利用转录因子转染牛体细胞成为诱导性多能干细胞的方法

专利名称：：利用转录因子转染牛体细胞成为诱导性多能干细胞的方法
技术领域：
：本发明属于基因工程
技术领域：
，具体涉及一种利用转录因子转染牛体细胞成为诱导性多能干细胞的方法。
背景技术：
：2006年，日本学者Yamanaka[1]首次报道，利用小鼠转录因子0ct4，Sox2,c-Myc,Klf4组合共同转染小鼠体细胞，获得了小鼠的诱导性多能干细胞(inductedpluripotentstemcells,iPSCs)。随后，世界范围内掀起了诱导多潜能干细胞的研究热潮。从动物品种、转录因子种类和数量、转录因子组合方式以及外源基因导入方法等等很多方面都作了研究。2007年Yamanaka[2]又利用同样的转录因子成功得到人类的iPS细胞；同年，Yu(俞君英)与Thomson等人利用用另外四种转录因子(0ct3/4，Sox2，Nanog，Lin28)也成功得到人类iPS细胞。随后有恒河猴[4]、大鼠[5]、猪[6]等动物iPS细胞成功的报道(Lietal.，2009；Liaoetal.，2009；Liuetal.，2008)。由于iPSCs与胚胎干细胞(ESCs)具有非常相似的生物学特性，所以在现有的iPSCs的建立过程中都借鉴了ES细胞的培养条件，例如应用ESCs的培养液，应用小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)作为饲养层来提供多种生长因子以维持iPSCs的多能性。但是，在家畜，例如猪、牛、羊等动物还没有公认的建系的胚胎干细胞[7]，从早期胚胎中分离这些胚胎干细胞非常困难，而且培养体系没有完全确定。现有的胚胎干细胞培养条件，都是必须采用小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)作为培养层，才能维持ESCs处于未分化状态。在ESCs培养体系中应用小鼠胚胎成纤维细胞，直接引入了异种动物细胞，这就直接影响了ESCs细胞的临床应用，也增加了培养过程中的工作量与难度。自从1981年小鼠胚胎干细胞[8]与1998年人类胚胎干细胞[9]建系以来，至今已经过去了二十多年，可是家畜胚胎干细胞至今难以建系，则说明家畜要从早期胚胎材料分离获得胚胎干细胞还存在着许多技术与理论上的制约因素。因此，利用转录因子转染体细胞获得牛iPS细胞具有重要的意义。参考文献[1]Takahashi,K.,andYamanaka,S.(2006).Inductionofpluripotentstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors.Cell126,663-676.[2]Takahashi,K.,Tanabe,K.,Ohnuki,Μ.,Narita,Μ.,Ichisaka,Τ.,Tomoda,K.,andYamanaka,S.(2007).Inductionofpluripotentstemcellsfromadulthumanfibroblastsbydefinedfactors.Cell131,861-872.[3]Yu,J.Y.,Vodyanik,Μ.A.,Smuga-Otto,K.,Antosiewicz-Bourget,J.,Frane,J.L.,Tian,S.,Nie,J.,Jonsdottir,G.A.,Ruotti,V.,Stewart,R.,etal.(2007).Inducedpluripotentstemcelllinesderivedfromhumansomaticcells.Science318，1917-1920.[4]Liu,H.S.，Zhu,F.F.，Yong,J.，Zhang,P.B.，Hou,P.P.,Li,H.G.，Jiang,W.,Cai,J.,Liu,Μ.,Cui,K.,etal.(2008).GenerationofInducedPluripotentStemCellsfromAdultRhesusMonkeyFibroblasts.CellStemCell3,587-590.[5]Li,W.L.,Wei,W.,Zhu,S.,Zhu,J.,Shi,Y.,Lin,Τ.,Hao,E.,Hayek,A.,Deng,H.,andDing,S.(2009).GenerationofRatandHumanInducedPluripotentStemCellsbyCombiningGeneticReprogrammingandChemicalInhibitors(vol4,pg16,2009).CellStemCell4,370-370.[6]Esteban,M.A.,Xu,J.,Yang,J.，Peng,M.，Qin,D.，Li，W.，Jiang,Z.，Chen,J.，Deng,K.,Zhong,M.,etal.(2009).GenerationofInducedPluripotentStemCellLinesfromTibetanMiniaturePig.JournalofBiologicalChemistry284,17634-17640.[7]Keefer,C.L.，Pant,D.，Blomberg,L.，andTalbot,N.C.(2007).Challengesandprospectsfortheestablishmentofembryonicstemcelllinesofdomesticatedungulates.AnimalReproductionScience98,147-168.[8]Martin,G.R.(1981).Isolationofapluripotentcelllinefromearlymouseembryosculturedinmediumconditionedbytera-tocarcinomastemcells.ProcNatlAcadSciUSA78,7634-7638.[9]Thomson,J.A.，Itskovitz-Eldor,J.，Shapiro,S.S.，ffaknitz,M.A.，Swiergiel,J.J.,Marshall,V.S.,andJones,J.M.(1998).Embryonicstemcelllinesderivedfromhumanblastocysts.Science282,1145-1147.
