专利名称：一种tmb显色液及其制备方法
—种TMB显色液及其制备方法技术领域
本发明是一种TMB显色液及其制备方法，属于生物体外诊断试剂技术领域。
背景技术：
酶联免疫吸附(ELISA)检测方法由于具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点， 已被广泛应用于抗原、抗体、细胞因子以及生化物质等的检测。酶联免疫吸附(ELISA)检测 方法有很多种，但各种方法都离不开酶结合物和显色剂。在ELISA试剂中应用最广泛的酶 是辣根过氧化物酶(HRP)，HRP的底物是过氧化物，如过氧化氢，而该系统的显色剂有多种， 目前最常用的是3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺(TMB)。
TMB,即3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺，是辣根过氧化物酶的常用底物。检测时，HRP 催化过氧化物释放出氧，无色的TMB被氧化成蓝色的产物，蓝色产物通常可以在370nm或 620-650nm测定吸光度；加入酸性的终止液终止反应后，蓝色溶液变成橙黄色，在450nm波 长有最大吸收峰。通过测量吸光度，便可定性或定量判断出被检测物的含量。相对于其他显 色剂来讲，TMB以显色高效、无毒、不致癌、稳定性好等特点成为ELISA检测的主流显色剂。
通常的TMB显色试剂由多个组份组成，必须在使用前进行配制，并且容易产生沉 淀，使用相对不太方便，并且也容易导致检测结果不太稳定。某些厂家的生产的TMB显色试 剂通常分为A、B两种贮存液，使用前将A液和B液按比例混合，这样操作繁琐且容易发生错 配，造成实验失败。另外有些厂家也生产单相TMB显色液，但是存在溶解度低，稳定性差，保 存时间短，灵敏度不闻，显色背景闻等的缺点。
如中国专利，专利号为200610028624X名称为《酶联免疫体外诊断试剂中显色剂 的制备》中公开的一种TMB显色液制备方法，用该法最终得到的试剂稳定性不高，2 8度 只能保存15月左右，显色背景也比较高。发明内容
本发明的目的在于提供一种稳定性高、保存时间长、显色背景低的TMB显色液及 其制备方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是该TMB显色液由A液和B液等体积 混合后得到，所述A液各组分的摩尔浓度为柠檬酸O. 01-0. 5 mol/L，磷酸氢二钠O. 01-0. 5 mol/L,过氧化氢O. 01-0. 5mol/L, EDTAO. 1-lmmol/L ;所述B液包括TMB、HCl和聚乙烯吡咯 烷酮，所述TMB的摩尔浓度为O. 1-lmmol/L，所述HCl的摩尔浓度为O. 01-0. 5mol/L，所述聚 乙烯吡咯烷酮的质量分数为O. 1-10%。
作为优选，所述A液各组分的摩尔浓度为柠檬酸O. 5mol/L,磷酸氢二钠O. 5mol/ L,过氧化氢O. 5mol/L, EDTA lmmol/L ;所述B液包括TMB、HC1和聚乙烯吡咯烷酮，所述TMB 的摩尔浓度为lmmol/L，所述HCl的摩尔浓度为O. 5mol/L，所述聚乙烯吡咯烷酮的质量分 数为10% ο
本发明所述TMB显色液的制备方法包括以下步骤a、配制A液使柠檬酸的终摩尔浓度为O. 01-0. 5mol/L，磷酸氢二钠的终摩尔浓度为O. 01-0. 5mol/L,过氧化氢的终摩尔浓度为O. 01-0. 5mol/L, EDTA的终摩尔浓度为 O. Ι-lmmol/L ;搅拌均匀，充分溶解；b、配制B液使TMB的终摩尔浓度为O. 1-lmmol/L，HCl的终摩尔浓度为 O. 01-0. 5mol/L，聚乙烯吡咯烷酮的终质量分数为O. 1-10% ;搅拌均匀，充分溶解；C、最后将A液和B液等体积混合后，调整pH值在3. 8-4. 2之间，得到TMB显色液粗液；d、将TMB显色液粗液用O. 22um微孔滤膜抽滤，得到所述TMB显色液。
