专利名称：一种细胞模型及其构建方法和在筛选抗神经紊乱性疾病药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程及分子药理学技术领域，具体涉及一种能够筛选以mGluR2为靶点的抗神经系统疾病药物的细胞模型及其构建方法，和该细胞模型在筛选抗神经紊乱性疾病药物中的应用。
背景技术：
现代社会随着环境污染和生活压力的日益加重，精神类疾病和神经性疾病，特别是神经退行性疾病越来越多地困扰着人类。最新公布的《世界卫生报告》指出目前，神经退行性疾病及其精神类疾病已成为人类的大敌。从全球范围来看,神经退行性疾病帕金森氏症患者就约有500万人，仅仅是在中国，患者已超过200多万人。因此针对精神类疾病以及神经退行性疾病的新药创制已经被列入国家重点发展战略。也成为全球各大药物研发公 司关注的焦点。C族GPCR成员因为其独特的生理功能成为精神类疾病以及神经退行性疾病药物研发焦点中的焦点。C族GPCR成员包括代谢型Y-氨基丁酸受体(GABABR)、代谢型谷氨酸受体(mGluRl-8)、钙敏感性受体(CaSR)以及味觉受体，该家族受体在体内参与很多重要的生理进程，过度激活或抑制都会引起癫痫、精神分裂症、亨庭顿症、帕金森症、药物依赖性、疼痛等神经紊乱性疾病的病理发生。功能上的重要性和结构上的易操控性，使得该家族成员成为重要的药物作用靶点，也成为各大药物公司研发的重点，有着潜在的极高的科研和市场价值。截止到2005年，根据IMS Health做出的相应统计，现在销售的药物中与GPCR有关的抗精神病药，销售额已达到476亿美元，并保持强劲的增长速度。mGluR2是中枢神经系统中的一个重要受体，属于C族GPCR，与mGluR3 —起被归为mGluR亚族IKGroup II mGluRs)。mGluR2是位于细胞膜上的跨膜受体，是一种重要的G蛋白偶联受体。其活化状态失调会引起下游信号通路激活紊乱，从而引起一系列精神紊乱性疾病的发生。mGluR2是一个同源二聚体，广泛分布于大脑皮层，嗅前核，伏隔核，下丘脑，海马回等部位的细胞中。每个mGluR2包括两个胞外的VFT和两个跨膜HD结构域。当谷氨酸结合到正构位点或变构剂结合到变构位点，mGluR2被激活并与G i/o相耦联，被激活后会抑制腺苷酸环化酶进而抑制cAMP产生。通常情况下，mGluR2主要定位在突触前膜，抑制神经递质的释放，影响神经元的兴奋性和突触的传递，是治疗神经系统紊乱药物的理想靶标。目前这方面的研究尚处于起步阶段，以mGluR2为祀点的药物还未被用于临床。但是大量动物实验及临床前研究证明，mGluR2敲除模型及其他药理研究方法发现mGluR2在认知、药物成瘾及精神病等生理及病理过程中发挥重要作用。临床前及临床研究表明mGluRs亚族II是治疗焦虑及精神分裂症的潜在新型药物靶点，这一发现在焦虑及精神分裂症治疗史上具有里程碑意义，有可能最终推动mGluR亚族II的激动剂或PAMs成为治疗这两种疾病的基础治疗方案。此外，mGluR2的激动剂及阳性变构剂还可以治疗其他中枢神经系统疾病，包括疼痛、成瘾、抑郁及癫痫坐寸O基于细胞信号通路的高通量药物筛选(high throughput screening, HTS)是利用细胞信号系统作为应答元件，通过高灵敏度的数据采集系统和技术手段检测作为药物靶点的受体及各种蛋白所介导的细胞内信号事件，从而观测化合物是否能作用于药物靶点，进而找到具有靶点选择性的先导化合物。而分子与细胞水平的药物筛选模型具有材料用量少、药物作用机制明确等特点，已经成为目前寻找和发现新药物的主要药物筛选方法(FONNUM F. A rapid radio chemical method for the determination of cholineacetyl transferase [ J ]. J Neurochem , 1975, 24 ( 2 ) : 407 - 409.)。将药物革巴点导入工具细胞，并构建稳定的重组高表达目标药物靶点的细胞筛选模型，是实现高通量药物筛选的关键环节。药物筛选模型是用于证明某种物质具有药理活性(生物活性、治疗作用)的实验方法，是寻找和发现新药物的重要条件之一。
