分析器(320))。
然后，仪器(360)准备为下一次分析取下一个样品。探头(368)由探头清洗机构(442)清洗，各通路和室(378)也可以由方便的方法冲洗干净。接下去的样品混合物的每次分析都是以自动方式快速进行。前后二个样品混合物分析之间的时间间隔是5分钟左右或更少。
如果不利用溶胞剂，无论是在分析器(320)或(340)中，样品(322)或(342)可以经阀(366)送到混合器(376)而不带任何溶胞剂。在这种情况下，RBC可以用带有RBC专用抗体的微球体以磁力方式除去，所述微球体由RBC微球体部位(444)经通路(446)送到阀(390)，再由此经通路(392)送到室(376)。在不用溶胞剂的场合，键合RBC也是在混合后用磁铁(440)利用磁力方式除去，所用方式大致与以上所述带磁性的键合WBC的情况大致相同。
此外，在第二种情况下，为了增进反应的速度和效率，可以采用既带有RBC溶胞剂，又带有RBC磁性微球体的样品的反应混合物。搅拌这种反应混合物，猝灭溶胞，并用磁力将键合RBC除去，然后分析WBC，如前所述。
现在参照图17A和图17B，以点散布图的方式示出了用一个类似仪器(360)的典型分析器得出的两组结果。除二个WBC种群，直接分析T8子种群。T8子种群是带有与T8专用抗体键合的受体或抗原的细胞或形成体。在图中，这些标为T+8。那些不带与T8专用抗体的受体或抗原的细胞或形成体则标为T-8。在这些例子中，生物介质(342)是随同混合器(376)使用的20微升全血样。在图17A和图17B中，这20微升全血样，即介质(342)，与40微升键合RBC专用抗体的磁性微球相混合，与120微升缓冲液和10微升带有键合N和E专用抗体键合的磁性微球相混合后，与30微升缓冲液相混合，一起形成反应物(346)。一种这样的典型的N和E专用抗体在申请号为U.S.068618、题为“Monoclonal Antibody Specific To A Common Determinent Site of Neutrophils And Eosinophils、申请日为1987年6月3日的申请中被公开，该申请在此收入并作参考。
磁性微球体可以是任何合适的类型，在这个例子中用的是印地安那州的Seradyn，Inc.of Indiahapolis出售的聚苯乙烯磁性微球体，直径为0.7微米，具有重量相当于实心体10%体积的重量。反应混合物在混合器(376)内搅拌10秒钟、在磁铁(440)的磁场中放置15秒钟，然后除去了RBC、E和N的最终混合物在分析器(396)中分析。在图17A中给出了所得到的点散布图。
加入12.5微升键合T8专用抗体的非磁性微球体，与12.5微升的缓冲剂溶液相混合组成反应物(346)，用同样的程序得到图17B的点散布图。T8专用抗体是以Coulter Clone商标(注册商标)由Coulter公司的Coulter免疫部经销。非磁性微球体也可以是任意合适的类型，在这个例子中采用由俄勒同州的Interfacial Dynamics of Portland经销的表面活性剂无硫酸盐聚苯乙烯乳剂微球体，商品名称为IDC微球体，直径1.78微米，其重量相当于这样的实心体8%体积的重量。
加入T8微球体将键合的CD8细胞移到区域B，在那里它们可以单独地加以识别和计数，如同通过比较图17A和图17B所看到的那样。在图17A中，CD8细胞被其他的WBD细胞隐藏。从点散布图上除去N和E，或它们将遮蔽在图17B中的被移动了的CD8识别。图17A给出了除去了N和E的情况，而图17B则清楚地给出了键合CD8的细胞从区域A移到区域B的情况。缓冲剂溶液可以是密苏里州圣路易斯的Sigma Chemical Company经销的磷酸盐缓冲液。
图18A还示出了由分析器(352)得出的正常的点散布图或M、L和G种群的三参数计数分布图的位置分布。不除去G，则如图17B所见，经移动的WBC子种群所在的区域B会被数目相当大的G细胞遮蔽。图18B为说明在除去E和N后留下的WBC种群M，L和B的情况的点散布图。虽然B还可能部分地遮蔽我们所关心的区域，但这些WBC种群的百分数很小，不会对所需要的子种群百分数的计算发生很大影响。而且，如果需要的，可以把B的影响从子种群百分比中扣除。
现在参照图19A-D、20A-D和21A-D，说明从三个不同患者采集的相应的样品的CD2，CD4，CD8和CD20WBC子种群所进行的直接子种群分析的情况。对每一种子种群，将28微升全血样与20微升带有N和E专用抗体键合的磁性微球体(重量溶液体积比为2.5%)混合。此外，带有与各WBC子种群相对应的单克隆抗体的非磁性微球体也与该样品混合。用T4′，T8′，T11和B1包覆的微球体各自的数量分别为40微升(每一种均为1%重量溶液体积比)。每一相应的总混合物，即带有T8′的N和E微球，与磷酸盐缓冲液及1%的牛血清白蛋白组成的pH值为7.2至7.4缓冲液混合，总量为150微升。各相应混合物在室(378)内用混合器(376)搅拌2分钟，然后在磁场(440)内放置1分钟。在这些例子中，RBC顺序地用以上所提到的溶胞剂除去。首先加入WBC微球体，然后用来自溶胞剂源(370)的300微升溶胞剂(例如由Coylter Electronics公司经销的红细胞溶胞剂)除去RBC。然后，用来自源(380)的120微升猝灭剂(例如也是由Coulter Electronics公司经销的稳定剂(Stabilyse一种白细胞保存剂)猝灭该混合物，再送入分析器(396)分析。
在各个散布图中的右边的方框(1)表示我们所关心的相应的WBC子种群。图中所示的方框1，2，3等是形象化地或通过自动化方式围绕着我们所关心的WBC种群子种群加上的。
将这些结果与利用常规的液流细胞计数法相比较，并给出用本发明的方法(SHIFT)和液流细胞计数法(CYT)相对比的以下三种样品的百分数比较结果。
T4(图19A) T8(图19B) T11(图19C) B1(图19D)Shift CYT Shift CYT Shift CYT Shift CYT患者样品1 51 52 18 22 82 76 15 13T4(图20A) T8(图20B) T11(图20C) B1(图20D)Shift CYT Shift CYT Shift CYT Shift CYT患者样品2 53 54 32 29 89 83 6.5 7.5T4(图21A) T8(图21B) T11(图21C) B1(图21D)Shift CYT Shift CYT Shift CYT Shift CYT患者样品3 46 46 24 18 86 81 11 10
图22也示出了由分析器(352)得出的正常的点散布图或M、L和G细胞种群的三参数的位置分布。不除去N和E，CD4细胞种群将被遮蔽。通过用带有N和E专用单克隆抗体的微球体将N和E移到图22B中所示出的一个区域或方框1，CD4种群就可以移动并在该方框里或区域2观察。这个区域将要被N和E遮蔽，如在图22A中所见。在图22C这个例子中，28微升全血样与50微升带有N和E专用单克隆抗体键合的2.2微米的微球体和50微升带有T4专用单克隆抗体键合的微球体以及22微升烯释剂相混合。图22B是除去不带T4微球体以及用72微升稀释剂外其余相同，而图22A除不带任何微球体和使用122微升稀释剂外其余相同。
参照图23A-D，可以看到采用多种键合到我们所关心的WBC子种群的微球体直接对WBC进行分析的情况。图23A和图23B分别给出了带有每一种都用0.8微米非磁性小球移动了的T4WBC子种群和T11WBC子种群的仅有L种群的点散布图。由于所述移动不充分，在图23A和23B上不能区分该WBC子种群。图23C和23D分别给出了带有通过键合在0.8微米和2.2微米这两种微球体上的方式移动了的T4WBC子种群和T11WBC子种群的仅有L种群的点散布图。2.2微米微球体通过有Goat抗小鼠IgG抗体键合其上，被键合到0.8微米微球上，从而键合到T4或T11抗体键合的0.8微米的微球上。
在图24A-C中给出了关于与我们所感兴趣的WBC子种群键合的微球体的尺寸大小的影响。在这个例子中，28微升的全血样与10微升键合有N和E专用抗体的磁性微球体(2.5%重量/溶液体积)以及40微升键合T8专用抗体的非磁性微球体(1%重量/溶液体积)相混合。T8微球体具有二种不同的直径，以显示在点散布图上在移动中的差别。再加入缓冲溶液，形成体积为150微升的混合物，将该混合物搅拌2分钟，并在磁场中放置1分钟。然后再将除去反应产物N和E的混合物溶胞以除去RBC，而后加以分析。图24A显示了一个没有附着在微球体上的对照WBC子种群、一个与2.2微米非磁性微球体键合的T8WBC子种群和一个与3.0微米非磁性微球体键合的T8WBC子种群。宽度和高度表示所检测信号的标准偏差。图24B是说明用键合3.0微米微球体移动的T8WBC子种群的点散布图，而图24C是说用键合2.2微米移动的T8WBC子种群的点散布图。对于用不同微球体所获得的分析的T8WBC子种群百分数分别是20.9和19.3。显然，尺寸较大的微球体形成更为清晰的点散布图形，如图24B所示那样。
现在参照图25A-D，根据第二个原申请来说明对二个WBC子种群的同时的直接分析。在这个例子中，28微升全血样与10微升键合有N和E专用抗体的磁性微球体、52微升缓冲溶液和40微升键合T8专用抗体的3.0微升的非磁性微球体相混合并搅拌2分钟。然后将该混合物在磁场内放置1分钟，而后将除去反应产物N和E的混合物溶胞以除去RBC，并且加以分析。图25A显示出一个其上没有键合任何微球体的对照WBC子种群样品、一个使用与2.2微米非磁性微球体的键合T4读数和一个使用3.0微米非磁性微球体的键合T8读数。这说明在二个被移动了的WBC子种群之间的分离。图25B是只涉及与2.2微米微球体键合、被移到区域A的T4WBC子种群的散布图分析，而图25C是只涉及与3.0微米微球体键合、被移到区域B的T8WBC子种群的点散布图分析。图25D说明了一个涉及被移到相应的A区域和B区域的T4和T8二个WBC子种群的点散布图分析。
