专利名称：一种大豆WRKY类转录因子GmWRKY40及其在植物抗旱中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种大豆WRKY类转录因子GmffRKY40及其在培育植物抗旱品种中的应用。
背景技术：
WRKY类转录因子是一类含有保守的WRKY等氨基酸的锌指蛋白，WRKY基因广泛参与了植物的抗病反应和生长发育。WRKY转录因子含有一个或两个十分保守的WRKY区域，但在保守域外基因间的相似性一般很低。该结构域包含大约60位氨基酸残基，N端的七肽WRKYGQK十分保守，C端有一个C2H2或C2HC的锌指纹结构。
植物的防御系统是一个错综复杂的系统。已有研究结果表明，NPRl是由各类已知抗病信号传导途径组成的信号传导网络中的关键交叉点，参与各种类型抗病性的调控。NPRl基因启动子区含有串连的W-box元件，WRKY转录因子(如AtWKRY18等)可与NPRl基因启动子区域的W-box序列相结合，正向调节NPRl表达，从而激活下游因子，增强PR基因的表达。环境中物理、化学和生物等环境的变化对植物的生长影响很大，干旱是一种使作物减产甚至绝收的一种常见的环境因子，大豆是一种重要的油料作物，也是蛋白质的主要来源，弄清其抗旱机理，利用其抗旱基因改善作物的抗旱性能，具有重要的理论意义和现实意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种来源于大豆的与抗旱有关的WRKY类转录因子GmffRKY40及其编码基因。本发明的目的还在于提供GmWRKY40转录因子及其基因在培育植物抗旱品种中的应用。—种大豆WRKY类转录因子，其特征在于，是下述氨基酸残基序列之一的蛋白质I)序列表SEQ ID NO I所不的氣基酸残基序列；2)将序列表SEQ ID NO : I所示的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有转录激活功能的调控植物抗旱性能的蛋白质。所述序列表SEQ ID NO :1的自第135位到188位氨基酸残基序列为WRKY类转录因子的保守结构域。上述大豆WRKY类转录因子的基因，是下述核苷酸序列之一的基因I)序列表SEQ ID NO :2所不的核昔酸序列；2)编码序列表中SEQ ID NO :I蛋白序列的多核苷酸。序列表中的SEQ ID NO 2由849个碱基组成；编码序列表中SEQ ID NO :1所示的蛋白序列；自5’端第135位到188位为WRKY结构的编码序列。
含有上述大豆WRKY类转录因子基因的植物表达载体。含有上述大豆WRKY类转录因子基因的宿主菌。扩增任一 GmWRKY40基因片段的引物。上述大豆WRKY类转录因子基因在培育抗旱性提高的植物中的应用。所述植物为拟南芥或烟草。利用植物表达载体，农杆菌介导的方法将GmWRKY40基因导入植物，可获得对干旱抵抗能力增强的转基因植株。本发明的有益效果本发明的GmWRKY40基因对培育抗旱品种的转基因农作物，提高农作物的抗逆性具有重要意义。·
图I大豆GmWRKY40与其他WRKY蛋白的进化树分析；图中，GaffRKYl. pro代表亚洲棉WRKYl蛋白；GhffRKYl. pro 代表陆地棉 WRKYl 蛋白；MtffRKY. pro 代表苜蓿 WRKY 蛋白；GmWRKY78. pro 代表大豆 WRKY78 蛋白；AtffRKY8. pro, AtffRKY60. pro, AtffRKY40. pro 代表拟南芥的WRKY8，WRK60，WRKY40 蛋白；BrffRKYl. pro 代表芜菁 WRKYl 蛋白；NtffRKY. pro, WIZZ. pro 代表烟草的 WRKY 蛋白；PcffRKY4. pro 代表欧芹的 WRKY4 蛋白；VaffRKY4. pro代表夏葡萄的WRKY蛋白；CaffRKY. pro代表甜椒的WRKY蛋白；LtffRKY21. pro代表石炭酸灌木的WRKY21蛋白；BnffRKY. pro代表油菜的WRKY蛋白；0sffRKY71. pro 代表水稻的 WRKY71 蛋白。图2干旱条件下转GmWRKY40基因拟南芥及未转基因的拟南芥(CK)的抗性；图中，A :旱处理后植株生长情况B :旱处理后植株的存活率。图3干旱条件下转GmWRKY40基因烟草及未转基因的烟草(CK)的抗性；图中，A :旱处理后植株生长情况B :旱处理后植株的存活率。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例并不限定本发明，实施例中未详细说明的操作步骤请参照《分子克隆实验指南》第三版相应部分(J.萨姆布鲁克E.F.弗里奇等，科学出版社)或参阅所用试剂盒的说明书。实施例I大豆GmWRKY40基因的克隆(I)大豆cDNA文库的构建与扩增按照GibcoBRL 公司的 SuperScriptTM Plasmid System for cDNA Synthesisand Plasmid Cloning Kit说明书进行。取5mg大豆根mRNA构建cDNA文库，库容量为