发明内容针对上述现有技术中存在的问题与不足，本发明的目的在于提供一种利用转录因子转染牛体细胞成为诱导性多能干细胞的方法，用该方法制备的诱导性多能干细胞(iPSCs)，其细胞集落形态、生长特性、干细胞表面标记、干性基因表达、主要干性基因启动子序列区域甲基化模式、类胚体形成与体外分化能力、畸胎瘤形成能力，以及参与嵌合体形成等八个方面都与胚胎干细胞特性非常相似。实现上述发明目的技术方案是利用转录因子转染牛体细胞产生诱导性多能干细胞的方法，具体包括下列步骤1)牛皮肤成纤维细胞的分离与培养以成年牛皮肤成纤维细胞BDFs和新生牛皮肤成纤维细胞NDFs经常规培养分别获得大量的成年牛皮成纤维细胞肤细胞和新生牛皮肤成纤维细胞；2)牛维持多能性基因转录因子的克隆及其逆转录病毒载体的构建从50-60日龄牛胎儿中分离生殖嵴，提取总RNA，经过逆转录反应得到cDNA；以cDNA为模板，经过PCR反应得到牛0ct4、Sox2和Klf4三个基因扩增产物并经测序验证序列正确而后将目的基因插入到逆转录病毒载体pMSCVneo中，构建这3种基因的逆转录病毒表达载体；3)逆转录病毒的包装与准备将PT67包装细胞按照常规方法培养在含有15%胎牛血清的DMEM培养基中，应用脂质体将构建的逆转录病毒质粒转染进入包装细胞PT67细胞；在应用脂质体包装病毒颗粒前1小时，将包装细胞PT67的培养液DMEM培养基换成无血清培养液，将4_8μg包含有转录因子基因的逆转录病毒质粒DNA和10-20μ1脂质体分别加入到2份500μ1Opti-MEM-I+GlutaMAX-I转染优化液进行稀释，轻轻混勻，室温下孵育5分钟，然后将含有脂质体lipofectamindOOO的稀释液缓慢滴入含有逆转录病毒质粒的稀释液中，轻轻混勻，室温下再孵育20分钟，然后将上述混合液逐滴加入PT67包装胞培养皿中；转染24小时后，每24小时更换含有病毒颗粒培养液一次，连续3天，收集病毒悬浮液，在4°C条件下经25000转/分离心90分钟后，10倍浓缩病毒上清液；将包含有0ct4、SoX2和Klf4三个基因病毒上清液进行等量混合，并加入8μg/mlPolybrene组成特定的三因子基因组合，-80°C保存备用；4)逆转录病毒感染牛皮肤成纤维细胞以及牛的iPS细胞的获得将成年牛皮肤成纤维细胞BDFs和新生公牛皮肤成纤维细胞NDFs按照常规方法培养在60mm塑料培养皿中，待培养皿中细胞生长到70-80%融合时将包含0ct4、Sox2和Klf4基因转录因子的逆转录病毒上清液混合液大约5ml，分别加入到成纤维细胞BDFs与NDFs培养皿中感染成纤维细胞；细胞长满后培养皿后按1:3常规传代，视细胞生长情况在第6-10d将细胞以IXIO5细胞/孔的密度，转移至预先铺有人羊膜(HAM)的6孔培养板上，作为饲养层培养感染后的牛细胞，同时培养液更换成干细胞培养液；培养孔内每天半量换液，连续观察20-28d，直到有细胞集落出现为止，记为0代，即为牛iPSCs细胞。所述的干细胞培养液组成为每IOOml溶液中含有82.69ml的knockout_DMEM、15mlFBSUml浓度为200mM谷氨酰胺、Iml浓度为IOmM非必需氨基酸、200μ1浓度为55mMβ-巯基乙醇、10μ1浓度为400ng/mL人重组碱性成纤维生长因子(bFGF)UOOμ1浓度为105U/ml白血病抑制因子(LIF)。牛iPSCs传代时，应用0.05%trypsin+0.02%EDTA消化液消化，经过中和、离心与重悬再传代至新的HAM支持物上，在37-38°C，5%左右CO2，饱和湿度条件下扩增培养，得到牛iPS细胞株。牛iPSCs每隔3-5天传代一次，目前已经传代120天，超过25代。液氮冻存，解冻后生长活力较好，大约有80%-90%存活率。本发明还有一个目的是提供0ct4基因的重组逆转录病毒表达载体pMSCV_0ct4及在基因基因工程中的应用。本发明还有一个目的是提供Sox2基因的重组逆转录病毒表达载体pMSCV-Sox2及在基因基因工程中的应用。本发明获得诱导性多能干细胞和其制备方法与现有技术相比，具有以下优点1、本发明中应用自主克隆牛的3种维持干细胞多能性基因，通过干细胞逆转录病毒介导，诱导牛皮肤成纤维细胞，使其重编程为完全具有胚胎干细胞生物特性的牛iPSCs。2、本发明在培养条件中首次采用脱细胞后人羊膜作HAM为支持物代替小鼠胚胎成纤维细胞MEF来维持牛iPSCs体外增殖并长期保持未分化的多能性状态，而且避免了应用小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)作为干细胞的饲养层所带来的异种动物细胞污染问题。