猪流行性腹泻病毒分离技术的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及畜用生物制品领域，特别涉及猪流行性腹泻病毒分离技术。
【背景技术】
[0002] 猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒引起的猪的一种急性肠道传染病，以水泻、 呕吐和脱水为特征。俗称冬季拉稀病。其病原属于冠状病毒科冠状毒病属。
[0003] 猪流行性腹泻病毒可在猪群中持续存在，各种年龄的猪都易感。哺乳仔猪、架子猪 和育肥猪的发病率可达100 %，尤其以哺乳仔猪严重。本病主要在冬季多发，夏季也可发生。 中国从12月份至次年2月份为本病的高发期。常常是有一头猪发病后，同圈或邻圈的猪在 1周内相继发病，病毒多经发病猪的粪便排出，运输车辆、饲养员的鞋子或其他带病毒的动 物，都可作为传播媒介，造成较高的死亡率和损失。而现有的方法得到的病毒滴度低，限制 高滴度的猪流行性腹泻病毒灭活疫苗的研制。
[0004] 现有技术常使用生长良好的Vero细胞，依次进行连续传三代，将第三代的细胞收 获冻存，留3瓶T-25方瓶细胞进行后面的实验。将续传后的3瓶T-25方瓶细胞用20 μ g/ ml胰蛋白酶的无血清DMEM洗3遍，IOmin/遍。将含20 μ g/ml胰蛋白酶的PEDV滤液2ml， 37°C条件下静置I. 5h以后注入3瓶T-25方瓶细胞中，每瓶2ml，37°C条件下静置I. Oh。弃 掉T-25方瓶中液体，然后加入20 μ g/ml胰蛋白酶的DMEM维持液，37°C静置培养96h，收集 猪流行性腹泻病毒液，并对病毒进行稀释。细胞病变效应（CPE)和半数组织培养感染剂量 (TCID 5tl)数据记录结果如表1所示。
[0005] 表I CPE和TCID5tl数据记录结果
[0006]
[0007]
【主权项】
1. 猪流行性腹泻病毒分离技术，其特征在于，包括以下步骤： 用支原体去除剂将Vero细胞的支原体去除，进行细胞培养；对培养后的细胞注入胰蛋 白酶的猪流行性腹泻病毒滤液，静置培养，收集猪流行性腹泻病毒液。
2. 根据权利要求1所述的分离技术，其特征在于，所述细胞培养包括： 将所述去除支原体的Vero细胞连续传2-4代，使用牛胰蛋白酶的无血清DMEM维持液 将经过续传2-4代的所述Vero细胞洗2-4遍。
3. 根据权利要求2所述的分离技术，其特征在于，所述去除支原体的Vero细胞连续传 3代。
4. 根据权利要求2所述的分离技术，其特征在于，将经过续传2-4代的所述Vero细胞 洗3遍。
5. 根据权利要求2所述的分离技术，其特征在于，所述牛胰蛋白酶的无血清DMEM维持 液为 50 μ g/ml。
6. 根据权利要求2所述的分离技术，其特征在于，所述对培养后的细胞注入胰蛋白酶 的猪流行性腹泻病毒滤液的步骤包括： 将牛胰蛋白酶的猪流行性腹泻病毒滤液注入洗过的所述第2-4代细胞，37°C条件下静 置，弃掉液体，加入牛胰蛋白酶的DMEM维持液，37°C静置培养，收集猪流行性腹泻病毒液。
7. 根据权利要求6所述的分离技术，其特征在于，所述牛胰蛋白酶的猪流行性腹泻病 毒滤液使用前在37°C条件下，静置I. 5h。
8. 根据权利要求1所述的分离技术，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒分离技术还 包括以下步骤：将所述猪流行性腹泻病毒液在-20°C条件下冻融1-3次；冻融后将所述猪流 行性腹泻病毒进行盲传处理。
9. 根据权利要求8所述的分离技术，其特征在于，所述冻融次数为一次。
10. 根据权利要求1所述的分离技术，其特征在于，所述Vero细胞为非洲绿猴肾细胞。
【专利摘要】本发明提供猪流行性腹泻病毒分离技术。本发明包括以下步骤：用支原体去除剂将Vero细胞的支原体去除，进行细胞培养；对培养后的细胞注入胰蛋白酶的猪流行性腹泻病毒滤液，静置培养，收集猪流行性腹泻病毒液。本发明猪流行性腹泻病毒滤液与去除支原体以后的Vero细胞相互作用，在胰蛋白酶的作用下，产生明显细胞病变效应的时间稳定，没有支原体对细胞的干扰，从而使得收获猪流行性腹泻病毒时，病毒滴度高。由以前的103.64半数组织培养感染剂量升高到105.38TCID50，提高了近2个滴度；细胞产生病变的时间推后，由以前的24-48h推迟到72h。CCTCC NO:V20142920141023
【IPC分类】C12R1-93, C12N7-00
【公开号】CN104560889
【申请号】CN201410673855
【发明人】李明义, 张玉杰, 刘阳, 李晓林, 张伦, 冯晶晶, 李佳棋, 单学强, 王相芹, 朱浩, 葛栋, 罗济冠, 李世鑫, 李朝阳
【申请人】山东信得科技股份有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年11月21日