现在参照图26A-D，在利用不同参数得到的四个不同点散布图上来说明L、M和G这三个种群。虽然前边的例子是用DC对浊度(RF/DC)的关系来说明的，实际上点散布图也可以利用任意二个不同的参数来形成。图26A给出了一个利用DC对RF关系的点散布图，图26B利用了RF对浊度的关系，图26C利用了DC-RF对浊度的关系，而图26D利用了如前所述的DC对浊度的关系。此外，虽然已经用了DC对RF或RF/DC关系，但只要信号能够彼此分开，那么任何两个不同频率的信号都是足够的，因为它们的频谱位置和/或相位关系不同。浊度是一个比较好的参数，因为它本质上是一个标准化的RF信号。显然，如图26A-D所示，数据的表示可以随需要而变。DC是所要检测的细胞或形成体的体积的函数，而RF是所要检测的细胞或形成体的内部导电率和体积的函数。
现在参照图27-46，说明申请号为339156的第三个原申请的实施例。
参照图27，用于完成细胞，例如多部分组分的分类的分析方法和装置的第一个实施例总的用参考数字(500)标示。该仪器或分析器(500)包括一个含有至少第一组活的生物细胞(未示出)的生物样品(502)，这些细胞至少包括二种白血细胞种群，例如在全血样中或从全血样中取出的那样。
生物样品(502)的细胞在进行定量划定性测定或分析时卷入一种生物反应。生物样品(502)可以包括一种缓冲剂，所述细胞就加在缓冲剂中。
生物样品(502)经通路(504)与经通路(508)而来的至少一种反应物(506)相混合。在分析器(500)中，在RBC去除部位(510)从该混合物中除去RBC。如在第一个原申请中所述，从部位(510)可以用许多方法除去RBC，例如关于部位(20)所列举的那些。
除去RBC的混合物的第一部分后，经通路(514)被送到WBC分析器(512)。这样就获得了一个生物样品(512)的总的或完全的WBC种群的标准或对照物。分析器(512)可以与分析器(86)相同，或者可以是一种光检测分析器。如在申请号为025，442，申请日为1987年3月13日和申请号为129954、申请日为1987年12月4日、题为“Multi-Part Differential Analyzing Apparatus Utilizing Light scatter Techniques.”的二个美国专利申请中所描述，这些文献在这里作为参考被收入。单检测参数可以是电子的，例如RF或DC，或光的，例如中位角光散射(Scatter)或其他所需要的光参数。
该混合物的第二部分经通路(518)送到一个N去除部位(516)通过加入带有N专用抗体键合的合适的磁性微球体的方式除去N。在这个例子中，所使用的具体的N专用抗体在判例168306中被公开，该判例题为Monoclonal Antibody Specific to neutrophils，申请日为1986年12月8日，目前的美国专利申请号为938864，该文件在这里被收入作为参考。如前面所讨论过的那样，用磁铁或磁场从该混合物中除去键合的细胞。而后，除去N的剩余的混合物经通路(520)送到分析器(512)。然后将该混合物的这部分的分析结果在比较器(522)中与第一部分混合物相比较，得出在生物样品(502)中N的百分比。
该混合物的第三部分经通路(526)送到N和E去除部位(524)。通过加入合适的带有N和E专用抗体键合的磁性微球体除去N和E。一种典型的N和E专用抗体在申请号为068618、申请日为1987年6月3日，题为“Monoclonal Antibody Specific to A Common Determinant Site of Neutrophils and Eosinophils”的美国专利申请中被公开，该文件在这里被引用作为参考。分离开的N和E专用抗体，键合在相同的或分离的磁性微体上，也可以在适当的场合或研究时加以利用。于是，除去了N和E的其余的混合物的分析结果经线(528)送到比较器(522)。在比较器(522)中混合物这部分分析结果与第一和第二部分的分析结果相比较，以获取在生物样品(502)中的E和M的百分数。
该混合物的第四部分经通路(532)送到一个L和N去除部位(530)。通过加入带有L和N专用抗体的键合的合适的磁性微球体除去L和N。所述N专用抗体可以是以上所提到过的N专用抗体或其他合适的抗体。所述L专用抗体可以是一种研制出的L专用抗体或是由Coulter公司的Coulter免疫部以T11和2H4的名称出售的一些专用抗体的组合物，这种组合物将各种L专用抗体结合在一起。除去L和N的其余的混合物而后经通路(534)送到分析器(512)。而后可以将这一部分混合物的分析结果与其他混合物部分的结果相比较，以获取生物样品(502)中B和L的百分比。
这样，分析器(500)完成了一种细胞的单独分类，例如N利用线路或通道(514)和(518)，E和/或N和/或M利用了通路(514)，(518)和(526)，而一个完整的五部分WBC组成利用了全部四条通路。分析器(500)的一个最重要的特征就是这些混合物可以只利用一个单独的分析参数，例如一个电子参数或一个光参数，来进行分析。其他组合也应用，但在每一种情况仅单检测参数或特性对完成该原申请的这种分类是必要的。
图28给出了一个结合的分析器(500)的方法和装置的具体的分析仪器实施例，总的用参考数字(540)标记。仪器(540)包括一个吸气泵机构(542)，该机构被用来将所感兴趣的样品，例如(502)，吸入到仪器(540)。吸气泵(542)经通路(544)连到一个取样阀(546)上，该阀又可以连到一个取样探头(548)上。而后，生物样品(502)经通路(550)和一个多通阀(551)送入分离的通道(514)，(518)，(526)和(532)。
首先，样品部分通过通道(514)，而后被送入室(552)。该室可能是一个混合室，样品和反应物被送入该室以除去RBC。例如利用溶胞剂。通过在室(552)中加入适当的溶胞剂并最好在其中加以搅拌，使RBC在该室中溶胞，而后，当反应完成时，向室(552)中加入猝灭剂或固定剂。
在此可利用的合适的混合装置的具体情况，在申请号为025，337、申请日为1987年3月13日，题目为“Method and apparatus for rapid mixing of small volumes for enhancing biological reactions”美国专利申请中被公开，该文件在此作为参考被引用。通过利用混合器，反应速度大大提高，而对细胞的有关性能并没有明显损害，例如通过提高反应温度可能出现的那样。此外，反应通常有效地在一分钟之内完成，一般是15秒钟或更短时间。这使得自动化程度高的体积分析仪(540)可以进行快速分析。
通过溶胞作用除去了RBC的猝灭反应物混合物，然后经通路(554)送到多通阀(556)，或直接经通路(560)送到分析器(558)。根据Wallace H.Coulter在美国专利2656508中所述的计数和估计技术分析器(558)可以具有许多种实际的类型，这种技术利用了光或电子检测，如在Coulter电子公司经销的大量商品血细胞计数器中所实施的那样。
分析器(558)总的说来包括一个液流检测器或检测室(562)。室(562)包括一个带有一个通孔的变换器(564)。室(562)可以包括一个带有一个与其中的液流接触的第一电极(568)的第一部分(566)。该室的部分(566)和电极(568)可以通过检测孔与其中带有第二电极(572)的该室的第二部分(570)相通。
电极(568)和(572)经馈线与RF/DC源和检测电路(574)相连接。电路(574)与电极(568)和(572)之间的一直流或低频电流或信号之一或两者和高频信号耦合。
低频信号用检测由通过检测孔的细胞所产生的信号的振幅。高频信号可以按照与一个单独参数相同的方式来使用或与低频信号一起使用以获取通过该检测孔的同一细胞的电浊度。
Wallace H.Coulter和Walter R.Hogg在美国专利3502974以及其他若干个专利中和这个专利之后Coulter电子公司所经销的出版物中描述了有关细胞电浊度测量的情况。在这里可以采用的一个具体的电路在题为Particle Analyzer For Measuring the Resistance And Reactance of A Particle的判例中被公开，该案的申请日为1986年10月21日，美国专利申请号为921654，现在的美国专利号为4791355，该文件在此作为参考被引用。
由电路(574)根据被检测的细胞产生的信号经DC信号引线(576)和/或RF信号引线(578)耦合到比较器(580)(类似于比较器(26))。比较器(580)可以保存由第一部分(即没有减去WBC种群或种群子种群的那部分)产生的信号，以便同在这以后要叙述后面的部分所产生的结果相比较。分析器(558)可以包括一个鞘流，以便以众所周知的方法将细胞聚集在检测器(562)中。该鞘流可以由一个以公知的方法连接在检测器上的射流系统(582)提供。
分析器(558)已经利用仅作举例用的DC和RF两者的分析电路进行过说明。在获取该原申请的多部分的WBC种群或子种群特性的时候，只需利用一个单独的检测参数，电子学的或光学的。在电子检测情况下，参数可以是DC或RF，在利用光检测时，无需说明，也只需要利用一个单独的参数，例如中位角光散射。这种一维检测可以简化仪器(540)，也使其成本降低。
该样品混合物的第二部分经通路(518)通过阀(551)送到N去除部位(516)。部位(516)包括一个混合器或室(584)。该混合室(584)装有经通路(518)被送入其中的混合物的第二部分。混合器(584)包括以上所述的所有各种选择方案，例如，包括用于RBC溶胞的溶胞剂输入通路。
当利用溶胞剂时，在进行了如在(586)所述功能的混合之后，将猝灭剂经一猝灭剂通路加入。同时或顺序地通过加入合适的带有N专用抗体键合的磁性微球体除去N，该微球体是从微球体源(588)经通路(590)送入室(584)的。然后磁铁(592)或磁场被用来以磁力除去键合在该磁性微球体上的细胞。被混合并被猝灭的混合物而后经通路(520)通过阀(556)和通路(560)送到WBC分析器(558)以便进行如前所述的分析。而将被除去了N的混合物的分析结果在比较器(580)中进行比较以测定样品(502)中的N的百分数。
样品(502)的第三部分混合物经通路(550)和阀(551)，又经通路(526)送到N和E去除部位(524)。部位(524)包括一个混合室(594)。在第三部分中，借助送入室(594)中的RBC溶胞剂除去RBC。该溶胞剂同样品部分混合，而后经猝灭剂通路加入猝灭剂。利用键合有N和E专用抗体或抗体簇的磁性微球体来除去N和E，该微球体是从微球体源(596)经通路(598)送入室(594)的。将微球体加以混合，如在(600)所述功能那样，而后用磁力除去键合有N和E的微球体，如在(602)所述功能那样，除去了N和E的混合物而后经通路(528)到阀(556)，又经通路(560)送到分析器(558)，以便也获取以上所述结果。
