一种胰高血糖素检测试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于膜高血糖素检测领域，尤其设及一种膜高血糖素检测试剂盒及其检测 方法。
【背景技术】
[0002] 糖尿病是一组W慢性血糖水平增高为特征的代谢异常综合征，膜岛素和膜高血糖 素对于维持适当的血糖水平很重要。膜岛素通过增加葡萄糖外周摄取和减少自肝脏输出的 葡萄糖W降低血糖水平而作用肝脏和外周组织，与此同时，膜高血糖素通过与肝细胞上的 膜高血糖素受体结合，引起肝糖原分解而释放W糖原形式胆藏的葡萄糖，从而帮助维持血 液中的葡萄糖水平。随着运些胆藏被耗尽，膜高血糖素刺激肝脏通过糖异生合成额外的葡 萄糖。该葡萄糖释放到血流中，阻止低血糖的发生。
[0003] 膜高血糖素在临床上具有重要作用，研究已证实膜高血糖素能够促进肝细胞内环 憐腺巧（C-AM巧的生物合成，评价肝硬化患者的肝脏储备功能；促进糖原分解和糖异生，升 高血糖，治疗低血糖；抑制胃肠蠕动，用于胃肠造影及内镜下膜胆管造影；激活腺巧酸环化 酶，增强屯、肌收缩力，治疗难治性屯、衰；评价糖尿病患者膜岛P细胞功能等临床意义。
[0004] 近年来，多个制药公司致力于膜高血糖素类似物的研制，有的在进行临床试验，有 的已经完成了临床试验进入市场，表明膜高血糖素在不久的将来必定成为糖尿病、屯、血管 等疾病的常用治疗药物之一。 阳〇化]准确地监测膜高血糖素含量变化对于评价膜岛P细胞、血糖控制及相关代谢疾 病的治疗是必不可少的前提。但目前，在国内定量检测患者血液中膜高血糖素含量的化ISA 试剂盒尚未见报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的之一是提供一种膜高血糖素检测试剂盒，该试剂盒配方简单、使用 方便，可在临床试验中于室溫条件下灵敏、快速、准确地测定血液和血浆中的膜高血糖素。
[0007] 本发明采用的技术方案为：一种膜高血糖素检测试剂盒，包括：1)包被有膜高血 糖素抗体的固相载体；2)辣根过氧化物酶标记的膜高血糖素检测抗体；3)酶标抗体稀释 液；4)膜高血糖素校准品；5)洗涂液；6)酶底物溶液；
[0008] 所述膜高血糖素抗体为能够特异性地识别人膜高血糖素N末端的单克隆抗体，所 述膜高血糖素检测抗体为能够特异性地识别人膜高血糖素C末端的单克隆抗体。
[0009] 在上述技术方案中，本发明膜高血糖素检测试剂盒用于检测膜高血糖素的原理 为：向试剂盒中的固相载体加入待测样品、辣根过氧化物酶标记的膜高血糖素检测抗体W 后，待测样品中的膜高血糖素通过其两个结合位点分别与膜高血糖素抗体和辣根过氧化物 酶标记的膜高血糖素检测抗体结合，加入酶底物后，酶底物被辣根过氧化物酶催化变为有 色产物，有色产物的量与待测样品中膜高血糖素的含量成正比，从而可通过酶联仪测定有 色产物的光密度，并结合根据膜高血糖素校准品制得的标准曲线，即可得出待测样品中膜 高血糖素含量。
[0010] 在上述技术方案中，本发明的检测试剂盒使用的包被抗体（即膜高血糖素抗体） 具有高的亲和力及高特异性，酶标抗体（即辣根过氧化物酶标记的膜高血糖素检测抗体） 纯度高，能够有效抑制测定血清及邸TA血浆中的膜高血糖素时的非特异性反应，使得本发 明的试剂盒能够准确地测定人膜高血糖素。所述酶标抗体稀释液即辣根过氧化物酶标记的 膜高血糖素检测抗体稀释液。
[0011] 作为对上述技术方案的进一步改进，所述包被有膜高血糖素抗体的固相载体的制 备方法为：
