一种单组份tmb显色液及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物体外诊断试剂，特别是设及一种单组份TMB显色液及其制备方 法。
【背景技术】
[0002] 酶联免疫检测方法巧LISA)具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，成为蛋白 质检测领域主流技术之一。W化ISA间接法为例，其主要的工作原理为：抗原包被酶标板， 形成固相载体。如果样本中存在相应的IgG抗体，该抗体与酶标板上固定的抗原相结合， 从而形成抗原-IgG抗体的免疫复合物，其余未结合成分经洗涂被除去。加入辣根过氧化 物酶（HR巧标记的抗人IgG抗体进行第二步解育，与上述免疫复合物相结合形成新的免 疫复合物抗原-IgG抗体-抗人IgG-HRP，经洗涂除去未结合成分后加入TMB底物液进行 显色反应，该反应产生蓝色物质，加入终止液终止显色反应，溶液从蓝色变为黄色，颜色强 度与抗体含量成正比。检测过程中，用酶标仪在450nm/630nm波长进行读数，记录结果； 根据所测得的吸光度值数据，与对照品进行比较，从而判断待测样品中抗体的水平。其中 TMB(3, 3'，5, 5'TetramethylBenzidine,即 3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺）W其高效、无毒、 不致癌、稳定性佳等特点，为化ISA检测中最常用的显色底物。
[0003] 目前国内上市的酶联免疫法试剂盒多采用双组份TMB显色底物，即分A液和B液， 使用之前等体积混匀，由于TMB与过氧化物分开两瓶，具体有稳定、灵敏的特点。然而使用 多年后，缺点逐渐显露：操作时多加一种溶液，既耗费时间，又增加出错率；需要多一个试 剂瓶，增加成本，造成资源浪费；混合过程容易产生不均匀，批间质量差别较大，从而影响检 测结果。目前国外同类产品多采用单组份TMB显色底物，然而其售价昂贵，难W采用进口原 料来进行试剂盒产业化。
[0004] TMB-2肥1 (3, 3'，5, 5'-四甲基联苯胺二盐酸）形式虽然可溶于水，甚至达到1%的 浓度，很容易就可根据试剂需要配制成浓度较高的溶液，然而所获得的溶液容易产品分层 和沉淀。因此在实际应用中更多时候是使用3, 3'，5, 5' 一四甲基联苯胺（TMB)。由于TMB 一般不易溶于水，易溶于有机溶剂。所W在TMB显色液配制时，常用有机溶剂帮助溶解，如 最常用的二甲基亚抓值MS0)、乙醇，化及二甲基甲献胺值MF)、甲醇、丙酬等。运类有机溶剂 多易挥发、易被人体吸收等特点，多为蛋白变性剂，有潜在的神经毒性或致癌性等危害。在 提倡健康和环保的今天，有机溶剂的大量使用，可能给操作者带来健康威胁，也将给环境带 来不可估量的损害。近年来，更多的研究在于非有机溶剂的TMB溶液体系。 阳〇化]表1示出了现有技术中各种TMB显色液的组成W及TMB终浓度和过氧化氨的终 浓度，其中申请号为201210560589. 1的发明专利申请描述了一种单组份TMB显色液的制 备方法："其中由A液和B液等体积混合后得到，所述A液各组分的摩尔浓度为：巧樣酸 0. 01-0. 5mol/l，憐酸氨二钢 0. 01-0. 5mol/l，过氧化氨 0. 01-0. 5mol/l，邸14 0. 1-lmmol/ L;所述B液包括TMB、肥1和聚乙締化咯烧酬，所述TMB的摩尔浓度为0. 1-lmmol/L，所述 肥1的摩尔浓度为0. 01-0. 5mol/l，所述聚乙締化咯烧酬的质量分数为0. 1-10%。本发明调 整了TMB的溶解体系，增加TMB的溶解度，聚乙締化咯烧酬，使单相TMB溶液在2~8度保 存溫度下，能保存2年。"