本发明与现有技术相比具有以下优点1、把所有组分全部配制在一个溶液中，仅由单一溶液组成，简化ELISA实验的操作步骤，降低实验中可能发生的随机误差。
2、本产品调整了 TMB的溶解体系，增加TMB的溶解度，加入稳定剂聚乙烯吡咯烷酮，使单相TMB溶液能够长期稳定保存，在2 8度保存温度下，能保存2年。
3、信噪比高，提高了检测的灵敏度。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。
实施例1 :TMB显色液的制备a、配制A液在IL水中加入柠檬酸O.5mol，磷酸氢二钠O. 5mol，过氧化氢O. 5mol,EDTA Immol,搅拌均匀，充分溶解；b、配制B液在IL水中加入TMBlmmol，HC10.5mol，再加入终质量浓度为10%的聚乙烯吡咯烷酮；搅拌均匀，充分溶解；C、最后将A液和B液等体积混合后，调整pH=4. 0，得到TMB显色液粗液； d、将TMB显色液粗液用O. 22um微孔滤膜抽滤，得到所述TMB显色液。
实施例2 :将用实施例1的方法制备的TMB显色液与丹麦Kem-En-Tec Diagnostics公司商品化的TMB ONE显色液进行比较。
以Human IL-17A双抗体夹心法ELISA为例，显色15min，测得OD值(λ =450nm)如下表I
权利要求
1.一种TMB显色液，其特征在于由A液和B液等体积混合后得到，所述A液各组分的摩尔浓度为柠檬酸O. 01-0. 5 mol/L，磷酸氢二钠O. 01-0. 5 mol/L，过氧化氢 O. 01-0. 5mol/L,EDTA0. 1-lmmol/L ;所述B液包括TMB、HCl和聚乙烯吡咯烷酮，所述TMB的摩尔浓度为O. 1-lmmol/L，所述HCl的摩尔浓度为O. 01-0. 5mol/L，所述聚乙烯吡咯烷酮的质量分数为O. 1-10%。
2.根据权利要求1所述的TMB显色液，其特征在于所述A液各组分的摩尔浓度为 朽1檬酸O. 5mol/L,磷酸氢二钠O. 5mol/L,过氧化氢O. 5mol/L, EDTA lmmol/L ;所述B液包括TMB、HCl和聚乙烯吡咯烷酮，所述TMB的摩尔浓度为lmmol/L，所述HCl的摩尔浓度为 O. 5mol/L,所述聚乙烯吡咯烧酮的质量分数为10%。
3.一种用于权利要求1所述TMB显色液的制备方法包括以下步骤a、配制A液使柠檬酸的终摩尔浓度为0.01-0.5mol/L，磷酸氢二钠的终摩尔浓度为O. 01-0. 5mol/L,过氧化氢的终摩尔浓度为O. 01-0. 5mol/L, EDTA的终摩尔浓度为O.Ι-lmmol/L ;搅拌均匀，充分溶解；b、配制B液使TMB的终摩尔浓度为O.l-lmmol/L，HCl的终摩尔浓度为O. 01-0. 5mol/ L，聚乙烯吡咯烷酮的终质量分数为O. 1-10% ;搅拌均匀，充分溶解；C、最后将A液和B液等体积混合后，调整pH值在3. 8-4. 2之间，得到TMB显色液粗液;d、将TMB显色液粗液用O. 22um微孔滤膜抽滤，得到所述TMB显色液。
全文摘要
本发明是一种TMB显色液及其制备方法，属于生物体外诊断试剂技术领域，由A液和B液等体积混合后得到，所述A液各组分的摩尔浓度为柠檬酸0.01-0.5mol/L，磷酸氢二钠0.01-0.5mol/L，过氧化氢0.01-0.5mol/L，EDTA0.1-1mmol/L；所述B液包括TMB、HCl和聚乙烯吡咯烷酮，所述TMB的摩尔浓度为0.1-1mmol/L，所述HCl的摩尔浓度为0.01-0.5mol/L，所述聚乙烯吡咯烷酮的质量分数为0.1-10%。本发明调整了TMB的溶解体系，增加TMB的溶解度，聚乙烯吡咯烷酮，使单相TMB溶液在2～8度保存温度下，能保存2年。
文档编号G01N21/78GK103063661SQ201210560589
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月21日 优先权日2012年12月21日
发明者袁志波 申请人:杭州茂天赛科技有限公司