目前，基于GPCR下游信号转导的高通量药物筛选方法学相对比较成熟，多家公司可提供高通量检测仪器及方案。药物筛选模型的发现和构建则成为制约和推动该领域发展的重要因素，尤其是基于受体分子机制的模型构建更是成为发现新型先导化合物的核心技术和难点。现有技术中还没有能够高通量筛选神经系统紊乱性疾病药物的细胞模型。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明建立了一种抗神经紊乱性疾病的筛选模型，它是一种能够稳定表达与神经系统疾病相关的GPCR-mGluR2，能够灵敏、特效地筛选以mGluR2为靶点的药物，包括激动剂、抑制剂和变构剂等。本发明提供的一种细胞模型，是携带并能表达mGluR2基因的哺乳动物细胞。即该细胞模型是克隆了表达编码人源mGluR2基因序列的体外培养的哺乳动物细胞。优选地，所述mGluR2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示。优选地，所述哺乳动物细胞为CHO细胞或HEK293细胞。其它哺乳动物细胞也能够实现本发明，而以CHO细胞或HEK293细胞构建效果最佳。优选地，该细胞模型的名称为中国仓鼠卵巢细胞CH0-hmGluR2(C12)，于2012年9月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: C2012100。保藏地址中国.武汉.武汉大学。本发明还提供了一种上述细胞模型的构建方法，步骤如下
(1)将mGluR2基因与表达载体连接，构建含有mGluR2基因的重组质粒；
(2)将重组质粒转染哺乳动物细胞，培养成能稳定表达mGluR2基因的细胞株，该细胞株即为所述的细胞模型。上述细胞模型的构建方法，优选地，还包括对细胞株进行综合评估的步骤(3):在细胞株中加入mGluR2激动剂或抑制剂，测定下游信号应答反应，根据应答反应结果评估该细胞株是否作为细胞模型。所述测定下游信号应答反应包括检测mGluR2与其配体结合程度、mGluR2下游G蛋白与[35S]GTP YS结合程度、环腺苷酸积累量、三磷酸肌醇积累量和细胞内钙离子流变化量中的一种或几种。其中检测mGluR2与其配体结合程度以及G蛋白与[35S]GTPyS结合程度可以采用放射性结合实验。
优选地，步骤(I)所述的表达载体为pcDNA5/FRT。优选地,步骤(2)使用的细胞为CHO细胞。例如可以使用Invitrogen商品化细胞系Flp-in CHO细胞，Flp-In细胞系经设计可快速构建稳定表达细胞系，以能够采用Flp-In表达载体表达目的蛋白。这些细胞在转录活跃区上含有一个稳定整合的重组酶识别序列(FRT)位点。Flp-In表达载体的定点整合可确保高表达量。用Flp-In表达载体和Flp重组酶载体P0G44共转染Flp-In细胞系，使得表达载体被定点整合在每个细胞的相同染色体位点上。上述细胞模型的构建方法，更优选地步骤(I)还包括对构建的重组质粒进行测序鉴定；步骤(2)所述的重组质粒转染哺乳动物细胞是将重组质粒与表达重组酶的质粒P0G44共导入哺乳动物细胞中，再利用潮霉素(Hygromycin)进行筛选，获得带有潮霉素抗性的单克隆细胞，继续培养后利用Western blot、测细胞中的cAMP或Ca2+流等方法检测能够表达mGluR2的阳性克隆，培养成能稳定表达mGluR2基因的细胞株。
本发明还提供了上述细胞模型在筛选抗神经紊乱性疾病药物中的应用。优选地，所述抗神经紊乱性疾病药物为mGluR2激动剂、mGluR2抑制剂、mGluR2正向变构剂、mGluR2反向变构剂或mGluR2沉默变构剂。本发明具有以下有益效果
本发明的细胞模型通过检测细胞信号分子所产生的应答信号直接监测mGluR2的活性，能够高通量、低成本、准确地筛选神经紊乱性疾病的药物；本发明细胞模型的制备方法简单可控，成本低廉；本发明神经紊乱性疾病药物筛选方法步骤简单，成本低廉，准确性高，可实现高通量的筛选，具有很好的稳定性和可靠性。为抗神经紊乱性疾病药物的筛选提供了新的思路，具有很好的市场前景。