[0012] 1)将膜高血糖素抗体溶于巧樣酸憐酸盐中，制得包被液；
[001引。将包被液加入固相载体的孔中，于37°C下溫浴至包被液完全干燥，冲洗固相抗 体；
[0014]如向每孔中加入PBS-1%BSA缓冲液封闭，37°C解育化，冲洗后于室溫下干燥，即 得包被有膜高血糖素抗体的固相载体。
[0015] 在上述技术方案中，所述固相载体采用全封闭方式进行封闭，减少后续步骤中非 特异性蛋白的干扰，提高了检测精确度。
[0016] 作为对上述技术方案的更进一步改进，所述包被有膜高血糖素抗体的固相载体的 制备方法为：
[0017] (1)称取5mg包被抗体； 阳0化]似溶于2500血巧樣酸憐酸盐中，即为包被抗体浓度为2yg/血的包被液；
[0019] (3)设置包被机参数，每孔100y1;通过包被机分装包被液至96孔板，
[0020] 预热恒溫箱，溫度为37°C;
[0021] (4)将分装完毕的96孔板置于恒溫箱中溫浴过夜（1化），至包被液完全干燥； 阳02引 （5)用PBST冲洗5次已干燥的包被板，每次Imin;PSBT为0.Olmol/LPBS-0. 05% 吐溫20; 阳02引 （6)每孔加入350y1PBSB缓冲液进行板的封闭，37°C解育2h，用洗涂液洗涂3次， 置于室溫下待其自然干燥，用侣锥袋密封保存于4°C条件下；PBSB为PBS-1%BSA。
[0024] 作为对上述技术方案的进一步改进，所述膜高血糖素抗体在固相载体中的包被浓 度为2yg/mL。选择此包被浓度时，可满足孔里的抗体高于检测样本中的抗原量，同时不造 成过多的抗体浪费。
[0025] 作为对上述技术方案的进一步改进，所述辣根过氧化物酶标记的膜高血糖素检测 抗体的制备方法为：
[0026] 1)向辣根过氧化物酶的水溶液中加入化1〇4溶液，4°C静置30min，然后加入乙二 醇水溶液，静置30min ;
[0027] 2)加入膜高血糖素检测抗体水溶液，混匀装入透析袋，置于碳酸盐缓冲液中透析， 4°C过夜； 阳02引扣加入化肌4溶液，再置4°C，2小时，其后揽拌加入饱和硫酸锭，置4°C，1小时；
[0029] 4) 300化pm离屯、半小时，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸锭清洗，最后沉淀物溶于 ros中；
[0030] 5)将上述溶液装入透析袋中，用PBS缓冲盐水透析，去除锭离子后，10000巧m离屯、 30分钟去除沉淀，上清液即为酶标抗体，稀释至规定浓度。
[0031] 作为对上述技术方案的更进一步改进，所述辣根过氧化物酶标记的膜高血糖素检 测抗体的制备方法为：
[0032] (1)称取5mg辣根过氧化物酶溶解于1ml纯水中； 阳〇3引 似于上液中加入1ml新配的0. 08M化104溶液，混匀，4°C静置30min;
[0034]做加入0.16M乙二醇水溶液0.5ml，混匀，静置30min;
[0035] (4)加入含5mg膜高血糖素检测抗体的水溶液1ml，混匀装入透析袋，置于0.01M pH9. 5碳酸盐缓冲液透析，4°C过夜；
[0036]妨加0. 2ml新配的5mg/mlNaBH4液，混匀，再置4°C，2小时；
[0037](6)在揽拌下逐滴加入等体积饱和硫酸锭，置4°C，1小时；
[0038] (7) 300化pm离屯、半小时，弃上清；沉淀物用半饱和硫酸锭洗二次，最后沉淀物溶 于少量0. 15MpH7. 4的PBS中；