用第一部分的二个通道(514)和(518)测定N的百分比，或用第一部分的三个通道(514)，(518)和(526)得出N和E的百分比和/或M的百分比，如所需要的那样来使用该仪器。为了获取WBC种群或子种群进一步的一些特性，样品混合物(502)的第四部分经通路(550)和阀(551)又经通路(532)送到L和M去除部位(530)。此外，与在室(604)中使用溶胞作用一样除去RBC，并且通过将L和N键合在L和N专用抗体或抗体簇键合磁性微球体上除去L和N，该微球体是从源(606)经通路(608)送入混合室(604)中。将这些微球体加以混合，这功能由(610)完成，而后用磁力除去键合L和N的微球体，这功能由(612)来完成。
除去L和N的混合物而后经通路(534)到阀(556)，再经通路(560)送到分析器(558)以获取以上所述结果。利用由其他通道所得结果的结合，于是可以得出L和/或B的百分比，例如完成一种完全的五部分的WBC组分分析以得出N、E、M、L和B的百分比。该混合器包括合适的清洗通路和排废通路，并且仪器(540)可以包括一个清洗头(614)以便在吸取下一次分析样品或样品部分之前清洗该仪器(540)，此外，如果需要的话，样品(502)可以由源(616)经通路(618)加以稀释。
这里给出的只是一个综合了分析器(500)的方法和装置的具体硬件实施例，而类似在原申请中的许多实施例，分析仪器(540)可以按许多构形来实现。例如，分析器(540)可以包括一个单独的通道，例如，通道(518)，并且这些混合物的部分每一个可以顺序地通过部位(516)，以从每一部分中除去相应的一个WBC种群或种群簇，如前边相应于那些单独的通道所描述的那样。
现在参照图29A-D和图30A-D，说明二组一维点散布图多部分特性结果，这些结果是由一个全血样得到的一利用了类似分析仪器(540)的典型的分析方法。在每一种情况下该生物样品都是28微升全血样，对于用于第一通道(514)的样品部分与122微升缓冲液相混合。该样品部分用300微升RBC优选溶胞剂溶胞，该溶胞剂是上面在通道(552)中所提到过的。该样品部分溶胞4秒钟，然后以120微升猝灭剂猝灭，而后在经通路(554)、阀(556)和通路(560)送入分析器(558)。在图29和图30中说明了利用一个一维电子检测参数所得到的分析结果。DC被用来获取图29A-29D中的数据，RF被用来获取图30A-30D中的数据(用于比较)，两者利用的是同一一样品部分，并且在分析器(558)中同时进行测量。这产生了图29A中二个可清晰地识别的数据峰(620)和(622)以及图30A中的峰(624)和(626)。峰(620)和(626)表示该样品中L和B的百分比。峰(622)和(626)表示N、E和M的百分数。显然，在一维情况下，由于不能进一步控制，在同一数据峰中一些个别的百分数被竞争细胞所掩盖。如在以上提到过的原申请中所述，这是不成问题的，至少对某些细胞来说，当它大于一个参数时，就被用来区分这些数据。
在第二个通道(518)中，28微升第二全血样部分在室(584)中与40微升键合N专用抗体的磁性微球相混合，又与82微升缓冲溶液相混合。在除去N的混合物，经通路(520)、阀(556)和通路(560)送入分析器(558)之前，该样品部分按照与在通道(514)中相同的方式搅拌60秒，进行溶胞然后猝灭，而后在磁场(592)中放置30秒。这样得出图29B中的两个数据峰(628)和(630)以及图30B中的二个数据峰(632)和(634)。峰(628)和(632)保持与峰(620)和(624)相同，尽管在样品混合物部分中它们的百分比较大，而峰(630)和(634)表示除去了N的E和M的百分比。于是就可以将数据峰(630)和(634)同相应的数据峰(622)和(626)进行比较，以确定在全血样中N的百分比。
接下去，或按任意的顺序，其中包括基本上同时地将第三个28微升样品部分送到第三个通道(526)，并在室(594)中同20微升键合有E和N专用抗体或抗体簇的磁性微球体相混合，并与102微升缓冲溶液中相混合。在除去N和E的混合物经通路(528)、阀(556)和通路(560)进入分析器(558)之前，该样品部分以与在通道(514)中相同的方式搅拌30秒，进行溶胞猝灭，而后在磁场(602)中放置30秒。这也得出图29C中的两个数据峰(636)和(638)和图30C中的二个数据峰(640)和(642)。峰(636)和(640)也与峰(620)和(624)是相同作用，而数据峰(638)和(642)表示在全血样中M的百分比，如比较数据峰(622)和(626)。而后可以将数据峰(638)和(642)同数据峰(630)和(634)相比较，也是为了求出在全血样中E的百分比。
第四个28微升样品部分分送到第四个通道(532)，同70微升键合CD2专用抗体的磁性微球体和50微升键合CD45R专用抗体的磁性微球体在室(604)中相混合。将该样品部分搅拌2分钟，而后在磁场(612)中放置30秒钟，然后将剩余的混合物经通路(646)移入保留室(644)中。移入保留室(644)目前看起来是一个必要的操作，因为所利用的专用抗体，如以上所提到的专业术语被称为T11和2H4的以及N专用抗体，看起来当同时使用时与一种其他的抗体相互干扰。人们所不了解的是这是专用抗体的原因还是细胞本身性质的原因。一旦除去了键合有T11和2H4的细胞的混合物送入保留室(644)，于是室(604)就要用磁场加以处理，以除去带有CD2和CD45R细胞簇的磁性微球体。
键合有N的磁性微球体于是就被隔离在室(604)中，该微球体可以由其他源提供，而不是由源(606)提供(未示出)。将40微升键合N专用抗体的磁性微球体保留在磁场(612)中，并将缓冲液排到废液中，通过这样的方式完成所述隔离。换句话讲，该混合物可以加以调整，以便使缓冲液被用作混合物的一部分，或可以使用磁性微球体浓缩物而是无需用溶液。而后，在除去L和N的混合物经通路(534)、阀(556)和通路(560)送入分析器(558)之前，该样品部分又由室(644)经通路(648)返回室(604)，同键合N专用抗体的磁性微球体相混合，进行溶胞而后猝灭，如在通道(514)中所述的那样，而后大在磁场(612)中放置30秒。这样就产生了图29D中的两个数据峰(650)和(652)以及图30D中的两个数据峰(654)和(656)。峰(650)和(654)只表示B，因为所有的L已被除去。因为L大约是正常全血样的30%，这就将B增强成为非常明显的数据峰(即数据量)，而B原来大约是该样品的1%。因为N也被从峰(652)和(656)中除去，而它们原来大约是样品60%，于是B进一步被增强，B现在大约是剩余的B、M和E细胞的10%。
通过用由两个峰得出的总的数据去除数据峰(在峰上计得的细胞数)的方式计算数据峰的数目，完成实际的百分比计算，如下所述(例如利用图29A-29D)1)M%-由通道(526)测定[(PK1(620))(PK1(636))]××PK2(638)＝M%
2)M+E%-由通道(518)测定[(PK1(620))(PK1(628))]××PK2(630)＝M+E%3)E%＝M+E%-M%4)N%＝(PK2(622))-M+E%5)B%-由通道(532)测定[(PK2(630))(PK2(652)××(PK1(650)＝B1%B1%××[(PK1(620)(PK1(628))]＝B%6)L%＝(PK1(620))-B%为说明在图29和图30中所示那些数据，由RF和DC数据得出的计算值列在表Ⅱ中。
表Ⅱ通道 DC RFPK1 PK2 PK1 PK2514 28.1 71.9 30.3 69.7518 74.4 25.6 74.1 25.9526 83.8 16.2 83.4 16.6532 10.9 90.1 10.0 90.0在N、L、M、E和B的百分比中表示的一个完整的五部分组分也是由DC和RF数据峰计算出的，并且为了进行检验将它与光检测仪器的分析结果作比较，例如在美国专利申请025442中所述的那样。
表Ⅲ5部分组成光 DC RFN 61.58 N 62.2 N 59.1L 28.50 L 26.9 L 29.1M 6.27 M 5.4 M 6.0M 3.10 E 4.3 E 4.6B 0.56 B 1.2 B 1.2现在参照图31A-D和图32A-D，说明第二个两组一维点散布图多部分表征特性结果，这是利用第二份全血样获得的，也利用了类似分析器装置(540)的典型的分析方法。在每一种情况下，生物样品也是28微升全血样，这样品是为每一通道制备的，如相应于图29和31所述的那样。该样品部分在送往分析器(558)之前在室(552)中的第一通道(514)里进行溶胞，然后猝灭。图31和32给出了利用一个一维电子检测参数所得分析结果。利用DC得到图31A-31D中的数据，利用RF得到图32A-32D中的数据(用于比较)，利用的是同一样品部分，是同时在分析器(558)中进行分析。这样就得出图31A中的二个清晰可识别的数据峰(658)和(660)以及图32A中的峰(662)和(664)。峰(658)和(662)表示样品中L和B的百分比。峰(660)和(664)表示N、E和M的百分比。此外，在一维情况下，如果不加以进一步的控制，那么个别的百分比就要在同一数据峰中被竞争细胞遮盖住。
在第二通道(518)中，第二份全血样品部分同键合N专用抗体的磁性微球体在室(584)中相混合、搅拌、溶胞和猝灭，而后在磁场(592)中放置，而后将除去N的混合物送到分析器(558)。这样就得出图31B中的二个数据峰(666)和(668)，以及图32B中的二个数据峰(670)和(672)。峰(666)和(670)保持与峰(658)和(662)相同，尽管在样品混合物中它们的百分比更大，而峰(668)和(672)表示除去N的E和M的百分比。数据峰(668)和(672)而后就可以同相应的数据峰(660)和(664)相比较，以确定在全血样中N的百分比。