图I为本发明细胞模型的工作原理图。图2为对阳性克隆的Western blot鉴定结果图，其中，CHO表示CHO空细胞，CH0-mGluR2 C10、C11、C12、C13、C14 和 C15 分别表示不同编号的 CHO- mGluR2 细胞克隆。图3为LY379268对CH0_mGluR2细胞内钙流及对细胞活力的影响实验结果。A为不同浓度LY379268对细胞内钙流的影响，纵坐标为细胞内钙释放量；B为不同浓度LY379268对细胞活力的影响，纵坐标为光度吸收值(在波长为560nm处的吸光值)，横坐标为LY379268的浓度。图4为LY341495对LY379268诱导的CH0_mGluR2细胞内钙流及对细胞活力的影响结果。A为不同浓度LY341495对LY379268诱导的细胞内钙流的影响，纵坐标为细胞内钙释放量。B为不同浓度LY341495对细胞活力的影响，纵坐标为光度吸收值(在波长为560nm处的吸光值)，横坐标为LY341495的浓度。图5为CHO空细胞以及CH0-mGluR2细胞系中LY379268、DHPG对细胞内钙流的影响。A为不同浓度LY379268对CHO空细胞(CHO Mock)和CH0_mGluR2细胞系(CHO-mGluR2-Clonel2)胞内钙流的影响，B为不同浓度药物(LY379268和DHPG)对CH0_mGluR2细胞系(CH0- mGluR2-Clonel2)胞内钙流的影响。图6为不同细胞接种数目对应答元件检测的影响，纵坐标为CH0_mGluR2细胞内钙释放量，横坐标为每孔细胞数。图7为细胞不同传代数对应答元件检测的影响，A为第7代，B为第23代，纵坐标为CH0-mGluR2细胞内钙释放量，横坐标为LY379268和L-Glutamate浓度。图8为基于该细胞模型的药物筛选方法的评估结果，纵坐标为细胞内钙释放量，横坐标为样品数。LY379268+表示加入LY379268药物处理的实验组，LY379268-表示未加药物处理的对照组。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。实施例中用到的材料和试剂如下· Flp-in CHO细胞(一种中国仓鼠卵巢细胞，以下实施例中简称CHO细胞)、表达载体pcDNA5/FRT和转染试剂Lipofectin2000为Invitrogen公司的商业化产品；F12培养基和胎牛血清购自Gibco公司；其它试剂均为进口和国产分析纯试剂；LY379268、LY341495购自Tocris、L-Glutamate (L-谷氨酸)购自 Sigma 公司。实施例I细胞模型的构建
以中国仓鼠卵巢细胞(CHO)为受体细胞，进行细胞模型的建立。将CHO细胞培养在含10%胎牛血清的F12培养基培养，置于37°C、5%C02培养箱中培养。(I)重组质粒构建
使用人源mGluR2 cDNA (SEQ ID NO: I)序列进行扩增，得到目的基因mGluR2，将扩增的mGluR2基因和pcDNA5/FRT表达载体由连接酶催化连接，转化大肠杆菌；扩增，提取质粒DNA，抽提测序以鉴定阳性克隆，鉴定正确的阳性克隆即为重组质粒，命名为pcDNA5/FRT-mGluR2。(2)重组质粒转染CHO细胞
DNA和脂质体(Lipofectin2000)混合物的配制(60mM培养皿)
A溶液
重组质粒 pcDNA5/FRT-mGluR2 O. 8 μ g 表达重组酶(f Ip)的质粒pOG447. 2 μ g
培养基 Opti MEM500 μ L
A溶液混合,室温放置5min ；
B溶液
脂质体 Lipofectamine200020 μ L
培养基 Opti MEM500 μ L
B溶液混合，室温放置5min ；
将A液与B液混合，室温放置20min，然后将混合液加入到CHO细胞中。在37°C、5% CO2的二氧化碳培养箱内培养6h后,换为含血清含抗生素培养基。(3)阳性克隆筛选
