一种高效诱导杂种檀香体细胞胚胎发生与植株再生的方法
【技术领域】
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[0001]本发明属于植物繁殖领域，具体涉及一种高效诱导杂种檀香体细胞胚胎发生与植株再生的方法。
【背景技术】
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[0002]擅香(Santalumalbum L.)为擅香科(Santalaceae)擅香属(Santalum)半寄生常绿乔木，为名贵、珍稀植物，主要分布于印度，印度尼西亚，澳大利亚及太平洋的一些群岛。人类利用它已有数千年的历史，因其木材可用于雕刻和提炼檀香油而格外出名，素有“绿色黄金”之称。中国无檀香的原生分布，其成品或半成品过去一直从国外进口。1962年中国科学院华南植物园在大陆首次从印尼引入檀香种子繁育成功，其后从印度引入“老山香”优质种源也获得成功。经过几十年的研究试验，如今檀香在华南植物园已能结籽繁殖并能结香。近二十年来，我们研究组还向国内其它地区推广试种檀香。
[0003]研究资料表明:在斐济，檀香和斐济檀香的有性杂交种Fl代(杂种檀香S.albumX
S.yasi)表现出明显的杂种优势，其生长势比母本斐济檀香高300%，比父本檀香则高32% ;结香方面，檀香需要10年，而杂种檀香则需要6-7年;在心材生长方面，一般每株檀香需要种植25-30年心材达到40-80公斤，而杂种檀香Fl只需种植15-20年。近年来我们加强与国内外交流的基础上，与广东肇庆高要龙竹岛檀香研究基地研究人员从国外引种杂种檀香到龙竹岛檀香研究基地，生长良好;虽然杂种檀香能够少量结实，但后代性状严重分离，必须寻求无性繁育技术以维持杂种优势。
[0004]目前，国内外未见杂种檀香体细胞胚胎发生与植株再生报道和专利申请。
【发明内容】
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[0005]本发明的目的是提供一种操作性强，繁殖效率和应用价值高，能为杂种檀香大规模快速繁殖提供种苗的高效诱导杂种檀香体细胞胚胎发生与植株再生的方法
[0006]本发明采用杂种檀香嫩茎为外植体，进行体细胞胚胎诱导、萌发、成熟、再生植株，通过胚性愈伤诱导体细胞胚可获得数量多，繁殖快，稳定性高等特点。可为成功地开展杂种檀香种苗快速繁殖提供育苗技术并为转基因实验提供一种有效的转化途径，从而实现了本发明的目的。
[0007]本发明的高效诱导杂种檀香体细胞胚胎发生与植株再生的方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0008]a、胚性愈伤组织的诱导与增殖:以杂种檀香的幼嫩茎作为外植体，进行消毒，将消毒后的外植体接种至胚性愈伤组织诱导培养基上培养，获得胚性愈伤组织，将胚性愈伤组织转接到新的胚性愈伤组织诱导培养基中进行继代增殖培养，获得胚性细胞，每2星期转接I次，可维持胚性愈伤的再生能力，所述的胚性愈伤组织诱导培养基每升含有2，4_D(2，4一二氯苯氧乙酸)0.5-1.0mg、蔗糖20-30g、琼脂6_7g，余量为MS培养基，所述的杂种檀香是父本檀香(Santalum album)和母本斐济檀香(Santalum yasi)的有性杂交种Fl代；
[0009]b、体细胞胚的诱导与成熟:将胚性细胞转接到体细胞胚胎诱导培养基上诱导体细胞胚的发生，获得体细胞胚，挑选体细胞胚转入体细胞胚成熟培养基中培养，获得成熟的子叶胚，所述的体细胞胚胎诱导培养基每升含有6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)0.2-0.5mg、蔗糖20-30g、琼脂6-7g，余量为MS培养基，所述的体细胞胚成熟培养基每升含有6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)0.05-0.Img、蔗糖20-30g、琼脂6_7g，余量为MS培养基；
[0010]c、体细胞胚萌发与植株再生:挑取成熟的子叶胚转入体细胞胚萌发培养基中培养，获得萌发的体细胞胚，将萌发的体细胞胚转移到植株再生培养基上培养，获得完整的再生植株，所述的体细胞胚萌发培养基每升含有6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)0.2-0.5mg、GA3(赤霉素)0.5-lmg、蔗糖20-30g、琼脂6_7g，余量为MS培养基，所述的植株再生培养基每升含有6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)0.2-lmg、IBA(吲哚丁酸)0.2-lmg、蔗糖20-30g、琼脂6-7g，余量为I/2MS培养基。