接下去，或按任意顺序，其中包括基本上同时地将第三样品部分送到第三通道(526)并同键合E和N专用抗体或抗体簇的磁性微球体在室(594)中相混合，继而搅拌，溶胞和猝灭，而后磁场(602)中放置，最后将除去N和E的混合物送入分析器(558)。这样也得出图31C中的两个数据峰(674)和(676)以及图32C中的两个数据峰(678)和(680)。峰(674)和(678)也与峰(658)和(662)相同，而数据峰(676)和(680)表示在全血样中M的百分比，类似数据峰(660)和(664)。而后，便可将数据峰(676)和(680)与数据峰(668)和(672)比较，以便也求出在全血样中E的百分比。
第四样品部分送入第四通道(532)并与键合CD2专用抗体的磁性微球体以及键合CD45R专用抗体的磁性微球体在室(604)中相混合，继而搅拌，而后在磁场(612)中放置，最后将剩余的样品移入保留室(644)中。
而后，通过将键合N专用抗体的磁性微球体保留在磁场(612)中并除去缓冲液的方式就将键合N磁性微球体分离在室(604)中。该样品部分在室604清洗后于是又回到室(604)(由室(644)经通路(648))，并同键合N专用抗体的磁性微球体相混合，溶胞，而后猝灭，再在磁场(612)中放置，最后，除去所有L和N的混合物被送到分析器(558)。这样得出图31D中的两个数据峰(682)和(684)以及图32D中的两个数据峰(686)和(688)。峰(682)和(686)只表示B，因为所有的L已被除去以将B增强为非常明显的数据峰(即数据数量)。由于N也从峰(684)和(688)以及也从剩余样品部分中被除去，B就进一步被增强。
完成实际的百分比计算在下文中依然如前所述，利用了用由两个峰得到的总数去除该数据峰(在峰上所计出的细胞数)所计算出的数据峰计数(利用图31A-31D作例子)。
1.)M%-由通道(526)测得[(PK1(658))(PK1(674)]××PK2(676)＝M%2.)M+E%-由通道(518)测得[(PK1(658))(PK1(666)]××PK2(668)＝M+E%3.)E%＝M+E%-M%4.)N%＝(PK2(660))-M+E%5.)B%-由通道(532)测得[(PK2(668))(PK2(684))]××PK1(682)＝B1%B1%××[(PK1(658))(PK1(666))]＝B%6.)L%＝(PK1(656))
对于图31和图32中所示数据，由RF和DC数据得出的计算值列在表Ⅳ中。
表Ⅳ通道 DC RFPK1 PK2 PK1 PK2514 24.0 76.0 26.0 74.0518 63.3 36.7 62.6 37.4526 76.0 24.0 75.2 24.8532 10.6 89.4 9.7 90.3一个用N、L、M、E和B的百分数表示的完整的五部分的组分也是由DC和RF数据峰计算出的，为了检验，也与光检测仪器作了比较，例如在美国专利申请025442中所述那样。
表Ⅴ5部分组成光 DC RFN 60.37 N 62.1 N 58.5L 24.70 L 22.4 L 24.3M 8.62 M 7.6 M 8.6E 5.12 E 6.3 E 6.9B 1.18 B 1.6 B 1.7利用DC数据峰所得到的计算值列在下面
1.)M%＝ 24.0/76.0 ××24.0＝7.62.)M+E%＝ 24.0/63.3 ××36.7＝13.93.)E%＝(13.9)-(7.6)＝6.34.)N%＝(76.0)-(13.9)＝62.15.)B%＝ 36.7/89.4 ××10.6＝4.44.4×× 24.0/63.3 ＝1.66.)L%＝24.0-1.6＝22.4图29-32中的数据峰利用一个单独的电子检测参数，DC或RF，来描述。不讨论浊度，但如果需要的话，也可以使用，因为它是RF/DC，如前所述。单独的光检测参数也可以利用，例如中位角光散射(Scatter)，如图33-36所示。
参照图33，利用二个参数，即散射和电体积，M、L、N和E组细胞被清晰地方离开。在这一数据图形中B被遮蔽。然而，在一维情况下，图34中所示相同的点散布数据给出了遮蔽L的M或者相反，如在数据峰(690)中所见到的那样。在数据峰(692)中给出了N和E，在数据峰(693)中给出了E，如图33中那样表示相同的数据。
解决在数据峰(690)中数据被遮蔽的问题的一个方法就是除去M。目前这将按一种脱机的或予先准备的模式完成，因为当使用CD14专用抗体时，例如由Coulter公司Coulter免疫部经销的Mo2时，M被缓慢地除去。例如将400微升全血样同200微升2%-0.5%键合CD14专用抗体的磁性微球体的溶液相混合。通过从其中除去流体而将该微球体保留在一个磁场中的办法首先将该磁性微球体分离，而后加入样品，轻轻地搅拌混合物，例如摇动大约30分钟，而后在磁场中放置5分钟，在这之后，将予先准备好的除去M的混合物在仪器(540)中进行分析，如前所述的那样。在图35中，为了进行比较，也以二维形式给出数据，在图中可以清楚地看到的是同图33比较，M已被贫化，增进了剩下的WBC种群数据。
图36中给出了一维散射数据，也得出两个数据峰(694)和(696)。峰(694)是除去M只留下L的数据峰(690)。峰(696)与数据峰(692)相同，而峰(697)与峰(693)相同，由于从样品部分中除去了M，两个峰(696)和(697)得到增进。尽管没有特别加以说明，如在峰(694)中说明的那样，除去M的样品混合物现在可以进一步贫化，以完成L子种群分析，如将在下文中进一步要说明的那样。
尽管给出了举例用的利用四个分离通道的分析器(500)，但这仅增加了该原申请的分类方法的速度。该原申请也可以利用一个单通道实施，顺序地处理生物样品(502)的各个不同的部分。
图37给出了一个增强小的或被遮蔽的分类种群的方法和装置的分析器实施例，总的标记为参考数字(700)。这种方法和装置可以用来测定诸如B或L的子种群一类的小种群。分析器(700)包括一生物样品(702)，该样品含有至少第一组活的细胞(未示出)，例如在全血样中或从全血样中取出的那样，如果该分类属于B细胞，那么样品(702)将包括至少B细胞种群和至少一个其他的WBC种群，例L细胞。一般来说，样品(702)将至少包括所有的WBC种群，然而，如前所述，其中的各种种群或子种群可以脱机或在予先制备的步骤被消除。如果该分类是WBC种群子种群，那么样品(702)将包括至少一种具有至少一种可确定的子种群的WBC种群。
现在首先说明B细胞的分类，B细胞是总的WBC种群中的一个非常小的种群，一般数量大约小于1%。显然，除去遮蔽B细胞的那些WBC种群将增进B细胞的分类和分析，由于这样一来当其他WBC种群被除去时，B细胞就成为剩下的WBC种群中较大的和重要的部分。显然，这种增进对所有小的或被遮蔽的感兴趣的细胞种群来说是正确的。
在利用一个单独的测量量或参数来分析B细胞种群时，如利用下文中将要叙述的图38中所示的RF，在一个单峰(704)中B细胞被L细胞遮蔽。L细胞大约为全部WBC种群的30%，而B细胞甚至仍然只是大约L和B合起来的3%。因此，为了更明确地分析和对B细胞分类，L细胞要完全或基本上从样品中除去。
样品(702)经通路(706)同经通路(710)来的至少一种反应物(708)相混合。利用前面叙述过的一种方法在一个RBC去除部件(712)除去RBC。一旦RBC被除去，所得混合物的第一部分就经通路(714)送到分析器(716)。WBC分析器可以与以前所述的相同，或者是它们的有一些局部变化的机型。单独的检测参数可以是电子的，例如RF或DC，或是光的，例如散射或任意其他的所要的光参数。
该混合物的第二部分经通路(718)送到L去除部位(720)，在这里L细胞被键合在磁性微球体上，该微球体包括键合在上面的L专用抗体或抗体簇。至少带有剩余的B细胞的混合物的剩余物经通路(722)被送到WBC分析器(716)。两个被分析部分的经果经线路(726)送入比较器(724)，在那里将二个分析结果加以比较以求出在样品(702)中B细胞的百分比。B细胞按这种方法已经由该样品混合物中的大约1-3%变为在第一数据峰(704)中的大致100%，这就给出了明确的分析结果和特性。按照一种类似的方法，当CD或所选择的其他WBC种群组很少时，可以除去剩余的L细胞的全部或一部分，以增进所感兴趣的其余CD族的分析。
其次，我们说明一种或多种WBC种群子种群，例如CD2、CD4或CD8WBC种群子种群的分析或分类。样品(702)也将包括至少第一组活的生物细胞(未示出)，例如在全血样中或从全血样中取出的那样。样品(702)将包括至少一种所感兴趣的WBC种群子种群和至少一种其他的有遮蔽作用的WBC种群或种群子种群，而通常将包括所有的WBC种群。
样品(702)也被送入RBC去除部位(712)，而后将第一部分经通路(714)送入WBC分析器(716)。第二部分例如被用来测定CD2族，因此第二部分与包括键合CD2专用抗体的磁性微球体相混合，所述抗体例如Coulter电子公司Coulter免疫部经销的T11。该混合的其余部分，现已除去CD2细胞，将经通路(722)送到WBC分析器(716)。然后，将二个分析结果在比较器(724)中进行比较以给出CD2组细胞的所要求的特性。
利用所要的各个通道或在另外多道仪器上的通道或在一个按顺序操作的单通仪器上的通道在仪器(540)可以完成分析器(700)的操作。
现在参照图38A-38E，如在一维点散布图特性结果所示，利用类似于分析仪器(540)的典型的分析方法，来测定CD4，CD8和CD2子种群。在每种情况下生物样品都是28微升全血样品。将这个样品与在通道(714)中用作对照样品的122微升缓冲液混合(这可以是在仪器(540)中通道(514))。利用一维电检测参数(在此为RF)的结果而得到图38A-E的数据。这份样品部分与上述提及的RBC优选溶胞剂300微升溶胞4秒(例如在室(552)中)，再用120微升猝灭剂猝灭，然后送分析器(716)(例如分析器(558)中)，其分析结果为图38A中两个明显可识别的数据峰(704)和(728)，其中数据峰(704)包括B和L以及其所有子种群，它作为一个单峰。B的百分含量足够地小，以致它不能影响所要分析的L子种群的结果，但是，若需要B的值可以扣除。
通过把第二份28微升的全血样品与50微升上面没有键合任何L或L子种群专用抗体的磁性微球和72微升缓冲液混合作为第二对照样品。该样品按前述方法溶胞和猝灭后送到分析器(716)中，得到在图38B中的两个数据峰(730)和(732)，数据峰(730)和(732)与数据峰(704)和(728)基本相同，因此，包含微球没有对分析结果产生任何有害的影响。