3、本发明采用基因诱导产生多能性干细胞的方法，不但解决了家畜特别是牛多能性干细胞难以获得的技术难题，为其他动物干细胞建系提供了理论依据和实验基础。图1成年母牛皮肤成纤维细胞(BDFs)50x显微镜图。图2新生公牛皮肤成纤维细胞(NDFs)50x显微镜图。图3PT67包装细胞50x显微镜图。图4电镜下逆转录病毒颗粒10万倍电镜图。图5集落碱性磷酸酶染色IOOx显微镜图。图6集落碱性磷酸酶染色200x显微镜图。图7SSEA-3明视野显微镜图。图8SSEA-3染色(+++)显微镜图。图9Sox2明视野显微镜图。图10Sox2染色(+++)显微镜图。图11囊腔样类胚体结构显微镜图。图12代表外胚层细胞系的βIII-Tubulin染色阳显微镜图。图13代表中胚层细胞系的α-actin染色阳性显微镜图。图14代表内胚层细胞系的甲胎蛋白(a-fetoprotein)染色阳性显微镜图。图15腺体样结构(内胚层)400x显微镜图。图16骨骼肌结构(中胚层)400x显微镜图。图17原始神经元结构(外胚层)400x显微镜图。图18EB的RT-PCR检测结果凝胶电泳图。图19嵌合体山羊组织的PCR检测电泳图。具体实施例方式以下通过申请人给出的具体获得牛iPSCs的方法及经过多种试验证明它在集落形态、生长特性、表面标志、体内外分化能力以及嵌合体形成等诸多方面都具有与胚胎干细胞完全一致的生物学特性。实施例1牛皮肤成纤维细胞的分离与培养成年牛皮肤成纤维细胞(bovinedermalfibroblasts，BDFs)来自成年雌性Holstein奶牛耳缘皮肤。将组织清洗消毒后剪成细小组织块，在常规培养条件下，用含15%-20%胎牛血清(FBS)(Gibco公司产品)的高糖DMEM(Gibco公司产品)中培养。每2-3d换养液1次，7-10d后就有成纤维细胞从组织块边缘移出，12-16d后大量成纤维细胞紧密排布于组织块周围。用胰蛋白酶与EDTA溶液消化后传代，即获得大量的成年牛成纤维细胞皮肤细胞，见图1。新生公牛皮肤成纤维细胞(newbornbovinedermalfibroblast,NDFs)来自Holstein品种新生公牛耳缘皮肤，见图2，分离和培养方法与上述母牛皮肤成纤维细胞方法相同。为了保证细胞活力，本发明采用26代以内的细胞作为诱导前靶细胞。实施例2牛维持多能性关键基因转录因子的克隆及其逆转录病毒载体的构建从50-60日龄荷斯坦品种奶牛(Holstein)的胎儿体内分离生殖嵴，组织勻浆后用TRIzolLSReagent提取总RNA，经过DNaseI(RNasefree)处理以除去基因组DNA污染。经反转录反应得到cDNA。然后以cDNA为模板，分别经PCR扩增0ct4、SoX2和Klf4三种转录因子基因开放性阅读框(ORF)全序列，基因克隆所用引物序列见表1所示。表1扩增牛0ct4、Sox2和Klf43个基因的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>其中0ct4基因PCR扩增的扩增参数是94°C预变性5min，94°C变性45sec，60°C退火45sec，72°C延伸lmin，循环35次，72°C再延伸lOmin，预期PCR产物长度应为1083bp。Sox2基因的扩增参数是94°C预变性5min，94°C变性45sec，54°C退火30sec，72°C延伸lmin，循环35次，72°C再延伸lOmin，预期PCR产物长度应为963bp。Klf4基因的扩增参数是94°C预变性4min，94°C变30s，60°C退火lmin，72°C延伸lmin30sec，共35个循环，72°C再延伸lOmin，预期PCR产物长度应为1434bp。上述PCR产物各取5μ1，在1%琼脂糖凝胶电泳以鉴定其大小，剩余PCR产物-20°C保存。电泳检测结果显示，PCR扩增产物长度与预期奶牛3种转录因子基因大小完全一致，符合试验设计要求。然后将3种PCR产物剩余部分分别经过DNA片段GelExtractionkit纯化、回收；回收产物与克隆载体pMD18_T以solutionI混合连接，16°C连接过夜。将连接产物转化入感受态细胞TGI内进行克隆。经含Ampicillin(80μg/ml)、X-gal与IPTG的LB平板上37°C筛选培养14-16小时。从3种培养物中分别挑取6_10个白色菌落接种含氨苄青霉素(Ampicillin)的LB培养液中小量摇菌，并按照质粒抽提试剂盒说明书步骤抽提微量质粒。