[0006] 表1中申请号为201210560589. 1发明专利有如下特点：（1)对重要成份聚乙締化 咯烧酬（polyvinylpyrrolidone，简称PVP)的分子量等重要参数描述不详尽。聚乙締化 咯烧酬，相对分子质量从数千至一百万W上的均聚物、共聚物和交联聚合物系列产品，并W 其优异独特的性能获得广泛应用。PVP按其平均分子量大小分为四级，习惯上常WK值表 示，不同的K值分别代表相应的PVP平均分子量范围。K值实际上是与PVP水溶液的相对 粘度有关的特征值，而粘度又是与高聚物分子量有关的物理量，因此可W用K值来表征PVP 的平均分子量。通常K值越大，其粘度越大，粘接性越强。不同的分子量的性质各异，溶解 度各不同，如不详细规定，难W精确重复实验。（2)实施例1中，B液中过氧化氨浓度最高达 0. 5111〇1/1，终浓度为0. 25111〇1/1，运大大超过目前所有相关专利或产品中的相关描述（见表 1)，超过一般认可的"1-lOmM"。过氧化氨浓度一般与TMB含量对应，过多量则引起本底极大 的提高，导致产品不稳定。
[0007] 表 1
【发明内容】
[0009] 本发明要解决的技术问题是提供稳定性高、保存时间长、环保型的单组份TMB显 色液，本发明还提供了所述单组份TMB显色液的制备方法。
[0010] 本发明提供了一种单组份TMB显色液，其由A液和B液混合而成；所述A液是由过 氧化脈溶于巧樣酸-巧樣酸钢缓冲液制备而成；所述B液是由聚乙締醇、聚乙締化咯烧酬、 TMB和甘油溶于巧樣酸-巧樣酸钢缓冲液制备而成。
[0011] 所述过氧化脈在A液中的浓度为2-20mmol/L。 阳012] 所述聚乙締醇在B液中的质量体积比为0. 4-1. 0%，所述聚乙締化咯烧酬在B液中 的质量体积比为5-10 %，所述TMB在B液中的质量体积比为0. 04-0. 1 %，所述甘油在B液 中的体积比1-2%。
[0013] 所述巧樣酸-巧樣酸钢缓冲液的浓度为0.Imol/L。
[0014] 所述A液和B液W1:1的体积比混合而成。
[0015] 本发明还提供了所述的单组份TMB显色液的制备方法，包括如下步骤：
[0016] (1)A液：取巧樣酸-巧樣酸钢缓冲液，加入过氧化脈，揽拌使之充分溶解，W巧樣 酸-巧樣酸钢缓冲液定容，避光密封暂存。
[0017] (2)B液：称取聚乙締醇，边揽拌边将其加入巧樣酸-巧樣酸钢缓冲液中，将其溶解 直到溶液不再含有微小颗粒；加入聚乙締化咯烧酬，使之充分溶解；降至室溫后，加入TMB， 揽拌使充分溶解；最后，加入甘油，揽拌使之充分溶解；W巧樣酸-巧樣酸钢缓冲液定容。 阳〇1引 （3)将A液和B液混合均匀。
[0019] (4)过滤获得均一的溶液，即为单组份TMB显色液。
[0020] 所述巧樣酸-巧樣酸钢缓冲液的浓度为0.Imol/L，抑为3. 5-3. 8。
[0021] 所述过氧化脈在A液中的浓度为2-20mmol/L。
[0022] 所述聚乙締醇在B液中的质量体积比为0. 4-1. 0%，所述聚乙締化咯烧酬在B液中 的质量体积比为5-10 %，所述TMB在B液中的质量体积比为0. 04-0. 1 %，所述甘油在B液 中的体积比1-2%。
[0023] 所述步骤（3)中的A液和B液是W1:1的体积比混合而成，所述步骤（4)中的过 滤是采用孔径20-60ym的滤纸。
[0024] 本发明相比现有技术具有如下优势：
[00巧]1、本发明的单组份TMB显色液采用巧樣酸-巧樣酸钢缓冲体系，可维持较低的酸 性环境（pH3. 5-3. 8)，促进TMB的溶解；巧樣酸钢可馨合二价离子，消除溶液中离子的干扰， 可维持显色底物在溶液中的稳定性。