将第3份28微升样品送到通道(718)(也可以是仪器(540)中通道(518)、(526)和(532)中任何一个)中，并同50微升键合CD4专用抗体的磁性微球以及72微升缓冲液混合，CD4专用抗体可以是coulter公司Coulter Immunology Division出售的T4。将该样品如前所述的那样，搅拌60秒，溶胞和猝灭后放在一个磁场中30秒，然后将除去CD4子种群的该混合物送到分析器(716)中，从而得到图38C中两个数据峰(734)和(736)，峰(734)代表不含CD4子种群的L，然后用比较器(724)与峰(704)相比较，得到在该样品中CD4子种群的百分含量。
为了检验和估价，再将相同血液样按上述方法分析，而得到数峰的四组数据，其中之一组在图38A-E中绘制。由于在每一组中这些数据峰是基本上相同的，所以用单独一组数据就可以了。在四组数据上平均这些数据就得到结果。所得到的平均CD4子种群百分含量是45.7，为了验证，把这个值同一光检测仪器，例如从Coulter Corporation可购得的EPICS e细流量细胞计数器的测量结果相比较，该计数器给出百分含量为47.6。
将第四份28微升样品送到通道(718)，与50微升上面键合有CD8专用抗体的磁性微球以及72微升缓冲液相混合，CD8专门抗体可以是Coulter Immunology Division of Coulter Corporation出售的T8，再如前述将该样品搅拌，溶胞和猝灭，并放到磁场中，除去CD8子种群的该混合物送到分析器716，得到在图38D中两个数据峰(738)和(740)，数据峰(738)代表没有CD8子种群的L，然后用比较器(724)与峰(704)比较，得到在样品中CD8子种群的百分含量，所得到的平均的CD8子种群百分含量是25.0，为了验证，把这个值与光检测仪器给出百分含量26.0相比较。
将第五份28微升样品送到通道(718)与CD2专用抗体键合的50微升磁性微球以及72微升缓冲液相混合，该CD2专用抗体可以是Coulter Immunology Division of Coulter Corporation出售的T11，该样品按前述方法经搅拌、溶胞和猝灭然后放在一磁场中，然后将除去CD2子种群的混合物送到分析器(716)，得到在图38E中两个数据峰(742)和(744)，数据峰(742)代表没有CD2子种群的L，然后把它用比较器(724)与峰(704)比较，从而得到在该样品中CD2子种群的百分含量，所得CD2子种群的平均百分含量是82.7，并将它与光检测流量细胞计数仪器给出百分含量79.0相比较。
在图39A-E和40A-E中给出了用CD4、CD8和CD2子种群的一维电检测参数其他子种群分析的结果，DC用于得到在图39A-E的数据，而RF用于得到在图40A-E中的数据，用同样品部分并同时测定。
按照关于在图38A-E所述的基本相同的方式，将该样品溶胞和猝灭后送到分析器(716)，在图39A和40A的情况，仅加入缓冲液，而在图39B和40B情况，缓冲液以及未键合L和L子种群专用抗体的磁性微球与该样品混合。无微球的对照得到图39A中数据峰(746)和(748)以及图40A的数据峰(750)和(752)。峰(746)和(750)代表在该样品中L和B。带对照微球的对照样品与该样品混合，但用磁场从中除去微球，得到在图39B中的数据峰(754)和(756)，以及在图40B中的数据峰(758)和(760)。
第三份全血样品与其上键合有CD4专用抗体的磁性微球50微升混合，该混合经搅拌、溶胞、猝灭并放在磁场中，以除去该样品混合物的CD4子种群，此后，该样品混合物送到分析器(716)。DC分析得到在图39C中两个数据峰(762)和(764)，而RF分析得到在图40C中两个数据峰(766)和(768)。与比较数据峰(750)和(766)同时比较数据峰(746)和(762)，以得到CD4子种群在该样品中的百分比。
在图39和40中，数据峰是来自同一全血样品三个分离样品组中的一组，平均这些得到这个结果。在CD4的情况，由CD得到的百分比为57.0，RF得到的百分比为57.1，而光检测流量细胞计数器仪器得到的百分比为54.6。
为了获得CD8子种群的分析，第四份全血样品部分与其上键合有CD8子种群的专用抗体的磁性微球50微升混合，把该样品部分搅拌，溶胞、猝灭，并放在一磁场中，以便从该混合物中除去CD8子种群，然后将该混合物送到分析器(716)中，DC分析得到图39D中两个数据峰(770)和(772)，而RF分析得到图40D中两个数据峰(774)和(776)。
与比较数据数(750)和(774)的同时比较(746)和(770)，以得到在该样品中CD8子种群的百分比，在CD8的情况，由DC得到的百分比为17.4，由RF得到的百分比为18.6，由光检测流动细胞计仪器得到的百分比为17.7。
为了进行CD2子种群分析，第五份全血样品与其上键合有CD2专用抗体的磁性微球50微升相混合，该样品经搅拌、溶胞、猝灭，并放在一磁场中，以除去该混合物中CD2子种群，然后将该混合物送到分析器(716)中，DC分析得到在图39E中的两个数据峰(778)和(780)，而RF分析得到在图40E中的两个数据峰(782)和(784)。
与比较数据峰(750)和(782)的同时比较数据峰(746)和(778)，以得到在该样品中CD2子种群的百分比，在CO2的情况，由DC得到的百分比为79.6，由RF得到百分比为79.3，由光检测流动细胞计数仪器得到百分比为74.7。
利用一维电检测参数，参照关于得到图37-40的方法分析B和L子种群。也可使用一光检测参数，以及两个或多个检测参数，例如在图41A-E中所述。
这些样品按在图38-40中获得数据所使用的同样方式处理。图41A和图41B分别说明没有微球的对照和与磁性微球混合并在分析前除去微球的对照的结果。这些对照说明正常三部分直方图，图示L、M、以及G种群。
在图41C中图示CD4贫化，在CD4子种群磁性贫化后，留下L种群可以与对照的L种群比较，以确定CD4子种群百分比。测得CD4子种群百分比是59.4，然后它与光检测流动细胞计数仪器测得的百分比54.6比较。
图41D图示CD8贫化，在CD8子种群磁性贫化后，留下L种群可与对照L种群比较，从确定CD8子种群百分比。所测定的CD8子种群百分比是15.8，然后，将它与光检测流动细胞计数仪器测定的百分比17.7比较。
图41E中图解说明CD2贫化，在CD2子种群磁性贫化以后，剩余的L种群可与对照L种群比较，以确定CD2子种群百分比。所测定的CD2子种群百分比是82.2，然后，将它与光检测流动细胞计数仪器测定百分比74.7比较。
由上述分析可清楚地看到这些子种群重叠的数量，因为各个L子种群和大于100。在这里用重叠以说明某些细胞、细胞种群，细胞子种群或形成体包括至少两个有关的受体或抗原。在诊断和治疗中重叠可能是一个重要的参数，并将在以后进一步讨论。
上面所提到的所有数据，为什么被称做“正常”全血样品，在这里用“正常”以说明全血样品实质上没有被例如癌或其它疾病感染。
图42和43图示了两个异常的全血样品分析结果，图42A-G中用几种不同方式分析和显示第一个样品的结果，图42A和B描述该全血样品两个不同的两维检测直方图，其中一用光检测而另一个仅以电检测，这个血样没有经过任何处理。显然，正常血样L、M和G组，例如在图41A所示，被全部遮蔽住，并正好存在一个不能识别的数据组。
在图42C和42D中示出所述异常全血样品的两个不同处理的结果。在图42C中，该样品200微升与键合N和E专用抗体的磁性微球200微升相混合，该混合经搅拌、溶胞、猝灭，并放置在一磁场中，把去除后的剩余部分送到分析器中，在其中没有N和E键合的细胞。显然，该异常细胞的实质部被除去了，因为图42C中图形比图42B中的图形变得更确定。
在第二种处理中，该样品的200微升与仅键合有N专用抗体的磁性微球200微升相混合，虽然这些细胞的一些被除去，表明这些细胞键合到N抗体上，该异常细胞的重要部分仍保留，尤其如在所述直方图顶部看到的。因此，这好象是所述异常或患病细胞的某些细胞键合到N+E抗体上。这种贫化处理类型可用于诊断和治疗特殊的疾病。
利用两维检测可将图42A-D的数据直方图扩展。利用单一检测参数也可以扩展同样的信息，例如，象在图42E-42G中描绘的单一电检测参数，这个一维检测(在此是DC)产生在图42E中所示的直方图，该被分析样品没有任何处理。该单个数据峰和直方图最右侧的数据清楚指出一个异常样品。
事实上，采用如上述图42C和42D所使用的同样处理，可以同时如产生的二维检测数据那样产生一维检测数据。如上所述，该分析仪器可包括多个检测参数或仅有单一检测参数。除去N和E键合细胞又在图42F产生一个直方图，这再次说明异常细胞的绝大部被除去了。图42G中直方图再次说明没有被除去的异常细胞的一重要数量。
在图43A-G中给出了分析第二个异常全血样品的结果，在图43A和43B中示出分析未处理的该样品结果两维直方图。显然，没有看到正常全血样品数据图形。在这个仪器上绘制的图43B的直方图可与脱机绘制的图43C直方图比较，它们没有表现出有意义的差别。一份28微升样品被脱机制备或在绘制图43C的分析结果之前预先制备。
在图43D给出了CD5子种群贫化的样品，然后分析得到的直方图。28微升全血样品与122微升键合有CD5专用抗体的磁性微球混合，例如由Coulter Immunology Division of Coulter Corporation出售的T1。该混合物经搅拌、溶胞、猝灭并放在一磁场中以除去CD5键合的细胞，把图43B或图43C与图43D比较可以看到异常细胞的重要部分明显地被除去了。用两维检测绘制图43A-D的直方图。而在图43E-G描述了同样数的一维直方图。
此外，在图43E示出未处理在线样品完成结果，图43F示出在脱机样品上的结果，以及在图43G中示出由该样品CD5子种群贫化后的结果。
正如上述讨论的那样，细胞的重叠种群可能对血液疾病的诊断以及治疗是重要的，例如，某些未发育完全的细胞表示CD4和CD8二种受体。当利用电检测参数或最小数目的光参数或简单的结合它们时，细胞子种群重叠百分比的分析结果的获得是不适用的。例如，在一些光检测仪器中，利用三检测参数，获得重叠数据，三参数是正方向和90°光散射两者以及荧光。在一个正常全血样品中重叠种群的一个例子是CD2和CD8子种群，在CLL(慢性淋巴白血液)中发现了种群异常重叠。在CLL疾病的情况，CD5和CD8种群重叠。