包含0ct4、Sox2和Klf43种基因的质粒经过双酶切、单酶切和质粒PCR鉴定。其中质粒经过BglII+EcoRI双酶切和EcoRI单酶切以及质粒PCR鉴定，以获得pMD-18T-0ct4、pMD-18T-Sox2、pMD_18T_Klf4三种质粒阳性克隆。选送鉴定结果为阳性的质粒到生物公司测序。测序结果应用DNAstart7.10软件与GenBank中参考序列进行同源性比较分析。分析结果表明，0ct4、SoX2和Klf4的基因序列与参考序列同源性分别为99.4%,99.9%,99.9%。将上述测序正确的pMD-18T-0ct4、pMD-18T_Sox2和pMD-18T_Klf4三种质粒回收纯化后与逆转录病毒pMSCVneo载体分别经过BglII+EcoRI双酶切，然后纯化与回收酶切后的3种目的基因片段和线性化pMSCVneo质粒载体。将线性化的反转录病毒载体pMSCVneo与回收的目的片段应用DNALigationKitVersion2.0在16°C连接过夜，14-16小时后，连接产物转化入JM109感受态细胞，经过氨苄青霉素(Ampicillin，50μg/mL)LB平板上筛选出逆转录病毒质粒的阳性克隆。从3个培养物板中，每一种重组质粒分别挑取6-10个菌落小量摇菌，微量方法提取重组的逆转录病毒质粒。经过BglII+EcoRI双酶消化鉴定、质粒PCR扩增鉴定及测序分析鉴定。三种重组逆转录病毒质粒经过双酶切后，都可以获得已知大小的目的基因片段与逆转录病毒载体片段，说明本发明所构建的重组逆转录病毒表达载体结构正确。通过测序检测，所有重组逆转录病毒质粒中所包含的3个目的基因的序列与PCR扩增序列完全一致，也与GenBank中参考序列完全一致，表明在本发明中所构建得3种重组逆转录病毒质粒过程中目的基因没有发生阅读框的移码和碱基突变等情况，说明所应用的3中基因序列完全正确。本发明中所构建的3种重组逆转录病毒表达载体分别命名为pMSCV-0ct4，pMSCV-Sox2,pMSCV-Klf4。实施例3逆转录病毒的包装与准备PT67包装细胞按照常规方法培养在DMEM培养基中，待细胞达到70%-80%汇合时，应用脂质体将逆转录病毒载体转染进入包装细胞PT67细胞，进行病毒包装以获得具有感染性逆转录病毒颗粒。转染前1小时，将含有胎牛血清的DMEM培养基换成无血清培养液，4-8μg逆转录病毒质粒DNA和10-20μ1脂质体分别加入到500μ1Opti-MEM-I+GlutaMAX-I(Gibco公司产品)优化转染液中，轻柔混勻，室温孵育，然后将稀释的质粒DNA和脂质体轻柔混勻，再室温孵育20分钟后，将混合液逐滴加入PT67细胞培养皿中。细胞在37°C，5%CO2和饱和湿度条件下培养4-6小时后，转染液换成新的含15%FBS的DMEM培养液。经过24小时转染后，收集PT67细胞培养液上清，该上清中就包含感染性逆转录病毒颗粒。上清液经过0.45μm孔径的滤膜过滤。每24h收集一次，连续收集3d。病毒悬浮液在4°C条件下，经过25，000转/分，离心90分钟，10倍浓缩病毒上清液。将包含有0ct4、Sox2和Klf4三种基因病毒上清液进行等量混合，并添加8μg/mlPolybrene组成特定的三因子基因组合，-80°C保存，准备转染牛皮肤成纤维细胞。实施例4逆转录病毒感染牛皮肤成纤维细胞以及牛的iPS细胞的获得及传代成年母牛的耳缘皮肤成纤维细胞(BDFs)和新生犊牛皮肤成纤维细胞(NDFs)，两种细胞均在病毒感染的前1天，把2XIO5个细胞接种于60mm培养皿。培养24小时后，一般细胞会有70-80%融合，将含有0ct4、Sox2和Klf4三个基因的逆转录病毒上清混合液分别加入成纤维细胞BDFs与NDFs培养皿中感染成纤维细胞；细胞长满培养皿后按13常规传代，视细胞生长情况在第6-10d将细胞以1XIO5细胞/孔的密度，转移至预先铺有人羊膜(HAM)6孔培养板上，用HAM代替MEF作为饲养层培养感染后的牛细胞，同时培养液更换成干细胞培养液；培养孔内每天半量换液，连续观察20-28d，直到有ES细胞样集落出现记为0代，即为牛iPS细胞。牛iPSCs传代时，应用0.05%trypsin+0.02%EDTA消化液消化，经过中和、离心与重悬再传代至新的HAM支持物上，在37-38°C，5%左右CO2，饱和湿度条件下扩增培养，得到牛iPS细胞株。牛iPSCs每隔3-5天传代一次，目前已经传代120天，超过25代。液氮冻存，解冻后生长活力较好，大约有85%-90%存活率。