转染24h后的CHO细胞按I :10的密度传代再培养24h，以含500 μ g/mL Hygromycin(潮霉素)的F12选择性培养基进行选择性筛选培养，每3天用选择性培养基换液一次，持续2周可见阳性克隆出现。采用极端稀释法将阳性克隆挑出，接种至96孔板再用含250 μ g/mL Hygromycin的F12选择培养液扩增传代,得到稳定转染的阳性克隆细胞模型。(4)阳性克隆鉴定
步骤(3)获得的细胞模型用western blot进行鉴定，以获得克隆中mGluR2表达情况，CHO空细胞作为对照。利用mGluR2特异性抗体，我们发现挑选的10-15号克隆都有mGluR2表达(CH0- mGluR2细胞系的CIO，Cll，C12，C13，C14，C15)，而空细胞中mGluR2却没有表达(图2)。我们选择12克隆做后续实验。12号克隆命名为中国仓鼠卵巢细胞CH0_hmGluR2 (C12)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: C2012100。实施例2本发明细胞模型用于药物筛选的特异性 mGluR2为Gi/o偶联的G蛋白偶联受体，其激活后通过抑制腺苷酸环化酶(AC)进而抑制cAMP产生，因而可以通过检测cAMP的产生来检测mGluR2激活情况；另外可以在该细胞系中转染Gqi9嵌合型G蛋白，可以将mGluR2激活的信号偶联到PLC信号通路来，继而促进胞内钙离子释放，因而可以通过检测Ca2+释放确定mGluR2激活情况，本实施例中为了鉴定细胞系可以稳定表达功能性的mGluR2，均采用检测Ca2+释放的方法。为检测该细胞模型用于药物筛选的特异性，确保应答元件的响应是由mGluR2的活性变化所调控。选用Group II mGluRs的特异性激动剂LY379268，Group II mGluRs的特异性抑制剂LY341495，分别以不同的浓度处理细胞模型并通过检测应答分子的响应确定其诱导激活率，通过MTT法确定细胞的活力。(I) LY379268对细胞内Ca2+释放及细胞活力的量效关系
①将细胞接种于96孔板中过夜，待细胞完全贴壁后，换上I μΜ Fluo-4 AM (钙荧光探针)和 O. 02% pluronic acid 孵育 Ih0 然后分别加入 1(Γ10，1(Γ9，1θΛ 1(Γ7，1(Γ6，1(Γ5，KT4M的LY379268进行刺激，每组设3个重复。用FlexStation 3多功能酶标仪工作站测定各组诱导的Ca2+释放。试验结果参见图3Α，LY379268作为Group II mGluRs特异性激动剂，对mGluR2的激活效果明显。在本实验中，LY379268对细胞内Ca2+的诱导释放率与LY379268浓度呈剂量依赖关系。②将细胞接种于96孔板中过夜，待细胞完全贴壁后，换上新鲜的无血清培养液培养 24h，分别加入浓度为 1(Γ9，10' 3 X 10' 10' 3 X 10' 1θΛ 1(T5，KT4M 的 LY379268 进行刺激，每组设3个重复。处理24h后用MTT (比色法)检测细胞活力。试验结果参见图3 B，通过MTT检测可知，细胞活力随LY379268浓度增加无显著增力口(图3)。这说明LY379268对细胞内Ca2+释放的促进与细胞增殖的活力无关。(2) LY341495对LY379268诱导内钙释放的影响
①将细胞接种于96孔板中过夜，待细胞完全贴壁后，换上I μΜ Fluo-4 AM和0. 02%pluronic acid 孵育 lh。使用 l(Tn，1(T1CI，1(Γ9，1θΛ 1(Γ7，1(Γ6，1(T5，KT4M LY341495 预孵育30min，加入IO-5M的LY379268混合液进行刺激，每组设3个重复。用FlexStation 3多功能酶标仪工作站测定诱导的Ca2+释放。实验结果见图4A，LY341495作为Group II mGluRs特异性抑制剂，能够有效抑制LY379268对mGluR2的激活。在本实验中，1(Γ5Μ LY341495对浓度为1(Γ5Μ的LY379268诱导的细胞系内钙释放均能抑制，使内钙释放程度接近于本底。②将细胞接种于96孔板中过夜，待细胞完全贴壁后，换上新鲜的无血清培养液培养 24h,分别加入浓度为 1(Γ10，1(Γ9，1(Γ8，3 X 1(Γ8，10' 1(Γ6，3 X 1(Γ6，KT5M 的 LY341495 进行处理，每组设3个重复。处理24h用MTT检测细胞活力。试验结果参见图4B，由试验结果可见当LY341495浓度在10_1CI至10_5M上时，细胞活力随LY341495浓度增加无显著降低。这说明LY341495对LY379268诱导的内Ca2+释放的抑制与细胞增殖的活力无关。(3) DHPG对细胞内Ca2+释放及细胞活力的量效关系