5.2 X IO6Cfu,文库载体为 pPC86 (Trp+)。(2)大豆cDNA文库的筛选和序列分析根据拟南芥NPRl基因启动子区序列设计合成W-box序列(W-box(+) :5' -CTAGAGTTGACTTGACTTGGTTGACTTGACTTGGTTGACTTGACTTG-3'和 W_box(-)5 ' -GATCCAAGTCAAGTCAACCAAGTCAAGTCAACCAAGTCAAGTCAACT-3 ')，然后将两条链退火、T4PNK磷酸化后连接到pRS315His (Leu+)载体上(经Xba I和BamH I酶切)，获得诱馆载体pRSWbox质粒。制备yWAM2感受态细胞，把pRSWbox质粒转化到酵母菌株yWAM2 (Leu_，His_，Trp_) 中，获得含有pRSWbox的酵母菌株yWbox(His TrpO。用含有诱馆载体的yWbox酵母对文库进行筛选，将转化细胞涂到His—选择培养基上，28°C培养3 5天。待酵母长出后，提酵母质粒，转化E. Coli DH5ci，提取质粒，酶切分析，测序可获得所筛克隆的DNA序列，对序列进行分析。获得的DNA序列经比对是GmWRKY40，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 2所示，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO: I所示。氨基酸序列分析发现，GmWRKY40具有保守的WRKY结构域和核定位信号，表明GmWRKY40属于WRKY类转录因子。氨基酸序列分析还发现，与GmWRKY40序列一致性最高的是来源于Medicago truncatula的序列MtWRKY (ABE94581),相似性为51. 0%。从进化树分析来看(图I)，Gm WRKY40和MtWRKY分在了一个分支，表明二者在进化上有较近的亲缘关系。实施例2GmWRKY40的结合特异性对W-box (+)的核心序列(5丨-TTGACTTGAC-3丨)进行突变，突变后的序列为5' -TcagCTcagC-3'，命名为 m W_box ;将 W_box 和 m W_box 构建到 pRS315His 载体上，获得 pRSWbox 和 pRSmWbox 质粒。分别用pRSmWbox 和 pRSWbox 质粒转化酵母 yWAM2 (LeiT, His、TrpO，得到 ymWbox酵母(His , Trp )和 yWbox 酵母(His , Trp ),把 GmWRKY40 分别转化 yWbox 和 ymWbox 酵母，涂布在His-选择培养基上，结果表明GmWRKY40转化到yWbox酵母中，其在Hi s_选择培养基上能生长，而转化到ymWbox酵母中，其在His—选择培养基上不能生长,说明构建在pPC86载体上的GmWRKY40基因在酵母细胞体内的表达产物能够与W-box特异性的结合，激活了报告基因His+的表达，故能够在His—选择培养基上生长，而把W-box突变为mW-box时，GmWRKY40的表达产物在酵母细胞体内不能与mW-box特异性的结合，没有激活报告基因His+的表达，故不能在His_选择培养基上生长。因此，筛选得到的GmWRKY40在酵母体内具有W_box顺式元件结合特异性。实施例3GmWRKY40基因的拟南芥转化及烟草转化(I)载体构建及农杆菌转化把GmWRKY40用Sal I酶切，Klenow酶补平，再用Sac I酶切，回收目的片段；载体PPZP212-R用Xba I酶切，Klenow酶补平，再用Sac I酶切，回收目的片段；连接，转化E. coli. JM109，提质粒，酶切鉴定，挑出所需克隆，测序，得到pPZP212-40。制备农杆菌LBA4404 感受态，方法参照 MicroPulser ELectroporationApparatus Operating Instructions and AppLications Guide (BI0-RAD 公司)，取 20 μ LLBA4404感受态细胞，加I μ L DNA (O. 5 μ g)，转入电击杯电击转化(I. 8KV)。加入ImL YEB液体培养基恢复培养3小时(28°C，200rpm)。分别取20 μ L、200 μ L涂YEB平板(Kan 50mg/L, Rif 50mg/L)。挑取两个克隆，用碱法提农杆菌质粒，PCR检测。