编码分泌介导效应细胞杀伤靶细胞的双特异分子的框架及病毒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种编码分泌介导效应细胞杀伤靶细胞的双特异分子的框架及病毒。
【背景技术】
[0002] 肿瘤（tumor，neoplasm)是指细胞在致瘤因素作用下，基因发生了改变，失去对其 生长的正常调控，导致异常增生，可分为良性肿瘤和恶性肿瘤两大类。良性肿瘤生长缓慢， 与周围组织界限清楚，不发生转移，对人体健康危害不大。恶性肿瘤生长迅速，可转移到身 体其它部位，使机体功能失调，威胁生命。
[0003] 恶性肿瘤也叫癌症（cancer)，是目前危害人类健康最严重的一类疾病。在美国，恶 性肿瘤的死亡率仅次于心血管疾病而居第二位。据我国2000年卫生事业发展情况统计公 报，城市地区居民死因第一位为恶性肿瘤，其次为脑血管病、心脏病。最为常见和危害性严 重的肿瘤为肺癌、鼻咽癌、食管癌、胃癌、大肠癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、白血病及淋巴瘤等。
[0004] 双特异性重组蛋白是含有两种特异性抗原结合位点的人工蛋白，能在靶细胞和功 能分子（细胞）之间架起桥梁，激发具有导向性的免疫反应，其中利用抗体序列作为导向的 双特异性抗体是基因工程抗体的一种，现已成为抗体工程领域的热点，在肿瘤的免疫治疗 中具有广阔的应用前景。
[0005] 双特异性重组蛋白中比较有效的是介导效应T细胞和杀伤细胞(如NK细胞）的 双特异性重组蛋白。此类双特异性重组蛋白的一端靶向肿瘤细胞上面的肿瘤相关抗原或 MHC-多肽复合物，另一端靶向杀伤细胞的表面分子(如⑶3,⑶16,⑶56等)，可以克服MHC限 制性，更大程度的发挥CTL等杀伤细胞的功能。双特异性重组蛋白多为哺乳动物细胞表达 体系，融合蛋白的表达和纯化都相对复杂，制备成本较高。采用双特异性重组蛋白治疗肿瘤 的局限性在于其半衰期比较短，尤其是对一些小分子蛋白而言，只有几个小时的半衰期。抗 体工程的发展促使许多新的不同形式的双特异性重组蛋白的产生，虽然大部分滞留在临床 前阶段，但是仍然有许多分子进入临床研究阶段并展示出良好的治疗效果。双特异性重组 蛋白中，比较引人注目的有triomab和BiTE形式，尤其是catumaxomab在欧洲的批准后，双 特异性重组蛋白更成为研究的热点。除了抗体形式之外，还有许多其他可以特异结合细胞 表面受体的蛋白质也可以作为重组蛋白的功能区。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种编码分泌介导效应细胞杀伤靶细胞的双特异分子的框 架及病毒。
[0007] 本发明提供了一种表达双特异性重组蛋白的重组病毒；所述双特异性重组蛋白包 括功能区甲和功能区乙；所述功能区甲特异结合肿瘤细胞表面的肿瘤相关抗原或HLA多肽 复合物；所述功能区乙特异结合T细胞的表面标志物或NK细胞的表面标志物。
[0008] 所述重组病毒具体可为重组腺病毒、重组疱疹病毒或反转录病毒。
[0009] 所述功能区甲包括但不限于特异结合肿瘤细胞表面的肿瘤相关抗原的单区抗体、 单链抗体、Fc片段或受体。所述肿瘤相关抗原具体可为HER2抗原。所述功能区甲具体可 如序列表的序列2第246-483位氨基酸残基所示或序列表的序列4第1-242位氨基酸残基 所示。
[0010] 所述功能区甲包括但不限于特异结合肿瘤细胞表面的HLA多肽复合物的单区抗 体、单链抗体、Fc片段或受体。所述HLA多肽复合物可为HLA-A2多肽复合物，具体可为 HLA-A2/MDQVPFSV 多肽复合物(又称 HLA-A2-MART1 多肽复合物）或 HLA-A2/ELAGIGILTY 多肽复合物(又称HLA-A2-gpl00多肽复合物)。所述功能区甲具体可如序列表的序列6第 1-117位氨基酸残基所示或序列表的序列8第1-125位氨基酸残基所示。
[0011] 所述功能区乙可特异结合T细胞的表面标志物⑶3、NK细胞的表面标志物⑶16或 NK细胞的表面标志物⑶56。