干细胞培养液组成为每IOOml溶液中含有82.69ml的knockout-DMEM、15ml卩85、11111浓度为2001111谷氨酰胺、11111浓度为101111非必需氨基酸、20(^1浓度为551111β-巯基乙醇、10μ1浓度为400ng/mL人重组碱性成纤维生长因子(bFGF)、100μ1浓度为IO5U/ml白血病抑制因子(LIF)。试验例1建立的牛iPS细胞系的鉴定为了鉴定本发明中所建立的牛诱导性多能干细胞(bovineinducedpluripotentstemcells,iPSCs)与传统意义上胚胎干细胞具有非常类似的生物学特性，发明人在多个不同方面设计鉴定本发明所建立的牛的iPS细胞，1.作为靶细胞奶牛皮肤成纤维细胞形态，见图1-2。2.PT67包装细胞与包装后的逆转录病毒颗粒形态，见图3-4。3.iPSCs集落形态与AP染色阳性(红色)鉴定，见图5_6。4.iPSCs集落的免疫荧光细胞化学染色鉴定，见图7-10。5.类胚体的形成于体外分化鉴定。利用牛iPSCs体外悬浮培养7天后就可以形成多个球形和囊腔样类胚体(EmbryoidBody,EB)结构，见图11，其中A显示为球形的类胚体结构，B显示的是囊腔样类胚体结构。利用牛iPSCs形成的类胚体(EB)，再经过贴壁培养14_21天，并通过添加诱导培养基的方法使其定向分化，形成代表3个胚层的不同细胞形态。3个胚层代表细胞系，见图12-14示。6.畸胎瘤形成与三个胚层细胞的分化将牛iPSCs(大约1.3X106细胞)注射到裸鼠皮下，经过6_9周时间聚会在裸鼠注射部位皮下形成肿瘤，即为畸胎瘤。畸胎瘤制备成组织切片，经过H.E.染色后显微镜观察，可以观察到三个胚层细胞形态同时存在畸胎瘤中，观察结果如下图15-17所示(箭头)，说明牛iPSCs具有发育的全能性。另外，对畸胎瘤组织提取总RNA，应用三个胚层代表性基因引物进行RT-PCR检测，结果也显示了三个胚层细胞的存在，也说明所建立的牛iPSCs具有发育多能性。类胚体三个胚层细胞代表基因的RT-PCR检测结果见图18，图中泳道1:β-Actin为内参；泳道2=Nestin,泳道3β-tubulin(外胚层)；泳道4:GATA4，泳道5Actinalpha2(中胚层)；泳道6:Keratin_14，泳道7:PDX_1，泳道8:AFP(内胚层)，所用引物见表2。表2.检测分化细胞代表基因PCR所用引物<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>试验例2利用牛iPSCs建立与“牛-山羊”嵌合体应用妊娠58天萨能奶山羊做受体羊，采用剖腹手术经子宫壁触摸胎儿，将其中一株牛iPSCs(大约1.IxlO6个细胞)注射到胎儿腹腔中。山羊妊娠足月后，共产生4只羔羊，其中1只雄性羔羊全身皮毛发现大面积嵌合，从体表特征判定为牛-羊嵌合体，遗憾的是该羔羊出生后2小时因为心肺功能衰竭而死亡。尸体经过剖检后未发现器官异常现象。山羊胎儿腹腔注射牛iPS细胞制作嵌合体山羊，所生嵌合体羔羊皮毛多处有黑色花纹，这些花纹与Holstein奶牛非常相似。该嵌合羔羊在体表多个部位有不规则片状与条索状的黑色皮毛，其中包括胸部、背部、嘴唇、鼻端、眼脸、耳廓、四蹄、眼球、尾尖，阴囊等部位。应用牛的线粒体DNA的D-LOOP高变区序列设计引物对嵌合体山羊进行线粒体DNA检测，嵌合有牛iPS细胞嵌合的组织包括心、肝、脾、肺、肾、血液、血管、睾丸等多个组织。但是胰腺、小肠和骨组织没有检测到嵌合现象。这些试验结果证实该羊羔是牛羊细胞嵌合体山羊。同时注射牛皮肤成纤维细胞(BDFs)与(NDFs)的对照胎羊没有出现牛细胞的嵌合现象。PCR产物凝胶电泳图19中，1-30泳道代表嵌合体山羊的各组织器官1心，2血管，3心外膜，4淋巴结，5血液，6肝，7胰腺(-)，8脾，9食管，10胃，11小肠(-)，12大肠，13BDF细胞，14BDF-iPS0细胞，15受体胎儿母亲㈠，16脑，17脊髓，18角膜，19肺，20气管，21肾，22睾丸，23黑皮肤，24白皮肤，25骨骼肌，26软骨(-)，27平滑肌，28BDF细胞，29BDF_iPS0细胞，30受体胎儿母亲(_)。