参见图44，用于完成细胞重叠分类的方法和装置的第一个实施例一般用(800)来标记，仪器或分析器(800)包括一生物样品(802)，该样品包含至少第一组活的生物细胞(未示出)，包括至少两个重叠白血细胞种群或子种群，例如在或从一全血样品得到的样品。
在定量和/或定性测定或分析中，生物样品(802)的细胞卷入生物反应，生物样品(802)可能包括一缓冲液，细胞加到该缓冲液中。
生物样品(802)经过通路(804)与至少一个经过通路(808)的一反应物(806)混合，在分析器(800)中在-RBC除去部位(810)从该混合物中除去RBC，如在第一原申请中所述，从部位(810)除去RBC有多种途径，例如关于部位(20)所枚举的。
除去RBC后的该混合物的第一部分经通路(814)送到WBC分析器(812)，这就获得一个用于生物样品(802)总的或全部WBC种群的标样或对照样品。分析器(812)可能是与分析器(86)相同，也可能是一光检测分析器，如在美国专利申请号025442，申请日1987.3.13和美国专利申请号129954，申请日1987.12.4，题目Multi-Part Differential Analyzing Apparatus Utilizing Light Scatter Technioues的文献中所描述的，这两个文献作为本申请的参考文献。单一的检测参数可以是电的，例RF或DC或光的，如中位角光散射(Scatter)或任何所希望的光参数。
该混合物的第二部分经通路(818)送到一“X”除去部位(816)，部位(816)除去第一重叠种群细胞“X”，通过加入键合X专用抗体的合适磁性微球来除去或贫化X细胞。如前所述，利用一磁铁或一磁场，从该混合物中磁性除去键合细胞。除去X细胞后剩余的混合物经通路(820)送到分析器(812)。除去X部分的混合物的分析结果然后在比较器(822)中与第一混合物部分的分析结果比较，从而得到在生物样品(802)中X细胞的百分比。
该混合物的第三部分经通路(826)送到第二除去部位(824)，部位(824)除去第二重叠种群细胞“Y”，通过加入合适的键合Y专用抗体的磁性微球除去Y细胞，除去Y细胞剩余的混合物经通路(828)送到分析器(812)，然后把该混合物除去“Y”后部分的分析结果与第一、第二混合物部分的分析结果在比较器(822)中比较，以检验在生物样品(802)中是否有X和Y种群的重叠。这个方法证明X和Y种群重叠，仅要实际知道X和Y种群或种群比，或若X和Y贫化的种群的总和大于100%。
在大多数情况，该混合物的第四部分经通路(832)送到除去部位(830)，部位(830)除去X和Y种群(X+Y)。通过加入合适的键合有X和Y专用抗体的磁性微球除去X和Y，除去X和Y的剩余的混合物然后经通路(834)送到分析器(812)，然后把除去“X”+“Y”的混合物部分的分析结果与其他部分的结果比较，从而得到在生物样品中X和Y种群重叠的百分比。
这样，分析器(800)利用通路或通道(814)(818)或(826)可完成细胞单重叠的分类，而利用所有四通路可完成完全的重叠分类。分析器(800)的一个最重要的特征是仅利用单一分析参数，例如一电参数或一光参数可以分析这些混合物。可以利用其他结合，但在每种情况，仅单一检测参数或特性对完成原申请的重叠分类是必须的。这样的分析也可能用多检测参数获得。
虽然结合分析器(800)的方法和装置的具体的分析仪器实施例没有举例说明，但是，一个这样的仪器可以是仪器(540)。再次，重叠方法和装置可以仅在仪器(540)的单一通道上实践，或在一单通道仪器上实践，没有举例说明。
现在，参照图45A-45D，图示了一组一维点散布重叠特性结果，这是利用类似于分析仪器(540)的一典型的分析方法以及关于仪器(800)的描述从全血样得到的。在每种情况生物样品都是28微升全血样品，在第一通道(814)与所使用的122微升缓冲液混合，该样品部分用上述提及的RBC优选溶胞剂300微升溶胞4秒，然后用120微升猝灭剂猝灭，然后送到分析器(812)中。
在图45A的直方图中示出了用一维电检测参数(这里是DC)分析这部分的数据结果，这些数据得到两个清晰可辨的数据峰(836)和(838)，如前所述，峰(836)表示在样品中L和B的百分比，而峰(838)表示N、E和M的百分比。
参照上述方法，对该样品中的X和Y细胞种群先后进行贫化处理，在这种情况，X种群是L种群的CD2子种群，而Y种群是L种群的CD20子种群。该样品的第二部分送到部位(816)，在那里，用60微升键合有CD2专用抗体的磁性微球与该样品部分混合，搅拌、溶胞、猝灭，然后放在一磁场中，以除去CD2子种群，此后留下的混合物送到分析器(812)，得到图45B中的两个数据峰(840)和(842)。峰(840)是剩余的L种群，然在比较器(822)中将它与峰(836)比较，从而得到在该样品中CD2子种群的百分比。
该样品的第三部分送到部位(824)，在那里50微升键合有CD20专用抗体的磁性微球与该样品混合，搅拌、溶胞、猝灭，然后放在一磁场中，以除去CD20子种群。除去CD20剩余的混合物然后送到分析器(812)中，得到在图45C中的两个数据峰(844)和(846)，峰(844)是剩余的L，然后把它与峰(836)比较，从而获得在该样品中CD20子种群的百分比。
如果CD2和CD20子种群的正常的有关百分比是已知的，那么这对确定这些子种群是重叠的可能是充分的。还有，如果两个子种群百分比的和大于总的100%，显然，这也指出这两个子种群重叠。在小重叠百分比情况，获得重叠子种群的百分比，以确证这些子种群重叠是重要的。为获得这一重叠百分比进一步贫化是必须的。
该样品的第四部分送到部位(830)，在其中键合有CD2专用抗体的磁性微球和键合有CD20专用抗体的磁性微球被混合，以除去CD2和CD20子种群。剩余的CD2和CD20贫化的混合物送到分析器(812)，得到图45D中的两个数据峰(848)和(850)，峰(848)仍然是剩余的L，把它与峰(836)比较，得到用CD20和CD2专用抗体除去子种群的百分比。然后，把这结果与单独的CD2和CD20的结果比较，如果有的话，获得重叠百分比。
计算确切的重叠百分比，如下Ⅰ.子种群“A”(CD2)a. (数据峰(838))/(数据峰(842)) ××[数据峰(840)]＝A′b. (数据峰(836)-A′)/(数据峰(836)) ＝子种群A(CD2)的百分比Ⅱ.子种群“B”(CD20)
a. (数据峰(838))/(数据峰(846)) ××数据峰(844)＝B′b. (数据峰(836)-B′)/(数据峰(836)) ＝子种群B(CD20)的百分比Ⅲ.子种群“A+B”(CD2+CD20)(数据峰(838))/(数据峰(850)) ××数据峰(848)＝A′+B′(数据峰(836)-(A′+B′))/(数据峰(836)) ＝子种群A+B的百分比Ⅳ.重叠部分[子种群“A”+子种群“B”]-子种群“A+B”＝重叠在表Ⅵ中示出这些结果(从两个分别配制结果取平均)表Ⅵ峰 相对百分比 峰 相对百分比对照 836 35.7 838 64.3CD2840 7.1 842 92.9CD20844 33.6 846 66.4CD2+CD20848 3.5 850 96.5
在表Ⅵ中的相对百分比是总百分比100的两个峰的百分比。计算的CD2的百分比为86.2，CD20是8.9而CD2+CD20是93.5，因此，重叠百分比是(CD2+CD20)-(CD2+CD20)＝(86.2+8.9)-93.5＝1.6。
贫化第二样品，得到在图46A-D中示出CD2和CD8子种群的百分比重叠。而且，该样品的第一部分没有贫化送到通道(814)，得到图46A所示的对照数据，这个数据得到明显可辨的数据峰(852)(854)。而且峰(852)指出在该样品中L和B的百分比。
如前所述在通道(818)中对第二样品部分进行CD2贫化处理，得到在图46B中两个数据峰(856)和(858)，剩余的L峰(856)再与对照峰(852)比较，得到在该样品中CD2子种群的百分比。
在通道(826)中，对第三样品部分进行CD8子种群贫化处理，得到在图46C中两个数据峰(860)和(862)。峰(860)与对照峰(852)比较，得到在该样品中CD8子种群的百分比。
在通道(832)中，对第四样品部分进行CD2+CD8子种群的贫化处理，得到在图46D中的两个数据峰(864)和(866)。峰(864)与对照峰(852)比较得到在该样品中CD2+CD8子种群的百分比。
这些结果在表Ⅶ中给出如下
表Ⅶ峰 相对百分比 峰 相对百分比对照 852 30.3 854 69.7CD2856 9.0 858 91.0CD8860 22.1 862 77.9CD2+CD8864 7.6 866 92.4计算CD2的百分比为77.3，CD8为34.7，CD2+CD8为81.1，因此，重叠百分比是(77.3+34.7)-81.1＝30.9。
现在参照图46-60，示出了本发明的实施例。
参见图47，一个用于完成遮蔽或部分遮蔽细胞(具体地，为举例目的，这些细胞形成所研究的一白血细胞种群的子种群)分类的方法和装置的第一实施例总的用(900)来标记。仪器或分析器(900)包括一生物样品(902)，它包含至少第一组活的生物细胞(未示出)，包括至少两个白血细胞种群，如象在或来自一全血样品，至少这些白血细胞种群之一包括一所研究的白血细胞种群的子种群，其检测特性由该白血细胞种群所遮蔽。这个检测特性通过具有专用的单克隆抗体的微球键合到该白血细胞种群的子种群被移动，但是，这种移动的检测特性将被第二个白血细胞种群遮蔽或部分遮蔽。
在定量和/或定性测定或分析中，生物样品(902)的细胞卷入生物反应，生物样品(902)也包括一缓冲液，生物细胞加入到该缓冲液中。生物样品(902)经通路(904)与至少一个经通路(908)的反应物(906)混合。在分析器(900)中，在RBC除去部位(910)从该混合物中除去RBC。
如在第一个原申请中所述，从部位(910)除去RBC有多种途径，如关于部位(20)所列举的，利用溶胞和/或微球。
除去RBC后的混合物的第一部分经通路(914)送到一白血细胞分析器(912)。从而得到一用于分析所研究的一遮蔽白血细胞子种群的生物样品(902)的白血细胞种群的标样或对照样品。该标准种群可以是白血细胞种群总量的一部分;可以是没有遮蔽所研究子种群的移动或未移动检测特性的第二白血细胞种群;可以是微球组成的人造种群，它也没有遮蔽所研究子种群的移动或未移动的检测特性或一白血细胞种群，进入其中，该子种群的检测特性将全部或部分移动。这种人造种群可由微球组成，该微球没有抗体或细胞键合其上，并形成一检测特性，它不遮蔽第一白血细胞种群或所研究的白血细胞子种群的移动的特性。分析器(912)可以是和分析器(86)相同，分析(912)利用两个电检测参数，如RF或DC。
