专利名称：一种生牛乳体细胞检测试纸及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生牛乳体细胞检测试纸及其制备方法，属于食品检测技术领域。
背景技术：
牛乳中的体细胞数(Somatic Cell Count, SCC)是指每毫升牛乳中的细胞总数。体细胞中大多数是白细胞(即巨噬细胞、嗜中性白细胞和淋巴细胞)，约占体细胞数的95%以上，其余为脱落的上皮细胞。产自健康乳房牛乳SCC通常小于10万/mL，包括1-7%的上皮细胞和30-74%的巨噬细胞。影响牛乳SCC的因素很多。一般来说，微生物是诱发乳房炎、引起SCC增加的主要原因，95 %的乳房炎是由金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠埃希氏杆菌等引起的。其次，当乳房因外伤或发生疾病出现炎症时，也可引起SCC大量增加。因此，牛乳中SCC是奶牛乳房健康状况和牛乳质量及防治乳房炎的重要指标。SCC的增多会引起牛乳产量的下降，鲜奶品质下降，炎乳废弃，严重时乳区化脓坏疽，使奶牛失去泌乳能力。每头患隐性乳房炎母牛平均日产奶量降低4%-10%。全世界约有2. 2亿头奶牛，其中约有1/3的奶牛患有各种类型的乳房炎，每年因乳房炎造成的损失高达350亿美元。在我国奶牛饲养条件更为粗糙，乳房炎的发病率更高，确切经济损失无法统计。我国的收购标准一般认为SCC小于50万/mL的牛乳为合格乳；超过50万/mL母牛患乳房炎危险性很大。而在欧美国家收购标准是，高质量的牛乳SCC应少于20万/mL，超过这个范围牛乳的品质就会下降；合格乳SCC —般在20-50万/mL之间；乳房炎乳SCC达到60-120万/mL。新两兰和澳大利亚的标准是SCC少于40万/mL。牛乳SCC的检测方法可分为直接检测和间接检测两种。直接检测法包括显微镜检测(标准显微镜法和荧光显微镜法)、荧光流式细胞计数法、电阻式粒度分析方法等。间接检测法包括加利福尼亚细胞数测定法(CMT)、威斯康辛乳腺炎试验(WMT)、4% NaOH凝乳法以及PH检验法等。现有方法存在的问题是仪器设备昂贵，运行成本高；检测精度差；检测耗时长；或操作繁琐，需要专业的技术人员进行操作。目前还没有一种既经济、快速准确，又操作简便的方法。因为检测技术及成本的限制，我国乳品行业与奶牛饲养业极少对牛乳的SCC进行检测，只有少数集约化管理的牧场应用丹麦FOSS公司产的体细胞检测仪进行月检，但是检测费用昂贵。随着乳品业的不断发展，体细胞的检测工作将逐渐变成一项日常工作，而现有的检测原料乳体细胞数的方法存在耗时长、操作繁琐、且需要专业的技术人员进行操作、成本高、及不够准确的问题。因此，研发出一种新的生牛乳体细胞检测方法或仪器仍是本领域亟待解决的问题之一。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种生牛乳体细胞检测试纸及其制备方法。该试纸在使用时操作简便，能够经济、准确地用于奶牛乳房炎的日常监测，以及生牛乳体细胞指标日常检测。为达上述目的，本发明提供一种生牛乳体细胞检测试纸的制备方法，其包括以下步骤第一次浸泡将滤纸在表面活性剂溶液中浸泡Ι-lOmin,然后在缓冲液中浸泡1-1Omin ；第一次烘干；第二次浸泡将第一次烘干后的滤纸在第二次浸泡液中浸泡l_5min ；第二次烘干，得到所述生牛乳体细胞检测试纸。在上述制备方法中，第一次浸泡所采用的表面活性剂溶液和缓冲液的用量，以及第二次浸泡所采用的第二次浸泡液的用量为使滤纸全部浸泡在其中即可。在上述制备方法中，优选地，所述表面活性剂溶液包括Tween-20溶液、Tween-80溶液、Triton X-100溶液和EDTA溶液中的一种或几种的组合。上述的表面活性剂溶液均为本领域常规使用的表面活性剂溶液，其溶剂可以均为PBS，其浓度可以为常规使用的浓度。