<110>西北农林科技大学<120>利用转录因子转染牛体细胞成为诱导性多能干细胞的方法<160>3<210>1<211>1083bp<212>DNA<213>0CT4<400>1ATGGCGGGACACCTCGCTTCTGACTTCGCCTTCTCGCCCCCGCCGGGCGGTGGAGGCGAT60GGGCCGGGAGGGCCAGAGCCGGGCTGGGTTGATCCTCGGACCTGGATGAGCTTCCAAGGG120CCTCCCGGTGGGTCGGGGATCGGGCCGGGGGTTGTGCCTGGCGCCGAGGTGTGGGGGCTT180CCCCCGTGCCCCCCGCCCTATGACTTGTGTGGAGGGATGGCCTACTGTGCGCCGCAGGTT240GGAGTGGGGCCGGTGCCCCCAGGCGGCCTGGAGACCCCTCAGCCCGAGGGCGAGGCGGGA300GCCGGGGTGGAGAGCAACTCCGAGGGGGCCTCCCCGGACCCCTGCGCCGCACCCGCAGGC360GCCCCGAAACTGGACAAGGAGAAGCTGGAGCCGAACCCTGAGGAGTCCCAGGACATCAAA420GCTCTTCAGAAAGACCTTGAACAATTTGCCAAGCTCCTAAAGCAGAAGAGGATCACACTA480GGATATACCCAGGCCGATGTGGGGCTCACCCTGGGGGTTCTCTTTGGAAAGGTGTTCAGC540CAAACGACTATCTGCCGTTTTGAGGCTTTGCAGCTCAGTTTCAAGAACATGCGTAAGCTG600CGGCCCCTGCTGCAGAAGTGGGTGGAGGAAGCTGACAACAACGAGAATCTGCAGGAGATA660TGCAAGGCAGAGACCCTTGTGCAGGCCCGAAAGAGAAAGCGGACGAGTATCGAGAACCGA720GTGAGAGGCAACCTGGAGAGCATGTTCCTGCAGTGCCCGAAGCCCACCCTGCAGCAAATT780AGCCACATCGCCCAGCAGCTCGGGCTGGAGAAAGACGTGGTCCGAGTGTGGTTTTGCAAC840CGTCGCCAGAAGGGCAAACGATCAAGCAGTGACTACTCCCAACGTGAGGATTTTGAGGCT900GCTGGGTCTCCTTTCGCAGGGGGACCCGTATCCTTTCCTCTGGCGCCGGGGCCCCATTTT960GGTACCCCAGGCTACGGGGGCCCTCACTTCACTACTCTGTACTCTTCGGTCCCATTCCCT1020GAGGGTGAGGCCTTTCCCTCGGTGTCTGTCACCGCTCTGGGCTCCCCTATGCATGCAAAC1080TGA1083<210>2<211>963bp<212>DNA<213>Sox2<400>2ATGTACAACATGATGGAGACGGAGCTGAAGCCGCCGGGCCCGCAGCAAACTTCGGGGGGC60GGCGGCGGCGGCGGCGGCAACTCCACCGCGGCGGCGGCGGGCGGCAACCAGAAGAACAGC120CCGGACCGAGTCAAGCGGCCCATGAACGCCTTCATGGTGTGGTCCCGCGGGCAGCGGCGC180AAGATGGCCCAAGAGAACCCTAAGATGCACAACTCGGAGATCAGCAAGCGCTTGGGCGCC240GAGTGGAAACTTTTGTCCGAGACGGAGAAGCGGCCGTTCATCGACGAGGCCAAGCGGCTG300CGAGCGCTGCACATGAAGGAACACCCGGATTATAAATACCGGCCCCGGCGGAAAACCAAG360ACGCTCATGAAGAAGGATAAGTACACACTGCCGGGAGGGCTGCTCGCCCCGGGCGGCAAC420AGCATGGCGAGCGGGGTCGGGGTGGGCGCCGGCCTCGGCGCGGGCGTGAACCAACGCATG480GACAGCTACGCGCACATGAACGGCTGGAGCAACGGCAGCTACAGCATGATGCAGGACCAG540CTGGGCTACCCGCAACACCCGGGCCTCAACGCGCACGGCGCCGCTCAGATGCAGCCCATG600CACCGCTACGACGTGAGCGCCCTGCAGTACAACTCTATGACCAGCTCGCAGACCTACATG660AACGGCTCGCCCACCTACAGCATGTCCTATTCTCAGCAGGGCACCCCTGGCATGGCGCTT720GGCTCCATGGGCTCGGTGGTGAAGTCCGAGGCCAGCTCCAGCCCCCCCGTGGTTACCTCT780TCTTCCCACTCCAGGGCGCCCTGCCAAGCCGGGGACCTCCGGGACATGATCAGCATGTAC840CTCCCCGGCGCCGAGGTGCCGGAGCCCGCCGCCCCCAGCAGACTTCACATGTCCCAGCAC900TACCAGAGCGGCCCGGTGCCCGGCACGGCCATTAACGGCACACTGCCCCTCTCGCACATG960TGA963<210>3<211>1434bp<212>DNA<213>KLF4<400>3ATGGCTGTCAGCGACGCGCTGCTCCCGTCCTTCTCCACGTTCGCGTCCGGCCCGGCGGGA60AGGGAGAAGACACTGCGTCCAGCAGGTGCCCCAAATAACCGCTGGCGGGAGGAGCTCTCC120CACATGAAGCGACTTCCCCCGGTGCTTCCCGGCCGCCCCTACGACCTGGCGGCGGCGACC180GTGGCCACCGACCTGGAGAGTGGAGGAGTCGGCGCGGCTTGCGGCAGCAGCAACCCGGCT240CTCCTGCCCCGGAGGGAGACGGAGGAGTTCAATGATCTCCTGGACCTGGACTTTATCCTC300TCCAACTCGCTGTCCCATCAGGAGTCCGTGGCCGCCACGGTGTCCTCGTCGGCATCAGCC360TCATCCTCGTCCTCCCCGTCGAGCAGCGGTCCAGCCAGTGCGCCTTCCACCTGCAGCTTC420AGCTATCCAATCCGGGCCGGGGGCGACCCGGGCGTGGCGGCGCCGGGCGGCGCGGGCGGC480GGCCTCCTGTACGGCCGGGAGTCTGCACCGCCTCCGACGGCTCCCTTCAACCTGGCGGAC540ATCAACGATGTGAGCCCCTCCGGCGGCTTCGTGGCCGAGCTCCTGCGGCCTGAATTGGAC600CCAGTGTACATTCCGCCGCAGCAGCCGCAGCCGCCAGGTGGCGGGCTGATGGGCGAGTTC660GTGTTGAAGGCGTCGCCGAGTGCCCCTGGCAGCGAGTACGGCAGCCCGTCGGTCATCAGT720GTTAGCAAAGGCAGCCCGGACGGCAGCCACCCGGTGGTGGTGGCGCCCTACAGCGGCGGG780CCGCCACGCATGTGCCCCAAGATCAAGCAGGAGGCTGTCTCCTCGTGCACCGTCGGTCGG840CCCCTAGAGGCCCACTTGGGCACTGGACCTCCTCTCAGCAATGGCCACCGGCCGCCTGCT900CACGACTTTCCCTTGGGGCGGCAGCTCCCCAGCAGGACTACCCCGACCCTGGGTGCCGAG960GAACTGCTGAGCAGCCGGGACTGTCATCCTGCCCTGCCGCTCCCCCCGGGCTTCCATCCC1020CACCCCGGGCCCAACTACCCTCCCTTCCTGCCCGACCAGATGCAGCCGCAGGTCCCACCG1080CTCCATTACCAAGAGCTCATGCCACCCGGTTCCTGCATGCCGGAGGAGCCCAAACCAAAG1140AGGGGAAGACGGTCGTGGCCCCGGAAAAGGACGGCCACTCACACTTGTGATTATGCAGGC1200TGCGGCAAAACCTACACGAAGAGTTCTCATCTCAAGGCACACCTGCGCACCCACACAGGT1260GAGAAACCTTACCACTGTGACTGGGATGGTTGTGGGTGGAAGTTTGCCCGCTCAGATGAA1320CTGACCAGGCACTACCGCAAACACACCGGGCACCGCCCCTTCCAGTGCCAGAAGTGCGAC1380CGGGCATTCTCGAGGTCGGACCACCTCGCCTTACACATGAAGAGGCACTTTTAA143权利要求利用转录因子转染牛体细胞成为诱导性多能干细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤1)牛皮肤成纤维细胞的分离与培养以成年牛皮肤成纤维细胞BDFs和新生牛皮肤成纤维细胞NDFs经常规培养分别获得大量的成年牛皮肤成纤维细胞和新生牛皮肤成纤维细胞；2)牛维持多