在所检测的白血细胞种群的之一中，所研究的白血细胞种群的子种群被遮蔽。该混合物的第二部分经通路(918)送到一白血细胞种群的子种群移动部位(916)。该白血细胞种群的子种群键合到白血细胞微球上，该微球具有键合其上的专用于该子种群的单克隆抗体，以改进(改变或移动)生成物浊度和/或这些细胞的体积参数。
带有移动的白血细胞种群的子种群的混合物然后经通路(920)送到分析器(912)。通常所研究的白血细胞种群的子种群涉及所研究的该白血细胞种群的百分比，在比较器(922)中，白血细胞分析器(912)由原始的或未移动细胞混合物的那些结果被比较，从而得到该白血细胞种群的百分比。
仪器(900)可能基本上与仪器(540)相同，仅利用通路(514)和(518)，而没有磁场(592)。仪器(900)也可以是一个时序型仪器，如仪器(56)，在其中，同样的样品部分被计数，然后移动，重新计数并比较。
参见图48A，示出了一感性或理想的点散布图，它表示一个通常的至少两个细胞或形成体的组或种群(926)和(928)的检测特性的点散布图。种群(926)包括子种群，细胞(927)被种群(926)遮蔽或掩蔽种群或子种群，细胞(927)被种群或(926)遮蔽或掩蔽，并且不可能将它们区分开鉴定。具有反应试剂键合其上的微球与此混合，反应试剂是专用于或检测在种群(927)白细胞上的特殊分子的，但是，与反应剂微球键合或键合到反应剂微球上的(927)细胞检测特性由一种群(928)将从(926)种群移位并全部或部分遮蔽，形成如图48B所示的种群(927′)。为了说明和举例目的，用WBC，种群(924)是M′种群(926)是L，种群(927)和(927′)是L子种群，而种群(928)是G。作为举例，这些点散布图的结果示作离散区域，虽然区域(924)，(926)和(928)实际上是各个检测数据点的大多数。而且，用RF和浊度来描述点散布图，当然其他参数和DC或其他组合也被应用，和通常在图26A-D和图57-60所示。除了数据组(924)，(926)和(928)之外，还示出第四个人造种群(930)，例如一个没有细胞或抗体键合其上的微球种群，它也可用于本发明。
在本发明中，标准或对照种群包括检测或计数至少L种群(926)和其他组的各种组合，以确定所研究的白血细胞子种群，在这些例子中它们是L子种群，如CD4或CD8。得到标准种群，因为所研究的L子种群的检测特性被移到G种群(928)中，它全部或部分遮蔽了所研究的L子种群。通常，为了获得所研究的子种群的百分含量的正确分析，在移动前和后得到一对照种群，以标准化这个子种群的百分比。
如上所述，标准种群可以是(1)白血细胞种群(924)、(926)和(928)的总数，在这种情况，人造种群(930)通常不利用;
(2)M种群(924)，它不遮蔽所研究的子种群的移动或未移动的检测特性;
(3)人造种群(930)，它也不遮蔽所研究的子种群的移动或未移动的检测特性;或(4)G种群(928)，进入该种群的子种群的检测特性将部分或全部移动。这种标准种群提供用于本发明的方法的标准化种群。
现在参照图49A和49B，给出了利用依据仪器(900)的方法从一全血样品得到的点散布图描述结果的两个组。参照图49A描述了一未移动或对照的点散布图。在这个例子中，淋巴细胞的CD8子种群是所研究的白血细胞种群的子种群。
对照生物样品(902)是25微升全血样品与100微升缓冲液混合，反应物(906)是300微升RBC溶胞剂，如前所述，它与生物样品(902)混合并搅拌5秒钟，以120微升猝灭剂猝灭该混合物，如前所述，再次搅拌5秒钟，然后送到白血细胞分析器(912)。该分析器(912)得到第一淋巴细胞计数L1965，它包括所研究的CD8白血细胞种群的子种群。淋巴细胞包含在方框(932)中，该方框最好在(934)处开启，以消除碎屑，如从计数中除去老化的嗜中性细胞，也得第一全体白血细胞计数T1是4862，它包括在方框(932)那些细胞以及在方框(932)之外的在M和G组(936)和(938)中的细胞。
样品混合物(902)或它的第二部分与50微升键合有T8专用单克隆抗体的2.2微米微球的2%溶液搅拌15秒。如应用混和物(902)的第二部分，用上述提及的方法之一除去RBC。然后将移动的混合送到白血细胞分析器(912)，从而获得图49B所示的点散布图。CD8白血细胞种群子种群现在从在方框(932′)中淋巴细胞移动到G细胞组(938′)中。
CD8白血细胞种群子种群原来由在方框(932)中L遮蔽或部分遮蔽，而现在由细胞组(938′)中G细胞遮蔽或部分遮蔽。白血细胞分析器(912)得到L为764的第二计数L2(由965降低)，以及第二全部白血细胞计数T2为4864。
如果总的白血细胞计数是相同的，那么，仅仅通过减去就可能得到CD8计数。但是，如果不是那种情况，并且通常将不是这种情况，那么这个百分比将被标准化，例如，用两个总的白血球计数(L1)/(T1) = (X)/(T2) ,X= ((L1)(T2))/(T1) = ((965)(4864))/4862 =965.4CD8的百分比＝ ((X-764)100)/(X) ＝ ((965.4-764)100)/965.4 ＝20.86
所得到的CD8百分比可与用流动细胞计数器得到23.0%比较。如以前所述，其他对照种群也可利用。
如图50A和50B所示，用类似方法可得到CD4白血细胞种群的子种群百分比。在这个例子中，微球键合T4专用单克隆抗体，并且搅拌30秒。在图50A给出了对照点散布图。而且得到在方框(940)中L的第一淋巴细胞计数1171，并得到第一总的白血细胞计数4863，包括M和G细胞(942)和(944)。
在图50B示出移动的点散布图，它给出了第二L计数878和第二白血细胞总计数4857。总的CD4白血细胞子种群是24.9%，它可与流动细胞计数器得到计数28.6%比较。
在上述例子中，用RF和浊度得到那些点散布图，其他检测参数也可利用，例如见图57-60，但是RF参数在L和剩余的白血细胞之间给出一个好的分界。在这些例子中，所有白血细胞被计数，但在组(936)和(942)中M可以不管，因为M既不遮蔽移动或未移动的CD4，又不遮蔽移动或不移动的CD8，CD4和CD8白血细胞种群子种群是所研究。
在图51-53中示出了来自不同样品的三个附加的CD8百分比例子。在图51A中，在方框(946)中得到第一L计数1520，而在方框(946)中的L和方框(948)中剩余细胞和细胞但计数得到第一总的白血细胞计数4861。在图51B中的方框(946′)得到第二移动的L计数1030，而包括在方框(946′)和(948′)的那些细胞的第二总的白血细胞计数4856，得到CD8百分比是32.2，而流动细胞计数器给出的是CD8百分比是34.6。
在同样方法中，图52A和52B的点散布图给出第一和第二L计数1393，930，以及第一和第二白血细胞计数4864，4861。CD8百分比是33.2，它可以与流动细胞计数器的百分比31.2比较。图53A和53B的点散布图给出了第一和第二L计数1031和778，以及第一和第二白血细胞计数4862和4860。得到CD8百分比是24.5，这可以与流动细胞计数器的百分比21.7比较。
在图54-56中示出了来自不同样品的得到CD4百分比的附加的例子。在图54A中，在方框(950)中得到第一L计数1372，通过在方框(950)计数L和在方框(952)中计数剩余细胞和细胞组计数得到第一总的白血细胞计数4764。在图54B中的方框(950′)中得到第二移动的L计数670，而包括在方框(950′)和(952′)中那些细胞的第二白血细胞计数4855。得到CD4百分比是52.1，而流动细胞计数器的百分比是54.4。
在同样方法中，图55A和55B的点散布图给出了第一和第二L计数1684和956，而第一和第二白血细胞计数4863和4862，得到CD4百分比是43.2，这可与流动细胞计数器百分比45.3比较。图56A和56B的点散布图给出了第一和第二L计数1234和542，而第一和第二白血细胞计数4859和4857。得到CD4百分比是56.1，它可与流动细胞计数器的百分比56.3比较。
图57-60说明其他电检参数组合，形成点散布图。在图57A和B中，为了说明用DC和浊度点散布图。在方框(954)得到第一L计数868，用在方框(954)计数L和在方框(956)中计数剩余细胞和细胞组得到第一总的白血细胞计数4827。由图57B的方框(954′)中得到第二移动L计数664，而包括在方框(954′)和(956′)中那些细胞的第二总的白血细胞计数4813，得到CD8百分比是23.2。
用DC和RF作检测参数图示在图58A和58B的点散布图。在图58A中，第一L计数926是在方框(958)中得到，利用计数方框(958)的L和计数在方框(960)中剩余细胞和细胞组得到第一总的白血细胞计数4848。在图58B的方框(958′)中得到第二移动的L计数776，包括在方框(958′)和(960′)那些细胞的第二总的白血细胞计数4855，得到CD8百分比是16.3。
仅用单一DC检测参数图示在图59A和59B的点散布图，在图59A中第一L计数935是在方框(962)中得到，而计数在方框(962)中的L和计数在方框(964)中剩余细胞和细胞组得到第一总的白血细胞计数3918。在图59B的方框(962′)得到第二移动的L计数825，而包括在方框(962′)和(964′)中那些细胞的第二总的白血细胞计数是4029，所得到的CD8百分比是11.8。
仅用单个RF检测参数图示在图60A和60B的点散布图，在图60A中，由方框(966)得到第一L计数969，利用计数方框(966)中的L和方框(968)中剩余细胞和细胞组，得到第一总的白血细胞计数3880，在图60B的方框(966′)得到第二移动L计数779，而包括在方框(966′)的(968′)中那些细胞的第二总的白血细胞计数4069，得到CD8百分比是19.6。
图57-60的点散布图没有被最佳化，并且这些数据如所示没有清楚分离。这特别由图59A和B以及图60A和B中可以看到，因为这些图的每一个都是由同样的数据得来。这特别在图60A和B中所示，因为得到的结果是11.8，这远离在图57A和B中得到结果23.2。还有，虽然2.2微米直径的微球用作例子，其他大小也可被利用。