将滤纸浸泡于表面活性剂溶液中，表面活性剂起到增溶、增敏的作用，能够使第二次浸泡液的有效成分在滤纸中均匀分布。更优选地，所述表面活性剂溶液为EDTA溶液；最优选地，所述EDTA溶液的浓度为O. 05-0. 2重量％。在上述制备方法中，优选地，所述缓冲液包括Tris-盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼砂-盐酸缓冲液和巴比妥钠-盐酸缓冲液中的一种或几种的组合。由于第二次浸泡液与生牛乳反应的PH条件为pH = 7. 0-8. 5，将滤纸浸泡于缓冲液中，起到调节滤纸pH的作用。更优选地，所述缓冲液为Tris-盐酸缓冲液；最优选地，所述Tris-盐酸缓冲液的浓度为 O. 05-0. 2mol/L。在上述制备方法中，优选地，所述第二次浸泡液是通过以下步骤制备的将1-氨基-2-萘酚-4-磺酸溶于水并搅拌为糊状，形成1-氨基-2-萘酚-4-磺酸糊状液，然后冷却至2-re，向所述1-氨基-2-萘酚-4-磺酸糊状液中加入CuSO4饱和溶液，形成1-氨基-2-萘酚-4-磺酸混合溶液；将亚硝酸钠溶于水中，形成亚硝酸钠溶液；以亚硝酸钠溶液1-氨基-2-萘酚-4-磺酸混合溶液=I 4-1 11的质量比，在3-5°C搅拌条件下，将所述亚硝酸钠溶液滴加到所述1-氨基-2-萘酚-4-磺酸混合溶液中，5-10min后滴加完毕，之后在3_5°C搅拌20_60min，形成第二次浸泡液的粗产物，经过滤后，得到所述第二次浸泡液。在上述制备方法中，优选地，将所述1-氨基-2-萘酚-4-磺酸混合溶液与过量浓盐酸混合，然后以亚硝酸钠溶液1-氨基-2-萘酚-4-磺酸混合溶液=I 4-1 11的质量比，在3-5°C搅拌条件下，将亚硝酸钠溶液滴加到1-氨基-2-萘酚-4-磺酸混合溶液与浓盐酸中，5-10min后滴加完毕，之后在3_5°C搅拌20_60min，形成第二次浸泡液的粗产物，进行过滤(可以采用滤纸)，滤掉沉淀后，用稀盐酸对滤液进行洗涤，得到所述第二次浸泡液。其中，浓盐酸的作用是使反应在无机酸存在的条件下进行，并且起到溶解反应生成的亚硝酸的作用，使亚硝酸为新生态的亚硝酸，而非游离态的亚硝酸(不稳定)。此外，在形成第二次浸泡液的粗产物后继续在浓盐酸中进行搅拌反应，并且过滤后用稀盐酸进行洗涤，能够使反应更加充分。本领域技术人员能够根据实际情况，对上述浓盐酸及稀盐酸的使用量进行调控。优选地，浓盐酸1-氨基-2-萘酚-4-磺酸的摩尔比=2.5-4 I;稀盐酸过滤后的第二次浸泡液的粗产物滤液的体积比=1:4-1: 20。在上述制备方法中，优选地，以重量比计，所述1-氨基-2-萘酚-4-磺酸水=1-3 6-18。在上述制备方法中，优选地，以所述1-氨基-2-萘酚-4-磺酸糊状液的总重量计，所述CuSO4饱和溶液的添加量为I % -3%。在上述制备方法中，优选地，以重量比计，所述亚硝酸钠水=3-10 6-18。在上述制备方法中，优选地，所述制备方法还包括以下步骤将滤纸在硫酸铜干燥皿中放置20-40min进行预处理。在滤纸进行第一次浸泡前,将其进行干燥预处理，去除滤纸中的水分，能够保证第一次及第二次浸泡后的试纸中浸泡液的浓度一致。在上述制备方法中，优选地，所述第一次烘干在50-90°C下进行；所述第二次烘干在50-70°C下进行。在本发明的制备方法中，可以根据具体的情况和需求，将制备得到的试纸剪切为任意尺寸；优选地，将其剪裁为尺寸20 X IOOmm的试纸条，以便检测。本发明还提供一种生牛乳体细胞检测试纸，其是由上述的生牛乳体细胞检测试纸的制备方法所制备得到的。本发明的试纸的使用方法为将适量生牛乳样品滴加于试纸上，静置5分钟观察试纸颜色变化，然后通过与比色卡进行对比，进行生牛乳体细胞指标的评价。在上述的检测方法中，所述比色卡为本发明自制的比色卡，其制备方法如下所述选取分娩30天内的奶牛的体细胞数较高的生牛乳，以生牛乳UHT乳=I 1、1: 2、1 : 3、1 4、1 5、1 6、1 7、1 8、1 9、1 10、1 14、1 19 的质量比，将该生牛乳用UHT乳进行稀释后，混合均匀，制备得到样品。分别取O. 5-lmL样品滴在本发明的试纸上，分别于静置lmin、5min、IOmin之后记录颜色变化。同时，采用显微镜直接计数法(NY/T800-2004)分别检测样品的体细胞数。本发明的试纸检测结果与显微镜直接计数法的检测结果如表I所示。表I