能性基因转录因子的克隆及其逆转录病毒载体的构建从50-60日龄牛胎儿中分离生殖嵴，提取总RNA，经过逆转录反应得到cDNA；以cDNA为模板，经过PCR反应得到牛Oct4、Sox2和Klf4三个基因扩增产物并经测序验证序列正确而后将目的基因插入到逆转录病毒载体pMSCVneo中，构建这3种基因的逆转录病毒表达载体；3)逆转录病毒的包装与准备将PT67包装细胞按照常规方法培养在含有15％胎牛血清的DMEM培养基中，应用脂质体将构建的逆转录病毒转染进入包装细胞PT67细胞；将8μg含有Oct4、Sox2和Klf4三个不同基因的逆转录病毒表达载体质粒和3份20μl转染试剂脂质体lipofectamine2000分别用500μlOpti-MEM-I+GlutaMAX-I转染优化液进行稀释，轻轻混匀，室温下孵育5分钟，然后将含有脂质体lipofectamine2000的稀释液缓慢滴入含有逆转录病毒质粒的稀释液中，轻轻混匀，室温下再孵育20分钟后，然后将上述混合液逐滴加入PT67包装胞培养皿中；转染24小时后，每天更换含有病毒颗粒培养液一次，连续3天，收集病毒悬浮液，在4℃条件下经25000转/分离心90分钟后，10倍浓缩病毒上清液；将含有Oct4、Sox2和Klf4三个基因病毒上清液进行等量混合，并加入8μg/mlPolybrene组成特定的三因子基因组合，-80℃保存备用；4)逆转录病毒感染牛皮肤成纤维细胞以及牛的iPS细胞的获得将成年牛皮肤成纤维细胞BDFs和新生公牛皮肤成纤维细胞NDFs按照常规方法培养在60mm塑料培养皿中，待培养皿中细胞生长到70-80％融合时将包含Oct4、Sox2和Klf4基因转录因子的逆转录病毒上清液混合液大约5ml分别加入到成纤维细胞BDFs与NDFs培养皿中感染成纤维细胞；细胞长满培养皿后按13常规传代，视细胞生长情况在第6-10d将细胞以1×105细胞/孔的密度，转移至预先铺有人羊膜(HAM)的6孔培养板上，作为饲养层培养感染后的牛细胞，同时培养液更换成特制的干细胞培养液；培养孔内每天半量换液，连续观察20-28d，直到有细胞集落出现为止，记为0代，即为牛iPSCs细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在应用脂质体包装病毒颗粒前1小时，将包装细胞PT67的培养液DMEM培养基换成无血清培养液，4-8μg包含有转录因子基因的逆转录病毒质粒DNA和10-20μ1脂质体分别加入到两份500μ1Opti-MEM-I+GlutaMAX-1优化转染液中，轻柔混勻，室温孵育，然后将稀释的质粒DNA和脂质体轻柔混勻，再室温孵育20分钟后，将质粒-脂质体混合液逐滴加入ΡΤ67细胞培养皿中。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的干细胞培养液的组成为每1OOml溶液中含有82.69ml的knockout_DMEM、15mlFBSUml浓度为200mM谷氨酰胺、Iml浓度为IOmM非必需氨基酸、200μ1浓度为55mMβ-巯基乙醇、10μ1浓度为400ng/ml人重组碱性成纤维生长因子、100μ1浓度为105U/ml白血病抑制因子。4.权利要求1所述0ct4基因的重组逆转录病毒表达载体pMSCV-0ct4。5.权利要求1所述Sox2基因的重组逆转录病毒表达载体pMSCV-Sox2。6.权利要求4所述重组逆转录病毒表达载体pMSCV-0ct4在基因基因工程中的应用。7.权利要求5所述重组逆转录病毒表达载体pMSCV-Sox2在基因基因工程中的应用。全文摘要本发明公开了一种利用转录因子转染牛体细胞产生诱导性多能干细胞(iPSCs)的方法，具体包括下列步骤1)牛皮肤成纤维细胞的分离与培养；2)牛维持多能性基因转录因子的克隆及其逆转录病毒载体的构建；3)逆转录病毒的包装与准备；4)逆转录病毒感染牛皮肤成纤维细胞以及牛的iPS细胞的获得。本发明首次采用脱细胞后人羊膜作为支持物代替小鼠胚胎成纤维细胞来维持牛iPSCs体外增殖并长期保持未分化的多能性状态。这种采用基因诱导产生多能性干细胞的策略，不但解决了家畜特别是牛多能性干细胞难以获得的技术难题，而且避免了应用鼠胚胎成纤维细胞作为干细胞的饲养层所带来的异种动物细胞污染问题。文档编号C12N15/867GK101812480SQ20091021898公开日2010年8月25日申请日期2009年11月16日优先权日2009年11月16日发明者吕长荣,窦忠英,辛晓玲,陈冬梅申请人:西北农林科技大学