在上述的例子中，用作标准种群的是用总的白血细胞种群的总计数因为说总计数是恒定的标准种群也可是不干扰的白血细胞计数(924)或人造种群(930)(图48)，它不被所研究的白血细胞种群子种群影响或遮蔽，无论是移动前或移动后。因为该白血细胞种群不受影响，除了细胞碎片、漂泊的微球或其他象差外，它的第一和第二计数应是相同的。用一组也不被遮蔽的微球可形成人造种群。此外，虽然利用全血样品来描述本发明的方法和装置，也可能有些例子，在那里希望应用除去RBC和/或WBC种群的一些的样品部分。显然，RBC一直被除去，但在本发明的装置内或外可讨论。这种除去或制备可以在多种普通途径完成，例如利用溶胞试剂，密度或离心技术，如菲科尔(ficoll)、葡聚糖、“血沉棕黄层”等等。在利用本发明的自动分析器中，在分析样品中利用全血样品对速度和完整性来说将是优选的。
在上述的技术见解中，本发明的许多改进和变化是可能的。样品(12)、(42)、(150)、(180)、(294)、(322)、(342)和(902)可包括全血、含细胞的人的体液、或含有形成体，如细菌、病毒和真菌的其他流体。确定的微球量是表明单位稀释剂体积中微球的重量。虽然样品的体积在大约20微升左右，例如用于实施例中的全血样品，如果需要较小或较大的样品体积也可应用，例如对于一具体的仪器或技术小到大约2微升到任何体积样品是实际的也可被应用。虽然这些例子中一些是按时序步完成的，这些步也可同时完成。同时分析允许最小复杂仪器类型使用，因此可以理解在所附权利要求的范围内，本发明按不同于前面具体描写方式也可实践。
权利要求
1.一种至少从一个样品的一部分至少获得一个被遮蔽或被部分遮蔽种群的分析方法，该样品至少具有包括至少一个研究的种群子种群的第一细胞种群和一个第二细胞种群，其特征在于对至少包括第一细胞种群及其子种群的第一种群进行电检测和进行计数，以便获得第一计数；把研究的细胞种群子种群移出所述第一细胞种群后，并使其至少部分地转移到第二细胞种群中。对至少包括第一细胞种群及其子种群的剩余的第一种群进行检测和计数，以便得到第二计数；以及把所述第一和第二计数比较，以便获得所研究细胞种群子种群的百分含量。
2.如权利要求1的方法，其进一步的特征在于利用两个不同的电参数对所述种群进行电检测和计数。
3.如权利要求1的方法，其进一步的特征在于利用一个单一的电参量对所述种群进行电检测和计数。
4.如权利要求1的方法，其进一步的特征在于通过提供一种上面键合有对所研究细胞种群子种群上的特定分子是专用性的反应剂的微球，将该所研究细胞种群子种群转移，然后使所述微球同所述样品混合，以便使该微球键合在所研究的细胞种群子种群上，并至少移动该所研究细胞种群子种群的一个检测特性。
5.如权利要求4的方法，其进一步的特征在于提供单克隆抗体在形成所述特定分子的所研究的细胞种群的子种群上形成所述的反应物和抗原。
6.如权利要求1的方法，其进一步的特征在于提供具有至少第一白血细胞种群组成所述第一细胞种群，和第二白血细胞种群组成该第二白血球种群的全血样品。
7.如权利要求6的方法，其进一步的特征在于，通过提供上面键合有对该CD4白血细胞种群子种群是专用的单克隆抗体的微球，使所述CD4白血细胞种群子种群转移，使这些微球同所述样品混合，以键合所述CD4子种群，以便移动至少该CD4子种群的一个检测特性。
8.如权利要求6的方法，其进一步特征在于借助于上面键合有对所述CD8白血细胞种群子种群是专用的单克隆抗体的微球使CD8白血细胞种群子种群移动，并使所述微球同所述样品混合，以便使这些微球键合所述CD8子种群，从而至少使所述CD8子种群的一个检测特性移位。
9.如权利要求6的方法，其进一步的特征在于所述全血样品包括一个红血细胞种群，并将该红血细胞种群从该样品中除去而不明显地损害所述白血细胞种群的有关的性质和/或数量。
10.如权利要求6的方法，其进一步特征在于，至少对第一白血细胞种群及其子种群，以及第二白血细胞种群进行检测和计数，以便在所研究的白血细胞种群进行所述移动之前得到一个第三计数，以及至少对剩余的第一白血细胞种群及其子种群和包括所述研究的移动白血细胞子种群的第二白血细胞种群进行检测和计数，以便在所研究的白血细胞种群子种群经该转移后得到一第四计数，把该第一和第二计数至少同第三和第四计数之一进行比较，以便得到所研究的白血细胞种群子种群的百分含量。
11.如权利要求10的方法，其进一步的特征在于把所述第一和第二计数同该第三和第四计数二者比较，以便标准化这个百分含量。
12.如权利要求10的方法，其进一步的特征在于，对全部白血细胞种群及其子种群进行检测和计数，以便得到该第三和第四计数。
13.如权利要求6的方法，其进一步的特征在于，对一个标准种群进行检测和计数，以便在所研究的白血细胞种群子种群进行所述移动之前得到第三计数，在所研究的白血细胞种群子种群经所述移动之后对该标准种群进行检测和计数，以便得到第四计数，并将该第三和第四计数相比较，以便标准化该百分含量。
14.如权利要求13的方法，其进一步的特征在于，所述标准种群是一个由非干扰的微球构成的人造种群。
15.如权利要求13的方法，其进一步的特征在于所述标准种群是一个非干扰的白血细胞种群。
16.如权利要求13的方法，其进一步的特征在于所述标准种群是一个全部白血球种群的总体。
17.一种为至少从一个样品的一部分至少获得一个被遮蔽或部分被遮蔽种群的分析结果的装置，该样品至少具有包括至少一个所研究的种群子种群的第一细胞种群和一个第二细胞种群，其特征在于包括用于对至少包括第一细胞种群及其子种群的第一种群进行电检测和计数，以便得一第一计数的组件(912);用于使所研究的细胞种群子种群从该第一细胞种群中移出并至少部分地转移到第二细胞种群中的组件(916);用于对至少包括第一细胞种群及其子种群的剩余第一种群进行电检测和计数，以得到第二计数的组件(912);用于比较所述的第一和第二计数，以便获得所研究的细胞种群的子种群的百分含量的组件(922)。
18.如权利要求17的装置，其进一步的特征在于组件(912)是用于利用两个不同电参量对所述种群进行检测和计数的。
19.如权利要求17的装置，其进一步的特征在于组件(912)用于利用一个单一的电参量对所述种群进行电检测和计数的组件。
20.如权利要求17的装置，其进一步的特征在于组件(916)是用于借助于键合反应物微球移动所研究的细胞种群子种群，该反应物是专用于在所述研究的细胞种群子种群上的一特殊分子，还包括一个用于使所述微球同该样品混合、以便键合所研究的细胞种群子种群、并至少使该研究的所述细胞种群子种群的一个检测特性移位的组件。
21.如权利要求20的装置，其进一步特征在于组件(906)，用于提供一单克隆抗体，在形成所述特殊分子的所述研究的细胞种群的子种群上形成所述的反应物和抗原。
22.如权利要求17的装置，其进一步特征在于全血样品(902)，至少带有构成所述第一细胞种群的第一白血细胞种群和构成所述第二白血细胞种群的第二白血细胞种群。
23.如权利要求22的装置，其进一步的特征在于用于使CD4白血细胞种群子种群转移的组件(916)包括提供上面键合有一个专门用于CD4白血细胞种群子种群的单克隆抗体的微球的组件和用于所述微球同该样品混合，以键合到所述CD4子种群、以便至少使所述CD4子种群的一个检测特性移动的组件。
24.如权利要求22的装置，其进一步特征在于，用于使CD8白血细胞种群子种群转移的组件(916)包括提供键合有一个专门用于CD8白血细胞种群子种群的单克隆抗体微球的组件和用于使所述微球同该样品混合、以便使键合所述CD8子种群，从而至少使该CD8子种群的一个检测特性移动的组件。
25.如权利要求22的装置，其进一步特征在于，所述全血样品包括一个红血细胞种群和用于使所述红血细胞种群从该样品中去除而不明显地损害所述白血细胞种群的相关的性质和/或数量。
26.如权利要求22的装置，其进一步的特征在于用于至少对第一白血细胞种群及其子种群和第二白血细胞种群进行检测和计数，以便在所述研究的白血细胞种群子种群进行所述转移之前得到第三计数的组件，和用于至少对剩余的第一白细胞种群及其子种群和包括所述的转移过所研究的白血细胞子种群的第二白血细胞种群进行检测和计数，以便在所述研究的白血细胞种群子种群进行所述转移后得到第四计数的组件和用于使所述第一和第二计数至少同该第三和第四计数的一个比较，以便得到所研究的白血细胞种群子种群的百分含量的组件。
27.如权利要求26的装置，其进一步的特征在于组件(922)用于使所述第一和第二计数同所述第三和第四计数二者比较，以便标准化该百分含量。
28.如权利要求26的装置，其进一步的特征在于包括用于对所有的白血细胞种群及其子种群进行检测和计数，以便得到所述第三和第四计数的组件。
29.如权利要求22的装置，其进一步的特征在于，包括用于对一个标准种群检测和计数，以便在所研究的白血细胞种群子种群进行所述转移之前得到第三计数的组件，以及用于在所研究的白血球细胞种群子种群进行所述转移之后对该标准种群进行检测和计数，以便得到第四计数的组件和用于使所述第三和第四计数相比较，以便标准化该百分含量的组件。
30.如权利要求29的装置，其进一步的特征在于该标准种群是一个由非干扰的微球构成的人造的种群。
31.如权利要求19的装置，其进一步的特征在于所述标准种群是一种非干扰的白血细胞种群。
32.如权利要求29的装置，其进一步的特征在于该标准种群是所有白血球种群的总体。
全文摘要
一种用于完成筛选被遮蔽或部分被遮蔽的细胞，以便计算出一种或多种细胞种群的子种群的方法和仪器(900)。一个包括被遮蔽的所研究的子种的白血细胞种群与标准种群同时被首先计数(912)。一个没有遮蔽所研究的子种群的移位过或没有移位的检测特性的第二白血细胞种群；一个也没有遮蔽所研究的子种群移位过的或没有移位检测特性的微球形成的人造种群，或者一个将使该子种群的检测特性全部和部分地转移到其中的白血细胞种群，然后通过使带有对所研究的白血细胞种群是专用的单克隆抗体的微球健合到细胞种群(916)上的方法，使所研究的该白血细胞种群子种群的检测特性移位。
文档编号G01N15/14GK1057339SQ9110396
公开日1991年12月25日 申请日期1991年5月17日 优先权日1990年5月17日
发明者詹姆斯·咔里·赫德森, 卡洛斯·M·罗德里库茨, 汤姆斯·拉塞尔, 沃拉斯·H库尔特 申请人:科特电子公司