[0012] 所述功能区乙包括但不限于单区抗体、单链抗体、Fc片段或受体。
[0013] 所述功能区乙具体可如序列表的序列2第1-243位氨基酸残基所示、序列表的序 列4第260-502位氨基酸残基所示、序列表的序列6第137-379位氨基酸残基所示或序列 表的序列8第145-387位氨基酸残基所示。
[0014] 所述重组病毒中，所述双特异性重组蛋白优选在肿瘤特异性启动子的作用下启动 表达。所述肿瘤特异性启动子具体可如序列表的序列9所示。
[0015] 所述双特异性重组蛋白中还可包括检测标签，如myc标签和/或His标签等。
[0016] 所述双特异性重组蛋白具体可为序列表的序列2所示的Fcab-anti-⑶3蛋白、序 列表的序列4所示的HER2-anti-⑶3蛋白、序列表的序列6所示的Martl-anti-CD3蛋白或 序列表的序列8所示的GPA-anti-⑶3蛋白。
[0017] 所述重组病毒具体可为将重组质粒和质粒pBHGlox (delta)El，3Cre导入293A细 胞并培养细胞得到的重组病毒；所述重组质粒为含有所述双特异性重组蛋白的编码基因的 重组表达载体。所述重组质粒具体可为将序列表的序列1所示DNA分子、序列表的序列3 所不的DNA分子、序列表的序列5所不的DNA分子或序列表的序列7所不的DNA分子插入 质粒TOC316的多克隆位点（如EcoR I和Sal I酶切位点之间）得到的重组质粒。
[0018] 本发明还保护以上任一所述的重组病毒在制备药物中的应用；所述药物的功能为 如下（a)或（b): (a)治疗肿瘤；（b)促进T细胞或NK细胞杀伤肿瘤细胞。所述肿瘤具体可 为肺癌，更具可为肺腺癌。所述肿瘤细胞可为肺癌细胞，更具体可为肺腺癌细胞，更具体可 为A549细胞或A549-luc细胞。
[0019] 本发明还保护一种药物，其活性成分为以上任一所述的重组病毒；所述药物的功 能为如下（a)或（b): (a)治疗肿瘤；（b)促进T细胞或NK细胞杀伤肿瘤细胞。所述肿瘤具 体可为肺癌，更具可为肺腺癌。所述肿瘤细胞可为肺癌细胞，更具体可为肺腺癌细胞，更具 体可为A549细胞或A549-luc细胞。
[0020] 采用腺病毒作为载体的优势如下：（1)借助腺病毒载体表达的融合蛋白的翻译后 修饰同人体的天然蛋白是一致的，可以降低融合蛋白的免疫原性；（2)能感染大多数哺乳 动物细胞，包括分裂和不分裂的；（3)有较大的容量(约8kb); (4)有较高的重组蛋白表达水 平，滴度高；（5)不整合；（6)毒性较小。
[0021] 本发明提供的重组腺病毒侵染肿瘤细胞之后，肿瘤细胞就变成了融合蛋白（双特 异性重组蛋白）表达的工厂，与直接给予融合蛋白相比可以减少治疗次数(仅一次注射腺病 毒即可维持至少两周的融合蛋白表达时间)，通过原位注射的方式将腺病毒导入肿瘤，表达 的融合蛋白可以立即与肿瘤细胞结合，无需经过体内代谢，相比直接注射融合蛋白而言，效 率更_，一旦肿瘤周围有效应细胞的存在可以立即进行杀伤。
[0022] 本发明将双特异性重组蛋白介导的高效杀瘤作用以及腺病毒载体非整合性持续 表达融合蛋白的特点相结合，利用复制缺陷型腺病毒载体将双特异性重组蛋白的编码基因 导入肿瘤细胞，从而使肿瘤细胞持续的表达融合蛋白，高效的介导杀伤细胞有效杀伤肿瘤 细胞。本发明对于肿瘤治疗具有重大价值。
【附图说明】
[0023] 图1为质粒H)C316的结构示意图。
[0024] 图2为实施例1的步骤一的4中，37°C培养7天左右的细胞病变照片。
[0025] 图3为实施例1的步骤五中重组病毒的鉴定结果。
[0026] 图4为实施例1的步骤五中排除野生型腺病毒的鉴定结果。
[0027] 图5为实施例1的步骤六中Western blot的结果。
[0028] 图6为实施例1的步骤七中杀伤实验的结果。
【具体实施方式】
[0029] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。
[0030] ADmax腺病毒包装系统购自加拿大Microbix公司，含有质