[0011]所述的以杂种檀香的幼嫩茎作为外植体，进行消毒，优选是将外植体先用体积分数50%的酒精水溶液擦拭外植体2-3次，然后在超净工作台上先用体积分数75%酒精水溶液浸泡30秒，无菌水冲洗后放入质量分数0.1 %HgCl溶液中浸泡5?6min，每隔2分钟摇晃I次，无菌水冲洗2-3次，再用体积分数6-12%过氧化氢溶液消毒6-8min，无菌水冲洗3-5次，获得消毒后的外植体。
[0012]优选，所述的步骤a的将消毒后的外植体接种至胚性愈伤组织诱导培养基上培养，获得胚性愈伤组织，将胚性愈伤组织转接到新的胚性愈伤组织诱导培养基中进行继代增殖培养；
[0013]所述的步骤b的将胚性细胞转接到体细胞胚胎诱导培养基上诱导体细胞胚的发生，获得体细胞胚，挑选体细胞胚转入体细胞胚成熟培养基中培养；
[0014]所述的步骤c的挑取成熟的子叶胚转入体细胞胚萌发培养基中培养，获得萌发的体细胞胚，将萌发的体细胞胚转移到植株再生培养基上培养；
[0015]其培养条件都为光照强度1000-20001X，光照时间I Oh/d，培养温度26 ± 2°C。
[0016]MS培养基为国际通用的培养基，其成份和配置方法见Murashige T , Skoog F(1962)(A revised medium for rapid growth and b1assay with tobacco tissuecultures.Phys1l Plantl5:473-497)。1/2MS培养基是指将MS培养基中大量元素用量为原来的1/2，其余成份不变。
[0017]本发明选用优良栽培杂种檀香幼嫩茎作为外植体，采用分次消毒程序进行外植体的表面消毒可获得较高的成功率。消毒成功的无菌外植体在含有2，4_D的胚性愈伤组织培养基上进行培养，诱导出纤维状胚性愈伤组织，再转移到体细胞胚诱导、成熟、萌发、植株再生培养基上培养，3个月后可以获得再生植株，繁殖周期短、数量多，稳定性高特点，解决杂种檀香组织培养繁殖种苗中存在的繁殖效率不高，将为开展杂种檀香种苗快速繁殖提供育苗技术，也可为高效的基因转化提供再生途径。本发明具有操作性强，繁殖效率和应用价值尚等优点。
【附图说明】
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[0018]图1是杂种檀香体细胞胚发生与植株再生，其中A、胚性愈伤组织;B、诱导的体细胞胚胎;C、体细胞胚胎发育的各个阶段:球形胚，心形胚，鱼雷形胚，子叶形胚，成熟的子叶胚； D再生植株。A-C标尺=2毫米，D标尺=I厘米。
【具体实施方式】
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[0019]以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0020]实施例1:高效诱导杂种檀香体细胞胚胎发生与植株再生的方法，包括以下步骤:
[0021](I)外植体及其处理
[0022]采自广东高要龙竹岛檀香栽培基地引种栽培6年的优良株系杂种檀香(父本檀香(Santalum album)和母本斐济檀香(Santalum yasi)的有性杂交种Fl代)嫩莖段作为外植体，先用体积分数50%酒精水溶液擦拭外植体2-3次，然后在超净工作台上先用体积分数75%酒精水溶液浸泡30秒，无菌水冲洗后放入质量分数0.1 %HgCl溶液中浸泡5-6min左右，每隔2分钟摇晃I次，无菌水冲洗2-3次，再用体积分数6%过氧化氢溶液消毒约6-8min，无菌水冲洗3-5次，得到表面消毒处理后的嫩茎。
[0023](2)胚性愈伤组织的诱导与增殖
[0024]用锋利的无菌解剖刀将表面消毒处理后的嫩茎切成1-1.5cm的带结茎段，无菌镊子放置茎段到胚性愈伤组织诱导培养基上。培养条件，光照强度ιοοο?χ，光照时间10h/d，培养温度26± 2°C。7-10(1后茎段开始膨胀且切口处开始萌动，培养20d后可见分裂旺盛的胚性愈伤组织(图1-A)，愈伤组织诱导率可达80%以上。然后将胚性愈伤组织转接到新的胚性愈伤组织诱导培养基中进行继代增殖培养，获得胚性细胞。每2星期转接I次，可维持胚性愈伤的再生能力。所述的胚性愈伤组织诱导培养基每升含有2，4-D(2，4 一二氯苯氧乙酸)1.0mg、蔗糖30g、琼脂7g，余量为MS培养基，pH5.8，其配制方法是将成份混合均匀后，调pH值，灭菌备用。
[0025](3)体细胞胚的诱导与成熟
[0026]取继代培养后第6d的胚性细胞，在体细胞胚胎诱导培养基上诱导体细胞胚的发生。培养条件，光照强度100lx，光照时间10h/d，培养温度26±2°C。15d后肉眼可见到体细胞胚的出现，到30d时，可见到大量的体细胞胚(图1-B)。挑选体细胞胚转入体细胞胚成熟培养基，培养条件，光照强度100Ix，光照时间10h/d，培养温度26 ± 2°C。获得成熟的子叶胚(其发育过程如图1-C所示)。