[00%] 2、本发明的单组份TMB显色液采用非有机溶剂体系，可保护操作者远离有机溶剂 的危害，并减少对环境的损害。
[0027] 3、引入安全的聚乙締醇及聚乙締化咯烧酬助溶TMB，使本发明的单组份TMB显色 液形成稳定的水溶液体系。
[002引 4.采用稳定的过氧化脈作为氧化物，在聚乙締醇及聚乙締化咯烧酬共同作用下， 使本发明的单组份TMB显色液更加稳定。
[0029] 5.甘油在冷藏环境具有一定的抗冻效果，配合其它组分使用可W使本发明的单组 份TMB显色液在2-8 °C保存24个月。
【具体实施方式】
[0030] 本发明提供了一种单组份TMB显色液，由A液和B液W1:1的体积比混合而成。
[0031] 所述A液是由过氧化脈溶于巧樣酸-巧樣酸钢缓冲液制备而成；
[0032] 所述B液是由聚乙締醇、聚乙締化咯烧酬、TMB和甘油溶于巧樣酸-巧樣酸钢缓冲 液制备而成。
[0033] 优选的，所述过氧化脈占A液的浓度为2-20mmol/l，所述巧樣酸-巧樣酸钢缓冲液 的浓度为0.Imol/L。
[0034] 优选的，所述聚乙締醇占B液的质量体积比（w/v)为0. 4-1.0%，所述聚乙締化 咯烧酬占B液的质量体积比（w/v)为5-10 %，所述TMB占B液的质量体积比（w/v)为 0. 04-0. 1 %，所述甘油占B液的体积比（v/v) 1-2%，所述巧樣酸-巧樣酸钢缓冲液的浓度为 0.Imol/L。
[0035] 所述巧樣酸-巧樣酸钢缓冲液的浓度为为0.Imol/L，抑为3. 5-3. 8,是一种低抑 缓冲体系，巧樣酸钢是一种馨合剂，可W增加显色底物的稳定性，使显色底物的保存期延 长。本发明单组份显色底物的制备采用低抑缓冲体系，再配合其它助溶剂聚乙締醇和聚乙 締化咯烧酬一起使用，更容易形成稳定的体系。
[0036] 本发明采用聚乙締醇（PVA)和聚乙締化咯烧酬（PV巧作为助溶剂。
[0037] 所述聚乙締醇是一种高分子聚合物，不溶于丙酬、醋酸乙醋、甲醇、乙二醇等有机 溶剂，微溶于二甲基亚讽，聚乙締醇含有许多醇基，具有极性，且可与水形成氨键，故溶于 水；同时其又是一种极安全的高分子有机物，对人体无毒，无副作用，具有良好的生物相容 性，也可用作稳定剂、分散剂、乳化剂等。本发明在配方中加入了聚乙締醇，可帮助TMB的 溶解和稳定存在，且安全可靠；本发明优选采用聚乙締醇1788,1788表示聚合度为1700,醇 解度为88%，运样就更易溶解、粘度性中且成本低。为了完全溶解PVA1788 -般需加热到 65-75°C，一般配制不超过5-8% (m/v)，浓度过高容易胶化。
[0038] 所述聚乙締化咯烧酬（PV巧是一种水溶性聚酷胺，PVP溶于水、含氯溶剂、乙 醇、胺、硝基烧控W及低分子脂肪酸，与大多数无机盐和多种树脂相溶，不溶于丙酬、乙酸 等；PVP不易发生化学反应，在正常条件下胆存，干燥的PVP是很稳定的；PVP具有优良的 生理惰性和生物相容性，对皮肤、眼睛无刺激，无过敏反应，无毒。本发明采用PVP作助 溶剂，可帮助TMB溶解，同时使之稳定存在，且安全无毒。本发明优选采用聚乙締化咯烧 酬K-30,其在水中的溶解度可达Ig/ml，醇解度为87. 0-89. 0% (mol/mol)、平均分子量为 45, 000-58, 000,其更易获得和易溶解。
[0039] 本发明的显色底物TMB适用于W过氧化物为酶促反应底物的显色系统中。其中所 述的过氧化物为1-lOmM的过氧化脈（也称过氧化尿素，下同），较过氧化氨稳定，W此类物 质为底物的酶为辣根过氧化酶（HRP)。
[0040] 所述甘油与其它组分配合使用，可增加冷藏条件下的稳定性。
[0041] 本发明还提供了上述单组份TMB显色液的制备方法，包括如下步骤：
[0042] (1)A液：取900ml巧樣