(2)拟南芥转化拟南芥种子在4°C进行2-3天的春化处理，每盆播种6 8粒种子(营养土和蛭石按2 I);放于温室中培养(22°C，光照16h);待拟南芥抽出初生苔后，剪去初生苔，待其抽出更多的次生苔，且少数开始结荚时，可用于转化。挑农杆菌单菌落接种在3mLYEB (Kan 50mg/L, Rif 50mg/L) ,28°C, 250rpm 培养 30小时；按 I : 400 转接入 200mL 新鲜的 YEB (Kan 50mg/L, Rif 50mg/L)中，28 °C，250rpm培养约14小时，测OD600 I. 5 ;7500rpm，4°C，IOmin离心收集菌体；重悬菌体于二倍体积(400mL)的渗透液(10%蔗糖，SILffET O. 02% )。
把拟南芥的花蕾浸入渗透液中，I分钟；转化完毕后，花盆外套上塑料袋，水平放置，使其在低光强度下生长24 48小时后，即可正常培养。将收获的种子放入I. 5mL离心管，加ImL 75%的乙醇(含O. 05% Tween 20)，于摇床上摇10分钟(300rpm)，离心，去上清；加ImL 95 %的乙醇洗一次，离心，去上清；重复一次；在超净台中加O. 3mL的无水乙醇，移到无菌滤纸上，吹干；把吹干的种子撒到1/2MS平板(Kan 50mg/L)上；4°C春化2天后，22。。，16h光照培养；将阳性植株(T1代)移栽到盆中培养，并收集种子进行T2代筛选。(3)烟草转化将上述含有质粒pPZP212-40的农杆菌菌株，采用叶盘法转化烟草NC89，在含有150mg/L卡那霉素的培养基上筛选，得到具有抗性的转基因烟草植株。待植株生根后，移栽至盆中培养，收集种子。实施例4转GmWRKY40基因拟南芥的生理分析抗旱实验把转基因植株与未转基因植株置于拟南芥正常的生长条件下不给水，连续培养15 20天；然后给水培养。抗旱实验中，连续15天不给水，对照植株叶片开始脱水变黄、17天叶片出现干枯；转基因植株的叶片绝大部分仍表现正常，株系I和株系2全部存活，株系3和株系4存活率分别为81. 3%和85. 4% (图2)。可见转基因拟南芥植株的抗旱性得到了提高。实施例5转GmWRKY40基因烟草的生理分析抗旱实验把转基因植株与未转基因植株置于烟草正常的生长条件下停止给水，直至大部分野生型植株失水死亡时复水，复水3天后统计存活率。抗旱实验中，连续24天不给水，大部分野生型植株失水死亡，进行复水，3天后统计存活率。其中野生型对照有15. 6%的植株存活；转基因株系3，4全部存活，株系I和株系2存活率分别为86. 7%和80% (图3)。可见转基因烟草植株的抗旱性得到了提高。
权利要求
1.一种大豆WRKY类转录因子，其特征在于，是下述氨基酸残基序列之一的蛋白质 1)序列表SEQID NO 1所不的氣基酸残基序列； 2)将序列表SEQID NO: I所示的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有转录激活功能的调控植物抗旱性能的蛋白质。
2.根据权利要求I所述的大豆WRKY类转录因子，其特征在于，所述序列表SEQID NOI的自第135位到188位氨基酸残基序列为WRKY类转录因子的保守结构域。
3.编码权利要求I或2所述的大豆WRKY类转录因子的基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，是下述核苷酸序列之一的基因 1)序列表SEQID NO 2所不的核昔酸序列； 2)编码序列表中SEQID NO :I蛋白序列的多核苷酸。
5.含有权利要求3或4所述大豆WRKY类转录因子基因的植物表达载体。
6.含有权利要求3或4所述大豆WRKY类转录因子基因的宿主菌。
7.权利要求3或4所述的大豆WRKY类转录因子基因在培育抗旱性提高的植物中的应用。
8.根据权利要求8所述的大豆WRKY类转录因子基因在培育抗旱性提高的植物中的应用，其特征在于，所述植物为拟南芥或烟草。
全文摘要
本发明公开了属于植物基因工程技术领域的一种大豆WRKY类转录因子GmWRKY40及其在培育植物抗旱品种中的应用。大豆WRKY类转录因子，具有序列表SEQ ID NO1所示的氨基酸残基序列，或者序列表SEQ ID NO1所示的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有转录激活功能的调控植物抗旱性能的蛋白质。本发明的GmWRKY40基因对培育抗旱品种的转基因农作物，提高农作物的抗逆性具有重要意义。
文档编号C12N15/29GK102911263SQ20121039318
公开日2013年2月6日 申请日期2012年10月17日 优先权日2012年10月17日
发明者王磊, 张兰, 范云六 申请人:中国农业科学院生物技术研究所