[0039] (8)将上述溶液装入透析袋中，用0. 15MpH7. 4的PBS缓冲盐水透析，去除锭离 子后（用奈氏试剂检测），1000化pm离屯、30分钟去除沉淀，上清液即为酶标抗体，用抑 7. 4PBS-1 %BSA稀释至规定浓度。
[0040] 作为对上述技术方案的进一步改进，所述辣根过氧化物酶标记的膜高血糖素检测 抗体的浓度为11yg/mU使用时的稀释倍数为11倍。
[0041] 作为对上述技术方案的进一步改进，所述酶标抗体稀释液为PBS-1 %BSA。 ?85-1%654为含1%牛血清白蛋白的0.01111〇1/1、抑7.4憐酸盐缓冲液，文中设及的 PBS-1%BSA均为此憐酸盐缓冲液。
[0042] 作为对上述技术方案的进一步改进，所述固相载体为酶标板；所述酶标板孔底透 明度高，空白值低，各板之间、同一板各孔之间性能相化可提高检测精确度。
[0043] 作为对上述技术方案的进一步改进，所述洗涂液为0.01111〇1/1?85-0.05%吐溫 20。0.Olmol/LPBS-0. 05%吐溫 20 为含 0. 05%吐溫 20 的 0.Olmol/L、抑7. 4 憐酸盐缓冲液， 文中设及的0.Olmol/LPBS-0. 05%吐溫20均为此憐酸盐缓冲液。
[0044] 作为对上述技术方案的进一步改进，所述酶底物溶液为TMB。
[0045] 作为对上述技术方案的进一步改进，所述膜高血糖素检测试剂盒还包括终止液， 终止液为0. 5mol/L的硫酸。
[0046] 本发明的目的之二是提供一种膜高血糖素检测试剂盒的检测方法，该检测方法操 作简单、方便，可重复性强，可灵敏、快速、准确地测定血液和血浆中的膜高血糖素。
[0047] 本发明采用的技术方案为：一种所述膜高血糖素检测试剂盒的检测方法，包括W 下步骤：
[0048]1)取膜高血糖素检测试剂盒，将其在室溫下平衡后，取出所需包被有膜高血糖素 抗体的固相载体； W例。在固相载体上预设校准孔和待测样品孔，分别向校准孔、待测样品孔中加入校 准品、待测样品；
[0050] 3)分别向校准孔和待测样品孔中加辣根过氧化物酶标记的膜高血糖素检测抗体， 于转速800~1000巧m、溫度25~29°C下解育0. 8~3h，溫育后，弃去孔内液体，洗板并干 燥；
[0051] 4)向每孔中加入酶底物溶液，于溫度25~29°C下避光10~20min，显色； 阳化引W向每孔中加入终止溶液，8~15min后于450nm波长下检测各孔的0D值，W校 准品的浓度为横坐标，校准品对应的0D值为纵坐标，绘出校准曲线，将待测样品的0D值代 入校准曲线回归方程式，计算出待测样品对应的膜高血糖素浓度。
[0053] 对于现有的试剂盒，由于低溫下试剂盒更稳定，相关的抗体和酶在低溫下变性会 变慢，解育溫度通常在2~8°C，考虑到低溫条件下反应的不充分，所W解育的时间必须加 长，通常是过夜解育。而本发明的膜高血糖素检测试剂盒的检测方法中，解育溫度为室溫 (25~29°C)，解育时间为0. 8~化，相较于现有的试剂盒，本发明的试剂盒在保证准确度 和精确度的同时，对溫度要求更低，解育时间更短，不仅降低了检测成本，还节约了大量解 育时间，提高了检测效率。
[0054] 作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤3)中，解育时间为比。试验表明，解 育时间为Ih时，膜高血糖素的检测准确度更高。 阳化5] 相对于现有技术，本发明的有益效果为： 阳056] 1、本发明的膜高血糖