权利要求
1.一种生牛乳体细胞检测试纸的制备方法，其包括以下步骤 第一次浸泡将滤纸在表面活性剂溶液中浸泡Ι-lOmin，然后在缓冲液中浸泡1-1Omin ； 第一次烘干； 第二次浸泡将第一次烘干后的滤纸在第二次浸泡液中浸泡l_5min ； 第二次烘干，得到所述生牛乳体细胞检测试纸。
2.如权利要求1所述的制备方法，其中，所述表面活性剂溶液包括Tween-20溶液、Tween-80溶液、Triton X-100溶液和EDTA溶液中的一种或几种的组合；优选地，所述表面活性剂溶液为EDTA溶液；更优选地，所述EDTA溶液的浓度为O. 05-0. 2重量％。
3.如权利要求2所述的制备方法，其中，所述缓冲液包括Tris-盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼砂-盐酸缓冲液和巴比妥钠-盐酸缓冲液中的一种或几种的组合；优选地，所述缓冲液为Tris-盐酸缓冲液；更优选地，所述Tris-盐酸缓冲液的浓度为O. 05-0. 2mol/L。
4.如权利要求1-3任一项所述的制备方法，其中，所述第二次浸泡液是通过以下步骤制备的 将1-氨基-2-萘酚-4-磺酸溶于水并搅拌为糊状，形成1-氨基-2-萘酚-4-磺酸糊状液，然后冷却至2-rC，向所述1-氨基-2-萘酚-4-磺酸糊状液中加入CuSO4饱和溶液，形成1-氨基-2-萘酚-4-磺酸混合溶液； 将亚硝酸钠溶于水中，形成亚硝酸钠溶液； 以亚硝酸钠溶液1-氨基-2-萘酚-4-磺酸混合溶液=I 4-1 11的质量比，在3_5°C搅拌条件下，将所述亚硝酸钠溶液滴加到所述1-氨基-2-萘酚-4-磺酸混合溶液中，5-10min后滴加完毕，之后在3_5°C搅拌20_60min，形成第二次浸泡液的粗产物，经过滤后，得到所述第二次浸泡液。
5.如权利要求4所述的制备方法，其中，以重量比计，所述1-氨基-2-萘酚-4-磺酸水=1-3 6-18。
6.如权利要求4或5所述的制备方法，其中，以所述1-氨基-2-萘酚-4-磺酸糊状液的总重量计，所述CuSO4饱和溶液的添加量为I % -3%。
7.如权利要求4-6任一项所述的制备方法，其中，以重量比计，所述亚硝酸钠水=3-10 6-18。
8.如权利要求1-7任一项所述的制备方法，其中，所述制备方法还包括以下步骤将滤纸在硫酸铜干燥皿中放置20-40min进行预处理。
9.如权利要求1-8任一项所述的制备方法，其中，所述第一次烘干在50-90°C下进行；所述第二次烘干在50-70°C下进行。
10.一种生牛乳体细胞检测试纸,其是由权利要求1-9任一项所述的生牛乳体细胞检测试纸的制备方法所制备得到的。
全文摘要
本发明涉及一种生牛乳体细胞检测试纸及其制备方法。该制备方法包括以下步骤第一次浸泡将滤纸在表面活性剂溶液中浸泡1-10min，然后在缓冲液中浸泡1-10min；第一次烘干；第二次浸泡将第一次烘干后的滤纸在第二次浸泡液中浸泡1-5min；第二次烘干，得到所述生牛乳体细胞检测试纸。本发明的生牛乳体细胞检测试纸在使用时操作简便，能够经济、准确地用于奶牛乳房炎的日常监测，以及生牛乳体细胞指标日常检测。
文档编号G01N21/78GK103063662SQ201210560818
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月21日 优先权日2012年12月21日
发明者富鑫 申请人:内蒙古伊利实业集团股份有限公司