东江白头翁体细胞胚胎发生与植株再生方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及东江白头翁体细胞胚胎发生与植株再生方法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002]东江白头翁(Pulsatillatongkangensis Y.N.Lee&T.C.Lee)是生长于韩国江原道宁越郡和旌善郡的部分悬崖缝隙的多年生草本植物，属毛茛科，是白头翁的一个新物种。相对于朝鲜白头翁，东江白头翁具有较大的叶，较短的叶柄和花柄，并且花柄直立生长不弯曲，开花朝天。大部分东江白头翁花以深紫色为主，但也有浅紫、藕荷、浅粉、紫红和米白色等多种，因此有巨大的观赏价值。因东江白头翁生长限在高山区域石灰岩地带，对生长环境条件的要求较特殊，所以这个物种的自然蔓延受到限制。因此，韩国森林厅将东江白头翁作为珍稀物种指定为V级保护植物。
[0003]东江白头翁主要依靠种子繁殖，但种子成熟后，若不及时播种，很快就会丧失活力，野外生长条件苛刻，自然繁殖和生长缓慢，野生东江白头翁资源非常稀少，现已濒临灭绝。目前，东江白头翁仍处于野生状态，人工播种栽培量极少，而且移栽困难，成活率较低；此外，东江白头翁是一种珍稀观赏植物，市场需求量大。利益驱使人们盲目挖掘，乱挖乱采，以及生存环境的破坏、盲目开发、开山凿石，导致东江白头翁资源日渐稀少，濒临灭绝，遗传资源面临枯竭。自2007年，韩国部分地方自治团体和民间环境团体拟采用增殖、移栽方法保护种质资源。因此，研宄分析体细胞胚诱导的具体过程，应用组织培养技术缓解这一状况成为迫切需要。
【发明内容】
[0004]本发明的目的之一是提供一种东江白头翁体细胞胚胎发生与植株再生的方法，该方法以东江白头翁的叶片为外植体，筛选出合适的吲哚乙酸(IAA)和玉米素(ZA)的浓度以诱导东江白头翁体细胞胚发生。本发明技术方案的原理为:植物组织培养方法可以在短期内使植物繁殖，不仅繁殖速度快，且因为是无性繁殖可以保持与母株的一致的遗传性状。通过组织培养获得再生植株包括器官分化的再生和体细胞胚发生的植株再生途径。通过体细胞胚发生繁殖是指在体外从小部分植物组织或者个体细胞中产生胚的方法。体细胞胚在来源上是克隆的，因此用体细胞胚增殖可以具有非常高的无性增加速率的潜力，并因此有显著商业价值。经体细胞胚发生的再生是植物组织培养的有吸引力的选择。通过体细胞胚胎发生途径的植株再生比器官分化更稳定。使用体细胞胚再生系统的另一个优势是单细胞来源，因此再生植株的遗传性状较稳定。该技术为东江白头翁大规模无性繁殖提供重要的技术支持，是种质资源保存和保护的一条有效途径。
[0005]一种东江白头翁体细胞胚胎发生与植株再生方法，其特征在于，包含以下步骤:
[0006]将东江白头翁叶片用自来水冲洗2?4h，然后用洗衣粉仔细洗涤，再用无菌水冲洗；
[0007]在超净工作台上，将上述叶片用添加有0.1% Tween-20的1:3的含L 13-1.53%的次氯酸钠的84消毒液中浸泡15min，后用无菌蒸馏水清洗3?5次，用消毒过的滤纸吸干表面水分；
[0008]经消毒处理的叶片切割成块状，用解剖刀片均匀割划3刀，不切断叶片，接种到胚性愈伤组织诱导培养基上进行培养，培养期为9周；
[0009]将在诱导培养基上诱导过的胚性愈伤组织转接到新的诱导培养基时，促进了体细胞胚的萌发、成熟并形成小植株，新培养基成分与上述诱导培养基相同。
[0010]上述诱导培养基为:MS培养基(Murashigi和skoog 1962)中添加0.05mg/L 口引哚乙酸(IAA)和0.5mg/L的玉米素(ZT)，蔗糖30g/L，琼脂8.0g/L，并用104kPa大气压下121°C高压蒸汽灭菌20min的0.lmol/L的NaOH或HCl调至pH为5.8。
[0011]上述培养的培养条件为:25± 1°C、16h.d 1光培养，光照强度4000 μmol.m 2.s下培养。
[0012]本发明的有益效果在于:提供一种东江白头翁体细胞胚胎发生与植物再生的方法，该方法采用植物组织培养方法，不仅繁殖速度快，而且遗传性状一致，同时该方法使植株再生比器官分化更加稳定，为东江白头翁大规模无性繁殖提供了重要技术支持，是种质资源保存和保护的一条有效途径。
【附图说明】
[0013]图1所示为本发明体细胞胚诱导过程的形态变化；
[0014]图2所示为本发明体细胞胚发生过程的组织解剖结构。
【具体实施方式】
[0015]下文将结合具体实施例详细描述本发明的内容。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。
[0016]实施例1
[0017]1、材料准备
[0018]材料为野生东江白头翁，外植体为幼嫩的叶片。
[0019]2、植物材料的表面消毒
[0020]将野外采集的东江白头翁叶片在自来水中冲洗2?4h，然后用洗衣粉仔细洗涤，清洗叶片上的灰尘或微生物等物质，然后用无菌水冲洗，再移到超净工作台上进行下一步操作。在添加有0.1% Tween-20的1:3的84消毒液(含1.13-1.53%的次氯酸钠)中浸泡15min，后用无菌蒸馏水洗3?5次，用消毒过的滤纸吸干表面水分到外植体表面没有水珠为止，备用。
[0021]3、胚性愈伤组织和体细胞胚诱导
[0022]经消毒处理的叶片切割成面积为0.5cmX0.5cm的块状，用解剖刀片匀割划3刀，不切断叶片，接种到胚性愈伤组织诱导培养基上。诱导培养基为:MS培养基(Murashigi和skoog 1962)添加0.05mg/L吲哚乙酸(IAA)和0.5mg/L的玉米素(ZT)，蔗糖30g/L，琼脂8.0g/L，用在104kPa大气压强下121 °C高压蒸汽灭菌20min的0.lmol/L的NaOH或HCl调至pH为5.8。培养条件为:25± 10C、16h.(Γ1光培养，光照强度4000 μ mol.m _2.s下培养。每处理接种10?15个外植体，试验重复3次。定期观察，培养期间为9周。
[0023]4、体细胞胚的萌发、成苗
[0024]将在诱导培养基上诱导过的胚性愈伤组织转接到新的诱导培养基时，促进了体细胞胚的萌发、成熟并形成小植株，新培养基成分与上述诱导培养基相同。
[0025]5、组织解剖学观察
[0026]体细胞胚发育用组织解剖学方法检测。培养2周、4周、5周的体细胞胚用FAA (福尔马林:冰醋酸:乙醇，5: 5: 90 ；v/v)在4°C下固定24h，冲洗后，用梯度乙醇(15%，30%,45%,60%,75%,95% )脱水置换各90min，用95 %酒精置换时过夜，纯酒精需换液一次，等量纯酒精和二甲苯混合液半小时，纯二甲苯(换液一次)半小时；65°C石蜡(McCor-mick, USA)