①将细胞接种于96孔板中过夜，待细胞完全贴壁后，换上I μΜ Fluo-4 AM (钙荧光探针)和 O. 02% pluronic acid 孵育 lh。然后分别加入 10—11，ΙΟ—1。，10_9，10_8，10_7，10_6，10_5，10_4，10_3M的LY379268混合液进行刺激，每组设3个重复，以CHO空细胞作为对照。用FlexStation 3多功能酶标仪工作站测定各组诱导的Ca2+释放。 ②将细胞接种于96孔板中过夜，待细胞完全贴壁后，换上新鲜的无血清培养液继续培养 24h，分别加入浓度为 10-11，10_10，10_9，10_8，10_7，10_6，10_5，10_4，1(Γ3Μ 的 DHPG 进行刺激，每组设3个重复，以CHO空细胞作为对照。用FleXStation3多功能酶标仪工作站测定诱导的Ca2+释放。试验结果参见图5，由试验结果可见DHPG作为Group I mGluRs特异性激动剂，对CH0-mGluR2的激活无明显效果(图5B)，而Group II mGluRs特异性激动剂LY379268能够显著激活胞内Ca2+释放而对CHO空细胞没有激活作用(图5A)，这说明其他GPCR的特异性配体对该模型不会产生干扰。(4) 96孔板不同细胞接种数目对细胞内Ca2+释放的影响
无论是自动还是人工接种细胞于96孔板，每孔中的细胞数目都不会完全相同。为了检验不同细胞数目对筛选结果的影响，寻求一个最适的细胞接种密度。分别接种数目为5，000、10，000,20, 000,40, 000/孔的细胞于96孔板，每组设3个重复。待细胞完全贴壁后，分别加入ΙΟμΜ的LY379268刺激，以不含LY379268的缓冲液作为空白对照。用FlexStation 3多功能酶标仪工作站测定诱导的Ca2+释放。在本实例中发现(结果见图6)，细胞密度为5，000、10，000、20，000、40，000个/孔
时，在这个范围内，荧光钙流的信号随着细胞数目的增加而增加。综合考虑各因素，在试验中均采用40，000/孔的细胞密度。(5)细胞稳定性检测
随着细胞传代次数的增加，外源目的基因的表达可能丢失，因此，目的基因是否能在宿主细胞中稳定表达，即传代稳定性是检测细胞系优劣的重要指标。为此我们在CH0-mGluR2细胞传到第7代和第23代时进行检测。将细胞接种于96孔板中过夜，待细胞完全贴壁后，换上新鲜的无血清培养液继续培养24h，分别加入不同浓度的LY379268以及L-Glutamate进行刺激，每组设3个重复。用FleXStation3多功能酶标仪工作站测定诱导的Ca2+释放。实验结果参见图7，由实验结果可见LY379268和L-Glutamate可以明显激活mGluR2诱导的Ca2+释放。说明该细胞模型具有良好的传代稳定性。实施例3基于细胞模型的药物筛选方法的评估
建立筛选模型的目的是筛选活性物质，反映该物质所具有的生物活性，因此，对筛选模型能否准确地反映受试物的生物活性，必须进行客观地评价。评价一个筛选模型的优劣有很多指标，如模型的稳定性、灵敏性、特异性等。除此之外，为了使模型能够达到筛选的要求，还需要对筛选模型进行定量评价，主要分析该模型能否有效地反映样品的活性。评价药物筛选模型的常用的定量技术参数，主要如下
(1)信号本底比(signalto background, S/B)
信号本底比反映的是药物筛选模型获得的数据(M Signal)与本底数据(Μ BadtgMund)之间的距离。一般来讲，这种比值越大，信号与本底的距离越大，在反映样品作用方面有越大的范围，易于反映样品作用。一般情况下，信号本底比的数值应大于3，当值小于3时，就不能有效地反映样品的生物活性。信号本底比的计算公式如下
S/B M signal/M Background
(2)信噪比(siganlto noise, S/N)
信噪比是仪器分析中常用的方法评价参数，噪音通常是指在同样测定条件下，本底所产生的记录信号。通常情况下，信噪比要大于10才能认为是可以应用的方法。信噪比的计算公式如下
S/N (M SignaI M Background) /SD Background
其中SD Background 表示本底数据标准差。(3) Z ' 因子
Z '因子综合考虑了信号的变化和波动范围，它只与实验的重现性与可靠性有关而与实验的内容无关，因而在评价高通量药物筛选模型的稳定性和可靠性中得到广泛的应用，Z '因子是没有单位的统计学参数，其值在O I之间，Z'因子〈0.5表示稳定性差，实验的可靠性低，这样的模型不能用于药物筛选，Z '因子在0. 5 I时，模型稳定性高，可以充分确保建立的模型用于药物的筛选。Z '因子的计算公式如下
权利要求
1.一种细胞模型，其特征在于，该细胞模型是携带并能表达mGluR2基因的哺乳动物细胞。
2.根据权利要求I所述的细胞模型，其特征在于，所述mGluR2基因的核苷酸序列如SEQID NO: I 所示。
3.根据权利要求I所述的细胞模型，其特征在于，所述哺乳动物细胞为CHO细胞或HEK293 细胞。
4.根据权利要求I所述的细胞模型，其特征在于，名称为中国仓鼠卵巢细胞CH0-hmGluR2(C12)，于2012年9月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: C2012100。
5.权利要求Γ4任一所述的细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤如下 (1)将mGluR2基因与表达载体连接，构建含有mGluR2基因的重组质粒； (2)将重组质粒转染哺乳动物细胞，培养成能稳定表达mGluR2基因的细胞株，该细胞株即为所述的细胞模型。
6.根据权利要求5所述的细胞模型的构建方法，其特征在于，还包括对细胞株进行综合评估的步骤(3):在细胞株中加入mGluR2激动剂或抑制剂，测定下游信号应答反应，根据应答反应结果评估该细胞株是否作为细胞模型。
7.根据权利要求6所述的细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤(I)所述的表达载体为 pcDNA5/FRT。
8.根据权利要求6所述的细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤(2)中的哺乳动物细胞为CHO细胞。
9.权利要求f4任一所述的细胞模型在筛选抗神经紊乱性疾病药物中的应用。
10.根据权利要求9所述细胞模型在筛选抗神经紊乱性疾病药物中的应用，其特征在于，所述抗神经紊乱性疾病药物为mGluR2激动剂、mGluR2抑制剂、mGluR2正向变构剂、mGluR2反向变构剂或mGluR2沉默变构剂。
全文摘要
本发明公开了一种细胞模型及其构建方法和在筛选抗神经紊乱性疾病药物中的应用，属于基因工程及分子药理学技术领域。本发明的细胞模型是携带并能表达mGluR2基因的哺乳动物细胞。该细胞模型的构建方法是将mGluR2基因与表达载体连接构建成重组质粒后导入哺乳动物细胞，经过筛选培养获得能稳定表达mGluR2基因的细胞株。该细胞模型可用于筛选抗神经紊乱性疾病药物，通过将待筛选物质加入到细胞模型培养基中，测定应答元件的产量或被激活程度来判断该物质是否被筛出。本发明的细胞模型能够高通量、低成本且准确地筛选抗神经紊乱性疾病药物，筛选方法步骤简单可控，成本低廉，通量高，具有很好的稳定性和可靠性。
文档编号C12R1/91GK102888382SQ201210394298
公开日2013年1月23日 申请日期2012年10月17日 优先权日2012年10月17日
发明者张文华, 皮振钧, 胡萍, 孙兵, 孟夏, 刘剑峰 申请人:吉瑞泰(武汉)生物科技有限公司